全 文 ：第 24卷第 2期 西　南　农　业　大　学　学　报 Vol.24 ,No.2
2002年 4月 Journal of Southwest Agricultural University Apr.2002
文章编号:1000-2642(2002)02-0105-03
菘蓝下胚轴愈伤组织细胞悬浮培养
陈　薇 ,梅文泉 ,赵丰萍 ,寸守铣
(云南省农业科学院 生物技术所 ,云南 昆明　650223)
摘要:探讨菘蓝下胚轴愈伤组织细胞悬浮培养的规律 , 并用正交设计法对影响细胞悬浮培养的主要因素如温度 、接种
量 、生长素 2 , 4-D、蔗糖含量进行分析 , 得出菘蓝下胚轴愈伤组织细胞悬浮培养的优化条件:温度 20℃、接种量 0.2 g·
30 ml-1、激素 2 , 4-D 0.2 mg·L-1 、蔗糖含量 2.0%。
关　键　词:菘蓝;细胞悬浮培养
中图分类号:Q 813.1;S 567.23+9　　　　　　文献标识码:A
CELL SUSPENSION CULTURE OF HYPOCOTYL CALLI OF ISATICA INDICAGO
CHEN Wei , MEI Wen-quan, ZHAO Feng-ping , CUN Shou-xian
(Biotechnology Research Institute , Yunnan Academy of Agricultural Sciences , Kunming Yunnan 650223 , China)
Abstract:The orthogonal experimental design was adopted in an experiment to investigate the effects of temperature , inoculation volume , 2 , 4-D
and sucrose on suspension culture of hypocotyl calli of Isatica indicago.The optimum combination of culture conditions was found to be a tempera-
ture of 20℃, an inoculation volume of 0.2 g/30 ml , and a medium containing 2 , 4-D 0.2 mg/L and sucrose 2.0%.
Key words:Isatica indicago;cell suspension culture
　　菘蓝(Isatica indicago),俗名板蓝根 ,属十字花科
菘蓝属二年生植物 ,是我国传统常用中药材之一 ,含
有靛青 、靛玉红 、谷甾醇等药用成分 ,对流感 、流脑 、肝
炎 、肺炎等疾病有良好的治疗和预防作用。近年来的
研究表明板蓝根不仅对动物病毒有良好的抑制作用 ,
而且对植物病毒如烟草 TMV 病毒 、油菜菌核病有较
好的抑制和抵抗效果[ 1] ,因此板蓝根不仅在药用价值
方面 ,而且在农作物育种和开发无公害农药方面有良
好运用前景 。悬浮细胞培养作为产业化生产植物次
生代谢产物的手段 ,在许多重要的药用植物如西洋
参[ 2] 、黄连 、甘草[ 3]等得到应用 。目前有关菘蓝组织
培养报道很少 ,主要集中于愈伤组织诱导及快繁体系
的建立[ 4 ～ 5] ,未见有关悬浮细胞培养的报道。该文用
菘蓝下胚轴愈伤组织为材料进行细胞悬浮培养规律
研究 ,为菘蓝在细胞工程领域的运用提供依据 。
1　材料和方法
1.1　材料来源
菘蓝种子由中国农业科学院油料所提供。
1.2　下胚轴愈伤组织诱导
种子经常规表面灭菌后 , 接入无激素 MS 培养
基 ,置光下培养 7 d后 ,切取中上部下胚轴 ,切成 3 ～ 5
mm的小段 ,接入MS+2 ,4-D 0.2 mg·L-1+NAA 0.2
mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+3.0%蔗糖+0.8%琼
脂粉 ,pH 5.8培养基中 ,材料置于 25℃温箱中暗培养
25 d ,取生长旺盛的愈伤组织用于细胞悬浮培养 。
1.3　细胞悬浮培养系的建立
将诱导出的愈伤组织用镊子挤压成小块后 ,接入
装有 30 ml液体培养基的 150 ml三角瓶中 ,培养基成
分与愈伤组织诱导培养基相同 ,不加琼脂 。三角瓶置
收稿日期:2001-10-12基金项目:云南省重点开放实验室基金 ,云南省农科院资助项目作者简介:作者简介:陈　薇(1965-),女 ,云南昆明人 ,云南省农业科学院生物技术所硕士,从事药用植物组织培养及生物技术育种。
DOI :10.13718/j.cnki.xdzk.2002.02.003
于黑暗中 ,110 r/min的摇床上进行振荡培养 。每隔 7
d继代培养 1次 ,连续培养 3 ～ 4代 ,便可建立起稳定
的细胞悬浮培养系。
1.4　细胞悬浮培养生长曲线测定
取0.5 g 悬浮培养物 ,接入新鲜液体培养基中 ,
进行振荡培养 ,每隔 3 d取样 1次 ,共培养 30 d 。
1.5　悬浮细胞生长量的测定
取样时 ,先将培养物移入离心管中 , 500 r/min离
心10 min ,分别搜集沉淀和上清液 。用滤纸吸干沉淀
物水分 ,称其鲜重 ,再将沉淀物放入烘箱中 , 50℃烘干
24 h ,称其干重。分别计算鲜重和干重的相对生长
量。相对生长量=(取样时重量-初始重量)/初始重
量×100%。上清液则用于 pH 值和总糖含量的测定 ,
总糖测定方法参照食品成分分析手册。
1.6　正交试验
试验采用9L34正交设计表 ,设温度 、激素 、接种量
和蔗糖含量4个因素 ,每因素 3水平(详见表 1),设置
3次重复 ,培养周期 15 d ,培养结束后 ,取悬浮细胞鲜
重相对生长量进行方差分析。
表 1　正交设计表及差异显著性分析
因 　　　　素
A.温度
/ ℃
B.接种量
/g
C.2 , 4-D
/(mg·L -1)
D.蔗糖
/ %
水平
1 20 0.2 0.2 2.0
2 25 0.5 0.5 3.0
3 30 1.0 1.0 4.0
差异显著性　　　31.88＊＊ 2.54 　28.7＊＊ 0.67
2　结果与讨论
2.1　菘蓝下胚轴愈伤组织细胞悬浮培养生长周期
菘蓝下胚轴愈伤组织细胞悬浮培养物生长随时
间的变化情况如图 1所示。接入的细胞团在新鲜培
养基中快速生长 ,5 d后进入对数生长期 ,15 d达到峰
值 ,20 d后细胞生长速度减慢 ,生长量也逐步下降 。
2.2　细胞悬浮培养过程中培养基中底物消耗和 pH
动态变化
细胞悬浮培养过程中 ,随着细胞的不断分裂和生
长 ,作为培养基中碳源的蔗糖含量以及 pH 值也发生
相应的变化 ,它们随时间的动态变化情况如图 2 所
示。蔗糖的消耗量随着培养时间的延长而增加 ,当细
胞增长量达到峰值时 ,蔗糖含量低于 1.0%,培养至
27 d以后 ,培养基中的蔗糖已消耗殆尽 ,其含量已不
足0.1%。与蔗糖变化相反 ,随着培养时间的延长 ,
pH值逐步增大 ,由弱酸性过渡到弱碱性 。
2.3　影响细胞悬浮培养的主要因素
悬浮细胞培养受多种因素的影响 ,利用正交设计
表对影响细胞悬浮培养的主要因素如温度 、接种量 、
蔗糖含量 、激素(2 ,4-D)进行正交试验 ,结果如表 1
所示。从分析的结果可以看出 ,在这 4个因素中 ,对
细胞悬浮培养影响最大的是温度 ,其次为接种量 ,它
们对悬浮细胞生长量的影响均达到极显著水平 ,而蔗
糖和激素含量影响较小 ,未能达到显著水平。从设计
表中 ,可以分析出菘蓝下胚轴愈伤组织悬浮培养的优
化培养条件为:温度 20℃、接种量 0.2 g 、激素 2 , 4-D
含量 0.2 mg·L-1、蔗糖 2.0%,在此优化培养条件下 ,
培养 15 d ,悬浮细胞相对生长量可达到 502.9%。
2.4　不同碳源对悬浮细胞生长的影响
用随机区组设计法 ,对 3种不同糖如蔗糖 、葡萄
糖 、麦芽糖作为细胞悬浮培养的碳源 ,观察悬浮细胞
对不同碳源的利用情况 。培养周期为 15 d , 3次重
复 。不同碳源对悬浮细胞生长量的影响可从方差分
析的结果得到说明(见表 2):在分别以蔗糖 、葡萄糖 、
麦芽糖为碳源的培养基中 ,悬浮细胞生长量有显著差
异 ,其中以蔗糖为碳源的悬浮细胞生长量明显高于以
葡萄糖和麦芽糖为碳源的悬浮细胞生长量 ,所以菘蓝
悬浮细胞培养可利用的最适碳源为蔗糖 。
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表 2　不同碳源对悬浮细胞生长量的影响
碳　源 相对生长量/ % 差异显著性
蔗　糖 489.3 a
麦芽糖 403.6 b
葡萄糖 321.7 c
2.5　添加物对悬浮细胞生长的影响
在培养基中分别添加 500 mg·L-1的 LH 和 YE ,
培养 15 d后 ,对其鲜重进行比较分析 。结果显示 ,添
加物对悬浮细胞生长有一定促进作用 ,但增长量未能
达到显著水平 ,这说明 LH ,YE两种添加物对悬浮细
胞的生长影响不大。
参考文献:
[ 1] 　王启燕.抗 TMV 增殖物质———板蓝根[ J] .病毒学杂志 ,
1989 , (1):107.
[ 2] 　刘本叶.西洋参组织和细胞培养研究进展[ J] .中草药 ,
1995 , 26(11):611-613.
[ 3] 　陈士云.内循环气升式生物反应器培养甘草细胞[ J] .武
汉植物学研究 , 1994 , 12(4):380-384.
[ 4] 　彭　菲.菘蓝子叶和下胚轴组织培养再生植株的研究
[ J] .湖南农学院学报 , 1994 , 20(5):450-456.
[ 5] 　王　莉.菘蓝叶片组织培养分化成苗[ J] .植物生理通
讯 , 1985 ,(2):43.
[ 6] 　姜广奋.生物技术与药用植物开发[ J] .中草药 , 1994 , 25
(12):651-653.
[ 7] 　赵合句.油菜与菘蓝属杂交育种研究[ J] .植物学报
1994 , 27(3):89.
[ 8] 　宁正祥.食品成分分析手册[ S] .北京:中国轻工业出版
社 , 1998.1-8.
(上接第 100页)
4.2　陕北 、渭北地区土壤具有明显的地带性特征 ,其
土壤类别自北向南分别为风沙滩地区 、丘陵沟壑区 、
高原沟壑区 ,模型中的 CN 参数应分别在 A , B , C 类
土壤中选用 ,这与陕北 、渭北土壤分区特征基本一致 ,
说明该模型具有合理性和较大范围的适用性 。
4.3　SCS 模型没有考虑降雨历时对土壤滞留量及
CN值的影响 ,这要影响模型的估算精度 ,另外 ,前期
降雨对土壤湿润状况的影响是一个很复杂的过程 ,这
一方面研究还有待进一步深化 。
参考文献:
[ 1] 　黄占斌 , 山　仑 , 张岁歧 , 等.雨水利用与水土保持和农
业持续发展[ J] .水土保持通报 , 1997 , 16(1):54-56.
[ 2] 　朱兴平 ,李永红.雨水利用的理论与实践[ J] .水土保持
通报 , 1997 ,(4):32-36.
[ 3] 　William , J.R and Lasear , W.V , Water yield model using SCS
curve numbers[ J] .Journal of Hydraulics Division , 1976 , 102
(9):1221-1253.
[ 4] 　Bosznay.M , Generalization of SCS curve numeber method[ J] .
Journal of irrigation and drainage engineering , 1989 , 155(1):
139-144.
[ 5] 　赵松岭.集水农业引论[ M] .西安:陕西科学出版社 ,
1996.
[ 6] 　李玉山 , 韩仕峰 ,汪正华.黄土高原土壤水分性质及其分
区[ A] ,中国科学院西北水土保持研究所集刊[ C] .1989 ,
(2):1-16.
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