全 文 ：　第 26 卷 第 1 期
2005 年 1月
武汉大学学报(医学版)
Medical Journal of Wuhan Univ ersity
Vol.26 No.1
Jan , 2005
课题来源:国家自然科学基金资助(39800193)
作者简介:赵玲敏 ,女 , 1976～ ,医学硕士生 ,主要从事临床病毒学研究
通讯作者:杨占秋 ,男 , 1952～ ,研究员 ,博士生导师,主要从事医学病毒学研究
菘蓝的 4种单体成分抗柯萨奇病毒作用的研究
赵玲敏1　杨占秋1　钟　琼2　王　薇2
方建国3　汤　杰3　丁晓华1　肖　红1
1武汉大学医学院病毒学研究所　2 病毒学教育部重点实验室　武汉　430071
3华中科技大学同济医学院同济医院药剂科　武汉　430030
摘要　目的:了解菘蓝 4 种有效单体(6 , 7 , 8 , 9 号)抗柯萨奇病毒 B组 3 型(CVB3)的活性。方法:通过观察细
胞病变效应(CPE),噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性 ,用半定量 RT-PCR检测不同药物浓度下病毒核酸含量 , 以
确定有效单体抗 CVB3的作用。结果:菘蓝的 4 种单体成分对 CVB3生物合成均有抑制作用 , 且强于阳性对照药物
病毒唑。表现在随着药物浓度的增加 , CPE 程度逐渐减弱 , 病毒核酸的含量逐渐下降。结论:菘蓝的 4 种单体能在
体外通过抑制生物合成发挥抗 CVB3作用。
关键词　菘蓝;单体成分;柯萨奇病毒 B 组 3 型
中图分类号　R373.9　文献标识码　A　文章编号　1671-8852(2005)01-0053-05
Antiviral Activity of the Four Monomers of Isatis Tinctoria L
Against Coxsackievirus B3 in vitro
Zhao Lingmin , Yang Zhanqiu , Zhong Qiong , et al
Inst itute of Virology , School of Medicine , Wuhan Universi ty , Wuhan 430071 , China
Abstract
Objective:To investigate the antiviral activity of the four monomers of Isat is tinctoria L (the
six th , seventh , eighth , and ninth)on Coxsackievirus B3(CVB3)in vi tro.Methods:Anti-CVB3 ef-
fects were investigated by observing cy topathic ef fect(CPE), by using M TT colorimetric assay for vi-
able cell rate , and by detecting CVB3-RNA using semi-quantitative RT-PCR.Results:The four
monomers of Isat is tinctoria L were more effective than the ribavirin in anti-biological synthesis of
Isat is tinctoria L .As the dose of the drug s and the degree of CPE increased , the quantity of CVB3-
RNA in culture media decreased and the viral inhibition rate increased.Conclusion:The four
monomers of Isatis tinctoria L may inhibit CVB3 biological synthesis but not inactivate the virus di-
rectly or block the adsorpt ion to suscept ible cells in v itro.Anti-CVB3 effect of the four monomers was
from best to wo rst as:the ninth monomer , the eighth monomer , the six th monomer , and the seventh
monomer.
Key Words　Monomers;Isatis t inctoria L ;Coxsackievirus B3
　　柯萨奇病毒 B组(CVB)可引起多种疾病 ,人群
感染后可呈隐型感染 、急性感染或急性暴发性感染
而猝死。可引起流行性胸痛 、无菌性脑炎 、脑膜脑炎
和心包炎 ,还有资料表明其与克山病有密切的关系.
DOI :10.14188/j.1671-8852.2005.01.017
尤其柯萨奇病毒 B 组 3型(CVB3)引起心肌炎及扩
张性心肌病 ,给人类的健康造成极大的威胁 。CVB3
是已被证实为病毒性心肌炎主要病原体 ,所致的病
毒性心肌炎在 3 个月内的新生儿感染率为 360/10
万 ,病死率为 8%。据统计 ,全世界每年心肌炎患病
率为 5 ～ 8/10万 ,25%～ 50%急性心包炎患者 ,36%
～ 65%急性心肌炎患者有或复发的 CVB3感染 。病
毒性心肌炎的治疗尚无特效方法 ,中草药在治疗病
毒性心肌炎疾病中已取得一定疗效 ,临床上虽有几
种化学药物及中药用于治疗 ,但效果均不理想 ,不是
毒性太大就是疗效不显著 ,研制及开发抗 CVB3的新
药显得尤为重要[ 1 ,2] 。
菘蓝有清热解毒凉血之功效[ 3] ,在本室对菘蓝
的十几种有效成份的研究的基础上 ,我们筛选了菘
蓝的 4种有效成分 ,对抗 CVB3作用进行了初步研
究 ,现将实验结果报道如下。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　细胞　人咽癌上皮细胞(HEp-2细胞)为本
所保存。细胞培养基为 DMEM(HyClone 公司),常
规加入青 、链霉素 ,小牛血清(三利生物制品厂)配成
10%的生长液和 2%的维持液。
1.1.2　病毒　CVB3Nancy 株为本所保存 ,在 HEp-2
细胞增殖 ,实验用 100TCID50·(0.1 ml)-1 。
1.1.3　药物　从菘蓝抽提的 4种单体为不溶于水
的白色结晶(提取的方法另文报道),二甲基亚砜溶
解后用 DMEM 配置成不同浓度的溶液 ,使用前经
0.08 MPa , 15 min消毒灭菌 。病毒唑系天津药业有
限公司产品 ,批号为 0103071。
1.1.4　主要试剂 　二甲基亚砜(DMSO)为凌飞科
技提供 , MLV ,dNTP 为 Promega 产品 , TagDNA 聚
合酶为 Biostar公司产品 , PCRM arker 为华美公司产
品。
1.1.5　引物及合成　参照封启明等人[ 4]的方法设
计 CVB 组特异性引物 。CX1:5′-CCCCGGACT-
GAGTATCAA TA-3′(180-199), CX2:5′-GCAGT-
TAGGATTAGCCGCAT-3′(479-460),β-actin上下游
引物分别为 5′-GGCGGGACCACCATGTACCCT-3′,
5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′,由上海博亚
生物技术有限公司合成。
1.2　方法
1.2.1　药物细胞毒性测定　在 96 孔板上 ,加 1×
105·(0.1 ml)-1的HEp-2细胞 ,培养 24 h ,细胞长成
单层 ,加入含药的维持液。37 ℃、5%CO2孵箱培养 ,
72 h后以 MTT 法检测细胞存活率 ,每一药物浓度
均重复 4孔 ,同时设正常细胞对照 。
1.2.2　药物对CVB3侵入细胞的阻断作用　用药物
预先处理细胞 ,用 PBS 洗涤后 CVB3每孔加入 50 μl
的 100TCID50·(0.1 ml)-1 ,吸附2 h ,加细胞维持液 ,
置于 37 ℃、5%CO2孵箱培养 ,每日观察细胞病变情
况 , 48 h后用 MTT 法检测病毒抑制率 。
1.2.3　药物对 CVB3直接灭活作用 　将药物与
100TCID50·(0.1 ml)-1的病毒等量混合 , 37 ℃作用
2 h ,再将其接种在长成单层的HEp-2细胞上 ,吸附2
h ,加细胞维持液 ,置于 37 ℃、5%CO2孵箱培养 ,每日
观察细胞病变情况 ,48 h 后用 MTT 法检测病毒抑
制率 。
1.2.4 　药物对 CVB3 增殖的抑制作用 　将
100TCID50·(0.1 ml)-1的病毒接种在长成单层的
HEp-2细胞上 ,吸附 2 h ,加入不同浓度的药物 ,每一
药物浓度均重复 4孔 ,同时设正常细胞对照和病毒
对照。每日观察细胞病变情况 ,当病毒对照达到
的细胞病变时 ,用 MTT 法检测病毒抑制率。
1.2.5　细胞存活率和病毒抑制率的测定　用 MTT
法检测。弃去上层的细胞维持液 ,每孔加入 5 mg·
ml-1的 MTT 30 μl ,孵育 4 ～ 6 h ,加二甲基亚砜每孔
150 μl ,振荡混匀后 ,在 570 nm 波长下测定吸光度 A
值。
细胞存活率=药物组平均A 值/细胞对照
病毒抑制率=[实验组(药物+病毒)-病毒对
照组平均 A值] /[细胞组平均 A 值-病毒对照组平
均 A值]
治疗指数(TI)=半数细胞存活率(TC50)/半数
细胞抑制率(IC50)。
1.2.6　半定量 RT-PCR检测不同药物浓度作用下
细胞中核酸的含量
(1)病毒核酸的提取及逆转录　参照申元英等
人[ 5]的方法用 NaI-异硫氰酸胍-氯仿法提取 CVB-
RNA。当病毒对照出现完全病变时提取 4种单体不
同浓度下病毒核酸 ,将其溶于无 RNA酶的水中 。用
紫外分光光度计在 260 nm 处对病毒核酸进行定量 ,
按 Yamamo to H 等人的方法[ 6] 每份样品取 1 μg·
μl-1后进行逆转录 , 42 ℃反应 45 min , 95 ℃ 5 min
终止反应 。
(2)PCR反应　取上述所得 cDNA10μl加入50
μl反应混合液中 ,包括 10×buffer 5μl , TagDNA 聚
54 武汉大学学报(医学版) 第 26 卷
合酶(200 U·ml-1)1 μl , CVB3组特异性上下游引物
(10 μmol·L-1)各 1 μl , β-actin上下游引物(10 μmol·
L-1)各 1μl ,dNTP (1 mmol·L-1)10μl ,无 RNA 酶的
水20 μl ,混匀 ,加入石蜡油 30μl。扩增参数为:94 ℃5
min预变性后 ,94 ℃变性45 s ,53 ℃退火 45 s ,72 ℃延
伸45 s ,循环 28次 ,最后 72 ℃延伸5 min。同时设细
胞对照 、阴性对照和阳性对照 。
(3)PCR反应产物半定量　PCR反应产物 5 μl
在1.5%琼脂糖(含 0.5 μg·ml-1EB)100V 电泳 30
min。用 SX-300 图像分析系统进行扫描 , 四星
Bioimage软件分析 ,计算 CVB和 β-actin吸收峰面积
的比值 ,比较各组间此比值的大小 。
1.2.7　统计学分析　用统计软件 SPSS 11.5 回归
Reg ression的Probit计算半数细胞存活率(TC50)、
半数细胞抑制率(IC50)。用统计软件 SPSS 11.5的
nonparametric的 Chi-Square 分析比较菘蓝的 4种单
体的对 HEp-2细胞的毒性及对 CVB3增殖的抑制作
用与对照药病毒唑 ,且它们之间也两两进行比较。
检验水准 P <0.05。
2　结果
2.1　菘蓝的 4种单体对 HEp-2细胞的毒性作用　6
号和 7号单体对细胞的毒性作用表现为细胞变小 ,
胞内颗粒增多 ,折光性差 ,8号和 9号表现为细胞肿
胀变圆 ,折光性差 ,胞内颗粒增多 。4种单体对 HEp-
2细胞的毒性作用不同 ,6号单体的药毒性较大 ,而9
号单体的药毒性较小。菘蓝的 4 种单体成份对
HEp-2细胞的毒性作用如表 1所示 。
表 1　菘蓝的 4 种单体成份对 HEp-2 细胞的毒性作用
组别 不同药物浓度(μg·ml
-1)下细胞存活率(%)
2.5 5 10 20 30 40 50
半数毒性
浓度(TC50)
药物浓度(μg·ml-1)
95%可信区间
6号 93.7 79.7 75.6 45.5 36.0 23.8 13.2 23.76 1.08～ 74.66
7号 92.4 74.3 48.6 31.5 34.7 21.6 11.4 21.35 1.44～ 76.38
8号 98.9 97.8 96.1 92.4 84.6 71.3 56.5 54.52 8.76～ 140.49
9号 91.8 92.5 94.3 95.7 96.8 92.8 90.3 189.33 11.65～ 397.77
病毒唑(对照) 91.8 91.5 91.1 91.0 90.9 90.2 87.5 537.50 16.85～ 1 440.11
　　　　用统计软件 SPSS 11.5的 nonparamet ric的 Chi-Square分析 ,菘蓝的 4种单体对HEp-2细胞不同药物浓度(μg·ml-1)下细胞
存活率(%)的毒性作用都大于阳性对照药病毒唑(P<0.05);它们之间两两进行比较 , 9号单体的药毒性最小 ,其次是 8号单体 , 6号
和 7号单体的药毒性相同
2.2　菘蓝的 4种单体对 CVB3感染的预防作用　用
使细胞存活率达到 80%浓度的 4种单体预先处理细
胞 4 h , 用 PBS 洗涤后 CVB3每孔加入 50 μl 的
100TCID50·(0.1 ml)-1 ,吸附 2 h ,加细胞维持液 ,置
于37 ℃、5%CO2孵箱培养 ,每日观察细胞病变情况 ,
细胞均出现颗粒增多 、变小变圆 、坏死脱落等典型的
CPE表现 , MTT 显示病毒抑制率与病毒对照组一
致 ,结果表明菘蓝的 4种单体对 CVB3感染均无预防
作用 。
2.3　菘蓝的 4种单体对 CVB3直接灭活作用　用使
细胞存活率达到 80%浓度的 4种单体与 100TCID50
·(0.1 ml)-1的病毒等量混合 , 37 ℃作用 2 h , ,再将
其接种在长成单层的 Hep-2细胞上 ,吸附 2 h ,每日
观察细胞病变情况 , 细胞均出现颗粒增多 ,变小变
圆 ,坏死脱落等典型的 CPE 表现 ,MTT 显示病毒抑
制率与病毒对照组一致 ,结果表明菘蓝的 4 种单体
对CVB3无直接灭活作用 。
2.4　菘蓝的 4种单体对 CVB3增殖的抑制作用　实
验结果表明 ,菘蓝的 4种单体对 CVB3的增殖均有抑
制作用 ,表现在随着药物浓度的增加 ,细胞变小变
圆 、颗粒增加 、破碎脱落等典型的 CPE表现减弱 ,病
毒抑制率增加 ,并表现出量效关系 。菘蓝的 4种单
体对 CVB3的抑制作用如表 2所示。
2.5　菘蓝的 4种单体不同药物浓度 CVB3核酸的提
取及半定量分析　利用 RT-PCR技术设定的两对引
物 ,在上述选定的实验条件下 ,分别得到 CVB3(280
bp)和 β-actin(220 bp)的扩增产物。实验中均有 β-
actin的表达 ,用 SX-300图像分析系统进行扫描 ,四
星 Bioimage软件分析 ,计算 CVB3和 β-actin 吸收峰
面积的比值 ,计算各组间比值的大小 。图 1为半定
量 RT-PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图 。
菘蓝的 4种单体不同药物浓度下扩增的 CVB3
目的基因与 β-actin吸收峰面积的比值呈现出量效关
系。表现为随着药物浓度的增大 ,比值越来越小 ,表
明随着药物浓度的增大 ,病毒的增殖减弱。菘蓝的4
种单体不同药物浓度下扩增的 CVB3目的基因与 β-
actin吸收峰面积的比值如表 3所示。
55　第 1 期 赵玲敏 ,等.菘蓝的 4 种单体成分抗柯萨奇病毒作用的研究
表 2　菘蓝的 4 种单体对 CVB3的抑制作用
组别 药物浓度(μg·m l
-1)
0.375 0.625 1.25 2.5 5 10 20 40
半数抑制
浓度(IC50) 治疗指数(TC50/ IC50)
6号 细胞病变效应 + 8.46 2.81
病毒抑制率(%) 20.30 22.60 33.70 44.40 54.90 63.70 78.70 88.90
7号 细胞病变效应 + 11.90 41.78
病毒抑制率(%) 7.56 19.70 34.60 50.30 55.40 60.80 70.70 75.40
8号 细胞病变效应 + + 9.51 5.73
病毒抑制率(%) 15.60 18.40 19.70 42.60 50.30 60.50 80.80 93.70
9号 细胞病变效应 + + + 14.19 13.34
病毒抑制率(%) 24.80 27.30 30.90 32.40 41.60 50.70 60.90 80.20
病毒唑(对照) 细胞病变效应 104.84 5.12
病毒抑制学(%) 5.64 7.84 8.94 11.33 25.70 28.60 32.10 35.80
　　　　用统计软件 SPSS 11.5的 nonparamet ric的 Chi-Square分析 ,菘蓝的 4种单体对CVB3增殖的抑制效果都优于阳性对照药病毒唑
(P<0.05),菘蓝的 4种单体间对CVB3增殖的抑制作用无差别(P>0.05)
图 1　半定量 RT-PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图
左图:1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8泳道 9号单体浓度分别为 40 , 20 , 10 ,
5 , 2.5 , 1.2 , 0.6 , 0.3μg·ml-1作用下扩增的 CVB3目的基因与
β-actin;9 , 10 , 11分别为细胞对照 、阴性对照 、阳性对照
　　
右图:1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 泳道为病毒唑浓度分别为 40 , 20 , 10 ,
5, 2.5 , 1.2 , 0.6 , 0.3μg·ml-1作用下扩增的 CVB3目的基因与
β-actin;9 , 10 , 11分别为细胞对照 、阴性对照 、阳性对照
表 3　菘蓝的 4种单体对 CVB3核酸合成的影响
组别 不同药物浓度(μg·ml
-1)下的吸收峰面积的比值
0.3 0.6 1.2 2.5 5.0 10.0 20.0 40.0
6号 2.57 2.55 1.50 1.42 1.13 1.06 1.03 1.00
7号 3.01 2.75 2.19 2.16 2.12 1.41 1.26 1.22
8号 2.67 2.31 1.94 1.29 1.25 1.06 1.02 1.00
9号 2.43 1.97 1.32 1.13 1.11 1.06 1.06 1.05
3　讨论
菘蓝(Isatis t inctoria L)为十字花科植物 ,其根
和叶均可入药 ,干燥根入药称板蓝根 ,干燥叶入药称
为大青叶 , 板蓝根和大青叶的药性基本相同 , 有泄
火 、解毒 、凉血等功效 ,主要分布在华东各省以及河
南 、山西等地[ 3] 。临床病例研究证明菘蓝可治疗流
行性腮腺炎 、病毒性肠炎 、尖锐湿疣 、乙型肝炎 、甲型
流感病毒 、扁平疣等病毒性疾病。还有报道菘蓝有
调节免疫细胞分泌 IL-2 , TNF-α,及提高细胞免疫功
能的作用 ,还有抗活性氧 、抗炎及抗菌作用[ 6] 。为了
寻找有效治疗 CVB3引起的疾病 ,我们通过体外细胞
实验对菘蓝的 4种有效成份抗 CVB3进行了研究。
研究结果表明 ,菘蓝的 4种单体对 HEp-2细胞
的毒性作用不同 ,且对 HEp-2细胞的毒性作用都大
于阳性对照药病毒唑(P <0.05)。9号单体的药毒
性最小 ,其次是 8号单体 ,6号和 7号单体的药毒性
相同 。菘蓝的 4种单体对 CVB3感染均无预防作用 ,
亦无直接灭活作用。菘蓝的 4种单体对 CVB3增殖
均有抑制作用 ,随着药物浓度的增加 ,病毒抑制率增
加 ,并表现出量效关系。菘蓝的 4种单体对 CVB3增
殖的抑制作用均大于阳性对照药病毒唑(P <0.
05),菘蓝的 4种单体间对 CVB3增殖的抑制作用无
差别(P>0.05)。
在上述实验结果的基础上 ,得出菘蓝的 4种单
体对 CVB3增殖的抑制均有抑制作用 ,菘蓝对病毒性
疾病的治疗作用可能是菘蓝中所含的嘌呤 、嘧啶及
吲哚成份通过干扰病毒核酸的合成 ,以及通过提高
机体的免疫力而发挥作用[ 7] 。我们提取菘蓝的 4种
单体不同药物浓度下处理的病毒感染细胞的 CVB3
核酸 ,设定两对引物利用 RT-PCR技术对其半定量
分析 。与 Yamamo to H 等[ 8]认为 CVB3和 β-actin的
扩增动力学相似 ,当循环数小于 30次时 , CVB-RNA
的含量与扩增循环数有很好的线形关系 ,故选定 28
56 武汉大学学报(医学版) 第 26 卷
作为循环的次数。在上述选定的实验条件下 ,分别
得到 CVB(280 bp)和 β-actin(220 bp)的扩增产物。
计算 CVB3和 β-actin 吸收峰面积的比值 ,计算各组
间比值的大小。表现为随着药物浓度的增大 ,比值
越来越小 。我们更进一步证实了菘蓝的 4种单体对
CVB3增殖的均有抑制作用 ,且可以认为是通过抑制
病毒核酸的复制而抑制病毒的增殖 。
以上实验是研究菘蓝的 4种单体抗 CVB3的作
用 ,由于菘蓝的 4种单体细胞药毒性较大 ,还需要进
一步改进工艺 ,降低毒性 ,单体成分还需通过化学分
析进一步明确其分子结构 ,其抗 CVB3的作用还需要
在动物体内实验上进一步证实 。
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(2004-06-24 收稿)
编辑　沈建国
(上接第 49页)
已经开始 。本实验仅仅是通过对 TGF-β2mRNA 的
检测 ,初步探讨了老年核性和皮质性白内障的发病
机理。有关这一问题 ,还有许多方面值得研究 ,特别
是如何利用 TGF-β2及其抑制物预防和治疗白内障 ,
仍有许多工作要做 。我们期待能通过今后对 TGF-
β2的进一步研究 ,为临床白内障的治疗 、用药提供新
的途径。
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(2003-12-28 收稿)
编辑　孙孝云
57　第 1 期 赵玲敏 ,等.菘蓝的 4 种单体成分抗柯萨奇病毒作用的研究