全 文 ：收稿日期:2009-12-11
基金项目:安徽省高校引进人才专项(ZRC200561);安徽省科技厅攻关
资助项目(08010302159)。
作者简介:苗永美(1976-),女 ,山东临沂人;在读博士研究生 ,讲师;主
要从事观赏园艺 、食用菌 、蔬菜等生物技术的研究;
E-mail:mym416@ 163.com。
两种诱导子对菘蓝愈伤组织诱导及增殖的影响
苗永美 , 简 兴 , 何华奇 , 许春甲 , 杨 婷
(安徽科技学院生命科学学院 , 安徽 凤阳 233100)
摘要:以菘蓝叶片为外植体 , 在培养基中添加一定浓度的 La(NO3)3和 CuSO4 , 研究两种非生物诱导子对愈伤组织的发
生时间 、诱导率 、重量及增殖的影响。结果表明:15.0mg/LLa(NO
3
)
3
处理能使叶片提前 5d产生愈伤组织 ,愈伤组织的
诱导率和鲜重分别比对照提高了 18.33%和 79.68%, 并且该浓度的硝酸镧还促进了愈伤组织的增殖和干物质的积累;
0.8mg/LCuSO4处理能使叶片提前 4d产生愈伤组织 ,诱导率和鲜重分别比对照提高了 18.33%和 60.24%, 而且 0.8mg
/LCuSO4最有利于愈伤组织的增殖和干物质的积累;但高浓度镧和铜会抑制菘蓝愈伤组织的诱导及增殖 。
关键字: 菘蓝;诱导子;镧;铜;愈伤组织
中图分类号: Q943.1; R282.1 文献标志码: A 文章编号: 1001-4705(2010)04-0016-04
EfectsofTwoElicitorsonCalusInducementandMultiplication
ofIsatisindigoticaFort
MIAOYong-mei, JIANXing, HEHua-qi, XUChun-jia, YANGTing
(ColegeofLifeScience, AnhuiScienceandTechnologyUniversity, FengyangAnhui233100, China)
Abstract:UsingleavesofIsatisindigoticaasexplants, mixingcertainconcentrationsofLa(NO3)3 andCuSO4
intomedia, theefectsoflanthanumandcopperonstart-timeofleavescalus, inducementrate, freshweightand
itsmultiplicationwerestudied.Theresultsindicatedthat15.0mg/LLa(NO3)3 advancedcalusproductionby
fivedays, heightencalusinducementrateandfreshweight, whichwerehigherby18.33% and79.68% than
thosewithoutelicitorsaddition.Inaddition, 15.0mg/LLa(NO3)3 couldpromotecalusmultiplicationanddry
materaccumulation.And0.8mg/LCuSO4 advancecalusproductionbyfourdays, heightencalusinducement
rateandfreshweight, whichwerehigherby18.33% and60.24% thancontrastexperiment.Additionaly, 0.8
mg/LCuSO4 promotedcalusmultiplicationanddrymateraccumulationbest.Buthigherconcentrationsof
lanthanumandcopperinhibitedcalusinducementandmultiplication.
Keywords: IsatisindigoticaFort;elicitor;lanthanum;copper;calus
菘蓝 (IsatisindigoticaFort)属于十字花科菘蓝
属 ,是常规中药材 ,其干燥叶称为大青叶 ,内含靛玉红
药用成份 ,具有清热解毒 ,凉血消斑作用 ,用于温邪入
营 、高热神昏 、发斑发疹 、黄疸 、热痢 、痄腮 、喉痹 、丹毒 、
痈肿等 [ 1, 2] 。对菘蓝叶细胞大规模培养是实现靛玉红
工业化生产的前提 ,在药用植物细胞培养过程中 ,各种
物理 、化学因子会影响细胞的生长和药用成份的合成 ,
如非生物诱导子重金属及稀土等对细胞的生长和药用
成份的合成有一定的影响 ,稀土的促进生长作用已在
许多药用植物如黄连 [ 3] 、水母雪莲 [ 4] 、掌叶大黄 [ 5]等
植物细胞培养中得到证实 ,而重金属诱导子用于药用
植物细胞生长的研究较少 。因此本研究以菘蓝愈伤组
织诱导能力强的叶片为材料[ 6] ,研究了稀土镧和重金
属铜两种非生物诱导子对菘蓝叶片愈伤组织的诱导
率 、发生时间 、鲜重及其增殖的影响 ,为下一步菘蓝叶
片细胞大规模培养 、靛玉红高产细胞株的筛选及最终
实现靛玉红工业化生产提供材料和依据。
1 材料和方法
1.1 材 料
菘蓝的种子(安徽科技学院中药园提供)。
1.2 方 法
1.2.1 无菌苗的获得
菘蓝的种子先用无菌水反复冲洗 ,再用 0.1%的
HgCl2处理 10min,最后用无菌水冲洗 4次 ,无菌条件
下接种到 MS基本培养基中进行培养 。
·16·
第 29卷 第 4期 2010年 4月 种 子 (Seed) Vol.29 No.4 Apr. 2010
1.2.2 愈伤组织诱导
选择长势好 、颜色深绿的叶片 ,切割成约 1cm2 ,接
种到 MS+6-BA1.0mg/L+2, 4-D0.5mg/L附加 La
(NO3)3(0、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、15.0、20.0、30.0、
40.0、50.0、 60.0 mg/L)和 CuSO4 (0.16、 0.24、0.32、
0.8、1.6、2.4、3.2、4.8、6.4)共 21个处理 ,每瓶接 6叶
块 ,重复 10次。观察记录出愈时间 , 30d后统计愈伤
组织的诱导率 、鲜重及生长情况 。
1.2.3 愈伤组织的继代增殖
将 1.2.2诱导出的质量较好的愈伤组织称重后接
种到 MS+6-BA0.5mg/L+2, 4-D0.3mg/L附加同愈
伤组织诱导相同的 La(NO3)3和 CuSO4浓度的培养基
上继代增殖 , 30d后称愈伤组织的鲜重 ,然后将鲜愈伤
组织于 60℃干燥箱中烘 8h,用万分之一精密天平称
其干重 。
上述培养基均加琼脂粉 4.5 g/L,蔗糖 30 g/L,
pH=5.8,培养温度(25±1)℃,光照强度 2 500lx,光
照周期 12h/d。
1.2.4 结果统计
愈伤组织诱导率(%)=产生愈伤组织叶数 /接种
的外植体数 ×100%;
平均每叶出愈重量(mg)=出愈总重量 /出愈的外
植体数;
愈伤组织增殖倍数 =继代增殖后鲜重 /继代增殖
前鲜重;
干 /鲜 =愈伤组织干重 /鲜重。
2 结果与分析
2.1 镧对菘蓝叶片愈伤组织诱导的影响
菘蓝叶片在含不同浓度 La(NO3)3的培养基上生
长情况及结果统计见表 1。结果表明 , 1.0 ～ 40.0
mg/LLa(NO3)3能使叶片提早产生愈伤组织 ,其中添
加 15.0mg/LLa(NO3)3处理效果最好 ,接种第 6天就
有愈伤组织产生 ,比对照提前 5 d,但是当 La(NO3)3
超过 50.0mg/L时 ,则抑制了愈伤组织的发生 ,推迟了
出愈时间。从表 1还可以看出 ,一定浓度的 La(NO3)3
能使更多的叶片产生更多且质量较好的愈伤组织 ,其
中 15.0mg/L处理效果最好 ,每个叶片均产生了愈伤
组织 ,即诱导率达到了 100%,平均每叶诱导出的鲜愈
伤组织重量是 816.5mg,比对照分别提高了 18.33%
和 79.68%。本研究还表明 ,一定浓度的 La(NO3)3能
促进愈伤组织生长 、改变质地 ,在所试浓度范围内 ,随
着浓度的提高 ,愈伤组织的颜色先是逐渐变深 ,但当浓
度超过 20.0mg/L时 ,愈伤组织的颜色又逐渐变浅 ,水
渍状现象逐渐加重 ,死亡的愈伤组织越来越多。说明
高浓度的 La3+会抑制愈伤组织的产生 ,并且不利于愈
伤组织的正常生长 ,导致愈伤组织生长缓慢甚至死亡。
表 1 镧对菘蓝叶片愈伤组织诱导的影响
La(NO3)3(mg/L)
出愈时间
(d)
诱导率
(%)
平均每叶出愈重量
(mg)
愈伤组织
生长情况
0(ck) 11 81.67 454.38 ++
1.0 10 85.00 459.31 ++
2.0 9 86.67 493.73 ++
4.0 9 90.00 524.01 ++
8.0 8 93.33 557.57 +++
12.0 8 95.00 767.34 +++
15.0 6 100.00 816.45 ++++
20.0 8 96.67 697.73 +++
30.0 8 88.33 628.38 ++
40.0 10 80.00 497.11 +
50.0 12 76.67 427.36 —
60.0 13 70.00 398.54 --
注:“ ++++”表示生长最好;“ +++”表示生长较好;“ ++”表
示生长好;“ +”表示生长一般;“— ”表示生长差;“ --”表示
生长最差。下表同。
2.2 铜对菘蓝叶片愈伤组织诱导的影响
表 2 铜对菘蓝叶片愈伤组织诱导的影响
CuSO4(mg/L)
出愈时间
(d)
诱导率
(%)
平均每叶出愈鲜重
(mg)
愈伤组织
生长情况
0.0(ck) 11 81.67 454.38 ++
0.16 10 88.33 476.38 ++
0.24 9 95.00 489.26 +++
0.32 8 96.67 526.50 +++
0.8 7 100.00 728.08 ++++
1.6 8 93.33 519.43 +++
2.4 8 90.00 492.22 ++
3.2 9 83.33 491.07 ++
4.8 10 80.00 467.24 +
6.4 12 75.00 370.43 +
将菘蓝叶片接种到附加不同浓度 CuSO4的培养
基上 , 30d观察及统计结果见表 2。结果表明 ,一定浓
度铜能使愈伤组织提早发生 , 其中添加 0.8 mg/L
CuSO4比对照提前 4d,但是 6.4mg/LCuSO4反而延迟
了出愈时间。另外一定浓度 CuSO4能使更多的叶片
产生更多且质量较好的愈伤组织 ,以 0.8mg/LCuSO4
处理效果最好 ,每个叶片均产生了愈伤组织 ,平均每叶
诱导出的愈伤组织重量为 728.08 mg,分别比对照提
高了 18.33%和 60.24%。并且在这个处理上愈伤组
织生长旺盛 ,颜色为浅绿色 ,质量最好 。但是高浓度的
铜会抑制愈伤组织的产生 ,愈伤组织生长缓慢 ,颜色逐
渐变黑 ,出现死亡迹象 。
·17·
研究报告 苗永美 等:两种诱导子对菘蓝愈伤组织诱导及增殖的影响
2.3 镧对愈伤组织增殖的影响
叶片经初代培养诱导出的愈伤组织 ,从中选择颜
色鲜艳 、生长旺盛 、结构较为疏松的愈伤组织接种到增
殖培养基上继代 ,统计结果见表 3。结果表明 , 添加
1.0 ～ 30.0 mg/LLa(NO3)3有利于愈伤组织的增殖 ,
具体表现其愈伤组织比对照生长迅速 ,色泽鲜艳 ,长势
好 ,其中 15.0mg/L处理效果最好 , 30d后鲜愈伤组织
增重了 4.542倍 ,比对照处理提高了 40.74%。但当
添加 40.0 ～ 60.0mgl/L时 ,愈伤组织生长缓慢 ,部分
愈伤组织出现了死亡 。鲜愈伤组织烘干称重后计算干
鲜比 ,数据表明:随着镧浓度升高 ,干鲜比先升高后降
低 ,其中 15.0mgl/L处理上 ,干鲜比最大为 0.176,比
对照提高了 23.08%,但当浓度 >50.0mgl/L时 ,干鲜
比减小 ,说明高浓度的镧不利于菘蓝愈伤组织干物质
的积累 。
表 3 镧对愈伤组织增殖的影响
La(NO3)3
(mg/L)
增殖前鲜重
(g)
增殖后鲜重
(g) 增殖倍数
干重
(g) 干 /鲜
0(ck) 7.090 22.894 3.229 3.274 0.143
1.0 5.993 20.047 3.345 2.907 0.145
2.0 8.275 28.731 3.472 4.166 0.145
4.0 6.311 22.631 3.586 3.417 0.151
8.0 6.399 25.506 3.986 3.979 0.156
12.0 7.345 29.916 4.073 4.966 0.166
15.0 7.610 34.565 4.542 6.083 0.176
20.0 7.746 31.108 4.016 5.195 0.167
30.0 7.422 26.986 3.636 4.102 0.152
40.0 5.812 17.134 2.948 2.519 0.147
50.0 4.436 11.072 2.496 1.240 0.112
60.0 2.512 4.858 1.934 0.466 0.096
2.4 铜对愈伤组织增殖的影响
表 4 铜对愈伤组织增殖的影响
CuSO4(mg/L)
增殖前鲜重
(g)
增殖后鲜重
(g) 增殖倍数
干重
(g) 干 /鲜
0.0(ck) 7.090 22.894 3.229 3.274 0.143
0.16 6.237 22.551 3.295 3.103 0.151
0.24 5.471 18.361 3.356 2.809 0.153
0.32 4.128 16.549 3.418 2.631 0.159
0.8 4.313 16.549 3.837 2.697 0.163
1.6 4.981 16.293 3.271 2.281 0.140
2.4 5.998 18.137 3.024 2.430 0.134
3.2 4.850 11.174 2.304 1.408 0.126
4.8 8.264 12.727 1.540 1.527 0.120
6.4 6.789 6.837 1.007 0.711 0.104
愈伤组织在不同铜浓度的培养基上增殖 30d后
统计结果见表 4。从表中看出:0 ～ 2.4mg/LCuSO4有
利于菘蓝愈伤组织的增殖 ,其中 0.8mg/L处理效果最
好 , 30d后增重了 3.837倍 ,比对照提高了 15.85%。
但当 CuSO4浓度超过 2.4 mg/L时 ,愈伤组织生长缓
慢 ,甚至有的愈伤组织出现死亡衰败 。随着铜浓度升
高 ,干鲜比先升高后降低 ,说明一定浓度的铜能促进菘
蓝愈伤组织干物质的积累 ,其中 0.8mg/L处理干鲜比
最大 ,达 0.163,对照提高了 12.27%。
3 讨 论
稀土资源在农业领域中逐渐得到开发应用 ,并取
得了一定的进展 。现已证明 ,适宜浓度的稀土对植物
生长有一定的刺激作用 ,能促进植物根系对养分的吸
收 ,提高植物叶绿素含量和光合作用[ 7] ,及抗逆性 [ 8] 。
近年来 ,稀土又被应用到植物组织培养领域 ,结果表
明 ,适当浓度的稀土能促进试管苗的分化 、发育及生
根 ,另外对于植物愈伤组织的诱导 、生长及次生代谢物
的合成也有一定的促进作用 ,其中镧是研究利用最多
的一种稀土 [ 9] 。在菘蓝细胞培养中 ,通过预实验证明
镧好于铈 、钕两种 ,因此本试验研究了镧稀土对菘蓝叶
片愈伤组织诱导和增殖的影响 ,结论是低浓度 La3+
(镧)对愈伤组织的诱导和增殖起到促进作用 ,高浓度
具有抑制作用。这一规律在其它相关研究中也得到证
实 [ 3 ～ 5] 。其原因有人认为是适宜浓度的 La3+处理能
促进植物体内 IAA的合成 ,降低 IAA氧化酶的活力 ,
是通过改变植物内源激素的变化来促进生长的;而高
浓度可能对植物有一定的伤害 ,从而抑制其正常生长;
也有人认为稀土的促进作用可能与 CaM有关 ,低浓度
的稀土可能激活依赖于 CaM的各种酶的活性 ,高浓度
时抑制这些酶活性[ 10] 。
铜是植物正常生命活动所必需的微量矿质元素 ,
参与广泛的生命活动 。在以往的研究中 , 一般认为
Cu2 +是一种对植物生长发育和器官分化有害的重金
属元素 ,然而从近年来陆续发表的一些研究报告来看 ,
这种看法并不完全正确 ,祝沛平等[ 11]研究表明:一定
浓度的 Cu2 +能明显促进离体黄瓜子叶花芽的分化。
杨跃生 、袁玲等 [ 12, 13]也分别研究了铜对水稻愈伤组织
再生植株的作用 ,结论是合适剂量的铜虽然对愈伤组
织的促进作用不明显 ,但在后期的再分化过程中 ,不论
增殖受过铜的促进或者是抑制的愈伤组织 ,均能在再
分化培养基上再生出数量更多和质量更好的植株。本
研究结果表明 , 0.8mg/L硫酸铜能使菘蓝愈伤组织提
前产生 ,并且能提高叶片的脱分化率 ,促进愈伤组织的
生长和增殖 ,虽然不如稀土镧的促进效果 ,但比对照诱
导率和鲜重分别提高了 18.33%和 60.24%,在愈伤组
织增殖过程中 ,增值倍数和干鲜比分别比对照提高了
15.85%和 12.27%。但浓度增高时有抑制作用 。
(下转第 22页)
·18·
第 29卷 第 4期 2010年 4月 种 子 (Seed) Vol.29 No.4 Apr. 2010
“正甜 38” 、“正甜 613”、“粤甜 13号 ”和 “粤甜 10号 ”
的 1个或多个品种的亲本间可扩增出特异带 ,且这些
特异带可在杂种中检测到 ,因此可用于纯度检测。其
中 ,引物 SPS-E16可同时用于前 3个品种的纯度检
测 ,而引物 SPS-F06和 SPS-E19仅分别在品种 “正甜
38”和 “粤甜 10号”的亲本间扩展出各自的特异带 ,只
能用于各自单个品种的纯度检测 。但是 ,值得一提的
是 “正甜 38”为三交种 ,其个体基因型将因二次杂交出
现分离 ,这种母本个体基因的分离或重组对父本 2的
特异带在杂交后代个体的扩增表现是否会有大的影
响 ,还有待进一步研究 。
许多研究表明 , RAPD技术的稳定性相对较差 ,但
笔者经过对不同作物的多次试验 ,发现 RAPD分子标
记的不稳定主要表现在相对较弱的条带上 ,有时会因
DNA质量或操作差异而扩增不出。但是 ,经过多次重
复试验表明 ,只要提高 DNA质量和严格统一操作步
骤 ,均可获得稳定一致的结果 ,在一些研究中也有同样
的观点 [ 8, 9] 。在利用 RAPD技术进行品种真伪性鉴定
时 ,为避免由于某些操作差异等因素而引起一些较弱
的条带无法扩增出 ,在实际鉴别过程中可用已确知的
品种作对照 ,同步进行 DNA提取和 PCR扩增等操作 ,
这样就可更加准确地比较判断出品种的真伪性 。在进
行种子纯度检测时 ,由于个体样品数较多 ,提取 DNA
质量有时较难保证均一 ,为了克服 RAPD弱带不稳定
的缺陷 ,最好选用可扩增出明亮清晰特异带的引物进
行 PCR扩增分析 ,方可得到理想的结果 。
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第 29卷 第 4期 2010年 4月 种 子 (Seed) Vol.29 No.4 Apr. 2010