全 文 ：菘蓝查尔酮合成酶基因(IiCHS)的克隆及其生物信息学分析
收稿日期:2014-03-10 修回日期:2014-03-30
基金项目:国家自然科学基金资助项目(31200221);陕西省自然科学基金 2010JQ3004，陕西省教育厅自然科学研究计划项目
2010JK417。
第一作者简介:韩立敏，女，河北邯郸人，博士研究生，讲师，研究方向为药用植物次生代谢。
通信作者:王喆之，男，博士，教授，博士生导师，主要从事药用植物资源开发与利用研究。
韩立敏1，2，周宏骏1，王喆之1*
( 1．药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，西北濒危药材资源开发国家工程实验室，陕西师范
大学 生命科学学院，陕西 西安 710062 ; 2．陕西学前师范学院，陕西 西安 710062)
摘 要:类黄酮是植物体内一类重要的次生代谢产物，对植物的生长发育有着重要的调节作用。查尔酮合成
酶是植物类黄酮合成途径的第一个关键酶，在调控类黄酮的生物合成中起着决定作用。本研究采用 ＲT －
PCＲ方法扩增得到一条菘蓝查尔酮合成酶家族蛋白基因，命名为 IiCHS，全长 1 273 bp，包含一个 1 194 bp的
OＲF，编码 397 个氨基酸，分析其编码的蛋白质序列显示其属于查尔酮合成酶家族蛋白，定位于胞质中。该研
究不仅有助于分析查尔酮合酶基因的功能，而且还为进一步利用该基因资源改良菘蓝品质奠定了理论基础。
关键词:菘蓝; 查尔酮合成酶; 基因克隆 ; 生物信息学分析
查尔酮合成酶(chalcone synthase，CHS，EC
2． 3． 1． 74)是植物 III 型聚酮合成酶的一种，是类
黄酮合成途径的关键酶。它催化 1 分子 4 一羟基
香豆素辅酶 A和 3 分子丙二酰 A 缩合反应，生成
查尔酮及其衍生物，进而产生类黄酮(包括黄酮
醇、黄烷酮、花青素苷等)［1］。现已从郁金香［2］、
观赏桃［3］、苜蓿［4］、黄蜀葵［5］、化州柚［6］、何首
乌［7］、罗汉果［8］、决明子［9］、盐芥［10］、小麦［11］等多
种植物中克隆得到查尔酮合成酶基因。大量研究
表明查尔酮合成酶参与植物生长发育和对逆境响
应的诸多生理生化过程，在抗病、抗虫、花色形成、
损伤修复、紫外线防御以及根瘤形成等方面起着
重要的作用［12 ～ 15］。
菘蓝(Isatis indigotica Fort．)，在我国南北广
为栽培，是常用药用植物，以根和叶入药，干燥根
入药称板蓝根，干燥叶入药称为大青叶，具有清
热、解毒、凉血、利咽等功效，广泛应用于流行性感
冒、流行性腮腺炎、流行性乙型肝炎症等症的治
疗。对菘蓝查尔酮合成酶基因(IiCHS)的克隆和
分析不但丰富了植物查尔酮合成酶基因的研究内
容，而且为进一步研究该基因的功能及其调控奠
定了分子基础。
1 材料与方法
1． 1 植物材料与试剂
将菘蓝种子(购自于河北安国中药材种子基
地)播种于花盆中，定期浇水，温室 25℃条件下进
行培养。大肠杆菌 DH5α 为本实验室保存，
pMD19 － T 载体、反转录试剂盒、PCＲ 试剂购自
TakaＲa公司，ＲNA提取试剂盒、胶回收试剂盒购
自 OMEGA。
1． 2 菘蓝查尔酮合成酶基因(IiCHS)的克隆
提取菘蓝样品总 ＲNA(提取方法参照试剂盒
说明书)，反转录成 cDNA，作为 PCＲ扩增模板，根
据实验室菘蓝转录组数据库中的 EST 序列拼接
全长，设计引物，IiCHSF:5 － CAACTGAGTC-
CCAGGATGAATG － 3 IiCHSＲ:5 － ATTGATCAT-
CAGTGCAGTGCTTG －3，由北京奥科鼎盛生物科
技有限公司合成。PCＲ反应体系 20 μl，包含 2 μl
cDNA、0． 5 μl Primer3(10 μM)、0． 5μl Primer5
(10 μM);10 μl 2 × Premix Taq、7 μl ddH2O。
PCＲ扩增条件为{98 ℃ 10 s;52℃ 30 s;72 ℃ 90
s}× 30 个循环;72 ℃ 10 min;16 ℃ for ever，110 V
琼脂糖凝胶(1%)电泳 30 min检测。回收目的片
段，连接至 pMD19 － T 载体，转入大肠杆菌 DH5α
中，筛选阳性菌落，测序。
1． 3 菘蓝查尔酮合成酶基因(IiCHS)的生物信息
学分析
用 DNAStar 和 http:/ /www． ncbi． nlm． nih．
gov /、http:/ / www． ebi． ac． uk /、http:/ /www． cbs．
dtu． dk /、http:/ / cn． expasy． org /等网站提供的各
类生物信息学软件进行在线分析。用 PrimerPre-
mier 5． 0 软件设计引物。DNAStar 软件查找开放
读码框(OＲF)、翻译核苷酸序列、分析氨基酸序
列的组成与理化性质分析;用 Blast工具完成核苷
酸和氨基酸序列的同源性比对分析;蛋白跨膜结
·8·
陕西农业科学 2014，60(07):8 － 11，21 Shaanxi Journal of Agricultural Sciences
构域和亚细胞定位的分析用在线工具 TMHMM、
TargetP 1． 1 Server;用 Swiss － model服务器进行蛋
白质的三维结构预测。
2 结果
2． 1 IiCHS的克隆及其序列特征分析
用菘蓝 cDNA 做模板进行 PCＲ 扩增，得到一
条长度为 1 273 bp的扩增产物(图 1)，核苷酸序
列及其推导的氨基酸序列如图 2 所示，OＲF 包含
1 194 个核苷酸，编码 397 个氨基酸，其中含有 49
个强碱性氨基酸，55 个强酸性氨基酸，139 个疏水
氨基酸，87 个极性氨基酸，等电点为 5． 69。该基
因所编码的蛋白质为酸性蛋白。
图 1 IiCHS cDNA全长序列的 PCＲ扩增
泳道 1:阴性对照;泳道 2 ～ 10:不同 PCＲ扩增条件下的产物
图 2 IiCHS核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
·9·
韩立敏，等:菘蓝查尔酮合成酶基因(IiCHS)的克隆及其生物信息学分析
利用菘蓝查尔酮合酶基因的核苷酸序列在
NCBI数据库上进行比对分析，结果表明其与拟南
芥(Arabidopsis thaliana)查尔酮合成酶基因、青菜
(Brassica rapa subsp． Ｒapa)查尔酮合酶基因相似
度分别高达 97%、92%，推测该序列为菘蓝查尔酮
合成酶家族蛋白中的一条编码基因，命名为 IiCHS;
利用菘蓝查尔酮合酶基因 IiCHS 的氨基酸序列在
NCBI数据库上 blast比对分析，分析显示菘蓝查尔
酮合酶蛋白(IiCHS)氨基酸序列与拟南芥(Arabi-
dopsis thaliana)、可可(Theobroma cacao)、青菜
(Brassica rapa subsp． Ｒapa)、葡萄(Vitis vinifera)、
杨毛果(Populus trichocarpa)、川桑(Morus notabi-
lis)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、鹰嘴豆(Cicer
arietinum)、辣椒(Capsicum annuum)查尔酮合成酶
家族蛋白氨基酸序列的同源性分别为 96%、83%、
81%、81%、81%、78%、78%、77%和 71%。
在 NCBI 上利用 CDD 在线工具分析菘蓝查
尔酮合成酶基因编码氨基酸序列的功能结构
域［16］，结果(图 3)显示，氨基酸序列中包含了所
有 CHS 的功能位点，包括查尔酮合成酶蛋白催化
中心的活性位点(Cys168、His308和 Asn341)、产物结
合位 点 (Glu196、Thr198、 Gly220、Thr257、Asn259、
Glu267、Glu268、Tyr343、Leu376)、丙二酰辅酶 A 结合
位点(Lys59、H is62、Leu63、Phe219、Phe268、Gly311、
Pro313)，活性位点(Cys168，His308和 Asn341)、决定
底物特异性苯丙氨基酸残基(Phe219和 Phe268)及
FGPG序列都是特别保守的［17］，并且活性位点这
三个氨基酸残基在迄今为止发现的所有 CHS 和
类 CHS酶中都是存在的［18］。
图 3 IiCHS编码蛋白保守结构域分析
2． 2 菘蓝查尔酮合成酶(IiCHS)的亲 /疏水性分
析与跨膜结构预测
用 ProtParam 对菘蓝查尔酮合成酶基因编码
蛋白的理化性质预测，推测该蛋白分子式为 C1942
H3113N535O588S16，分子量是 43 876． 37Da，总的亲水
性平均系数为(Grand average of hydropathicity)
为 － 0． 246，预测该蛋白属于疏水性蛋白，测不稳
定指数为 41． 9，属于不稳定蛋白，因此 IiCHS是不
稳定的疏水蛋白。
用 TMHMM2． 0 在线工具分析结果表明
IiCHS不存在跨膜区域，定位在膜内的氨基酸序
列也没有，这表明 IiCHS非膜蛋白，是存在于基质
中的蛋白。
2． 3 菘蓝查尔酮合成酶(IiCHS)的亚细胞定位分
析
利用 TargetP 1． 1 Server［19］在线软件预测菘
蓝查尔酮合酶的亚细胞定位，分析结果表明，
IiCHS含叶绿体导肽的分值为 0． 275，含线粒体导
肽的分值为 0． 297，含信号肽的分值为 0． 039，胞
质定位分值为 0． 436，这表明 IiCHS 可能在游离
核糖体上合成后不经蛋白转运，直接在细胞质基
质的特定部位中行使催化功能，是定位在细胞质
中的蛋白。这与拟南芥、菊花、贯叶金丝桃素、牡
丹等的查尔酮合成酶的定位预测结果一致［20］。
信号肽指导蛋白质的跨膜转移以保障产生的
蛋白质准确定向运输。通过 SignalP 4． 0 Serv-
er［21］在线软件对菘蓝查尔酮合成酶蛋白的信号
肽进行了预测，结果表明 IiCHS 的氨基酸残基平
均信号肽最大得分值为 0． 116，当相应氨基酸残
基的平均信号肽得分值高于 0． 5 时，存在信号
肽，低于 0． 5 时则不存在信号肽，故菘蓝查尔酮
合成酶氨基酸序列中不存在信号肽，属非分泌型
蛋白。据此推测 IiCHS可能在游离核糖体上合成
后不经蛋白转运，直接在细胞质基质的特定部位
中行使催化功能。
2． 4 菘蓝查尔酮合成酶(IiCHS)的二级结构和三
维同源建模分析
用 POＲTEＲ［22］在线软件分析菘蓝查尔酮合
成酶蛋白(IiCHS)的二级结构，预测结果表明其
二级结构以 α －螺旋为主(46． 1%)，其次为无规
则卷曲(32． 5%)，β － 折叠最少(21． 4%)。用
SWISS － MODEL［23］同源建模预测分析菘蓝查尔
酮合成酶蛋白的三维结构，同源建模结果显示
IiCHS 为二聚体蛋白，将同源建模获得的 IiCHS
3D结构与紫花苜蓿查尔酮合成酶的晶体结构比
对，发现二者空间构象高度相似，关键活性位点的
氨基酸残基完全相同，这表明二者可能具有相似
的底物特异性。菘蓝查尔酮合成酶蛋白同源二聚
·01·
陕西农业科学 2014 年第 60 卷第 7 期
体具有两个功能上相互独立的活性位点，二聚体
酶的活性位点在蛋白质的三维结构中相邻，有催
化袋结构，其亲核物质和聚酮化合物中间体的结
合位点是 Cys168［24］。
图 4 菘蓝查尔酮合成酶的 Swiss － model同源建模分析
3 讨论
植物查尔酮合成酶基因在植物抗虫、抗病、花
色形成、损伤修复、紫外线防御以及根瘤形成等方
面起着重要的作用。本研究通过分析菘蓝转录组
数据库，采用 ＲT － PCＲ技术成功获得菘蓝查尔酮
合成酶基因的 cDNA 全长，命名为 IiCHS，全长
1 273 bp，具有完整的开放读码框 1 194 bp，编码
397 个氨基酸，该研究为进一步在分子水平上进
行菘蓝品质改良和育种奠定了理论基础，同时，也
为深入研究查尔酮合成酶在药用植物类黄酮生物
合成代谢途径中的功能提供参考。
通过生物信息学软件对 IiCHS核苷酸序列及
其编码的蛋白氨基酸序列进行了分析，并预测了
菘蓝查尔酮合成酶的亚细胞定位，分析结果表明
菘蓝查尔酮合成酶蛋白属非分泌型蛋白，可能定
位于细胞质基质中。关于该基因的组织表达模式
和发育阶段表达模式、其所编码的蛋白的亚细胞
定位、以及该基因的功能有待进一步深入研
究［25，26］。
参 考 文 献:
［1］ 蒋明，曹家树．查尔酮合成酶基因［J］． 细胞生物学
杂志，2007，( 02) : 525-529．
［2］ Yuan Yuan，Xiaohong Ma，Yimin Shi，et al． Isolation
and expression analysis of six putative structural genes
involved in anthocyanin biosynthesis in Tulipa fosteri-
ana［J］． Scientia Horticulturae，2013，153: 93-102．
［3］ 林玲，汤浩茹，陈清，等．观赏桃查尔酮合成酶基因
的克隆及其序列分析［J］．园艺学报． 2012，39( 03) :
581-587．
［4］ Ferrer JL，Jez JM，Bowman ME，et al． Structure of chal-
cone synthase and the molecular basis of plant
polyketide biosynthesis［J］． Nature Structural Biology，
1999，( 06) : 775-784．
［5］ 林颖，郭秀莲，朱勋路，等．黄蜀葵查尔酮合成酶基
因 AmCHS克隆及序列分析［J］．四川大学学报( 自
然科学版) ，2008，45( 06) : 527-532．
［6］ 文海涛，赵红英，肖凤霞，等．化州柚查尔酮合成酶
基因克隆与序列分析［J］． 生物学杂志，2011，28
( 01) : 39-41．
［7］ 廖海，周嘉裕，张超，等．何首乌查尔酮合成酶基因
的克隆及序列分析［J］． 安徽农业科学，2009，37
( 15) : 7134-7137．
［8］ 王志强，蒙姣荣，邹承武，等．罗汉果查尔酮合成酶
基因的生物信息学分析［J］． 基因组学与应用生物
学，2010，29( 03) : 577-583．
［9］ 廖海，周嘉裕．决明查尔酮合成酶基因的克隆及序
列分析［J］ ． 西北植物学报，2008，28 ( 09 ) : 1728-
1733．
［10］ 高亚平，李玮，刘艳．盐芥查尔酮合成酶基因的生
物信息学预测与分析［J］． 现代农业科技，2010，
( 24) : 31-34．
［11］ 王坤，潘怡辰，孙慧君，等． 3 种小麦作物查尔酮合
成酶( CHS) 及其基因的生物信息学分析［J］．中国
农学通报，2013，29( 12) : 39-43．
［12］ Nakatsuka T，Mishiba K． Flower color modification of
gentian plants by ＲNAi-mediated gene silencing［J］．
Plant Biotechnol，2008，( 25) : 61-68．
［13］ Courtney-Gutterson N，Napoli C，Lemieux C，Morgan
A，Firoozabady E，Ｒobinson K E P． Modification of
flower color in florist＇s chrysanthemum: Production of
a white-flowering variety through molecular genetics
［J］． Nature Biotechnology，1994，( 12) : 268-271．
［14］ Holton TA，Cornish EC． Genetics and biochemistry of
anthocyanin biosynthesis［J］． Plant Cell． 1995，( 07) :
1071-1083．
［15］ 王会平，遇玲，邹世慧，等．利用 amiＲNA 技术沉默
矮牵牛查尔酮合成酶基因［J］．园艺学报． 2012，39
( 12) : 2491-2498．
［16］ Marchler-Bauer A，et al． CDD: a Conserved Domain
Database for the functional annotation of proteins
［J］． Nucleic Acids Ｒesports，2011，39: 225-229．
［17］ Jez JM，Bowman ME，Noel JP． Expanding the biosyn-
thetic repanoire of plant type III polyketide synthases
by altering starter molecule specificity［J］． Proe Natl
Acad Sci USA，2002，99: 531 9-5324．
［18］ Kim SH，Mizuno K，Fujimura T． Ｒegulated expression
of ADP-glucose pyrophosphorylase and chalcone syn-
thase during root development in sweet potato［J］．
Plant Growth Ｒegulation，2002，38: 173-179．
(下转第 21 页)
·11·
韩立敏，等:菘蓝查尔酮合成酶基因(IiCHS)的克隆及其生物信息学分析
储藏量小的种类要加强保护，控制对它们的开发。
陕西秦岭乌头植物的多数种类具有药用价值，要
加强该属资源的植物化学、药理作用和毒理研究，
目前研究较多的集中在乌头、松潘乌头、太白乌
头、甘青乌头、铁棒锤、瓜叶乌头、西伯利亚乌头等
种类，其他种类研究未见报道，需要进一步探索。
近年来，毛茛科花卉日益受到市场的重视，乌头属
野生花卉花型别致，花色鲜艳，可用于园林绿化、
盆栽观赏及切花，是宝贵的蓝色花卉基因库。目
前，一些欧洲国家及以色列、日本等花卉发达国
家，已培育出白、黄、粉红等各种颜色的观赏乌头
栽培品种，而我国仅有云南农业大学、云南农业科
学院、昆明市东川区农科所、北京林业大学等对川
乌、黄花乌头、北乌头、华北乌头等进行了该领域
的研究，本研究将为陕西秦岭乌头属植物资源引
种驯化、切花品种筛选和种质资源保护等方面的
研究奠定基础。
参 考 文 献:
［1］ 中国科学院西北植物研究所． 秦岭岭植物志［M］．
北京: 科学出版社，1983，252-263．
［2］ 杨长花，王凤，顾国强，等．陕西乌头属药用植物资
源调查研究［J］．现代中医药，2006，26( 01) : 64-65．
［3］ 杨长花，王西芳．秦岭产 4 种乌头块根的生物碱资
源研究［J］．西北药学杂志，2008，23( 05) : 303-305．
［4］ 杨长花，王西芳．秦岭产 4 种乌头地上部分生物碱
含量测定［J］． 西北药学杂志，2008，23 ( 06 ) : 364-
365．
［5］ 陈冀胜，郑硕．中国有毒植物［M］，北京: 科学出版
社，1987，146-150．
［6］ 张志英，李继瓒，陈彦生．陕西种子植物名录［M］．
西安: 陕西旅游出版社，2000，112-124．
［7］ 何明勋．资源植物学［M］．上海:华东师大出版社，
1995: 180-182．
［8］ 李梦然，曲玮，梁敬钰．乌头属化学成分和药理作用
研究进展［J］．海峡药学，2010，22( 04) : 1-6．
［9］ 符华林．我国乌头属药用植物的研究概况［J］．中药
材，2004，27( 02) : 149-152．
［10］ 张义伟．铁棒锤浸膏对大鼠佐剂性关节炎治疗作
用的研究［J］．宁夏医科大学学报，2009，31 ( 01) :
9-10．
［11］ 苏帆．高乌甲素的临床应用及研究进展［J］． 实用
疼痛学杂志，2009，5( 01) : 50-54．
［12］ 舒鹤，牛学才，贾恩礼．乌头类药物抗肿瘤作用研
究［J］．中外健康文摘，2009，6( 18) : 258-259．
［13］ 张祥，崔卫军，周玲．陕西太白山国家自然保护区
“太白七药”种质资源及其分布［J］． 陕西林业科
技，2012，( 03) : 7-13．
［14］ 饶冉．乌头属药用植物研究进展［J］． 安徽农业科
学，2012，40( 29) : 14227-14230．
［15］ 艾嫦，朱妍妍，赵长琦．乌头属植物化学成分、药理
作用及其内生菌的研究进展［J］．天然产物研究与
开发，2012，( 24) : 248-259．
［16］ 陈凤娥． 铁棒锤的研究进展［J］． 安徽农业科学，
2007，35( 32) : 10353，10360．
［17］ 张宏利，韩崇选，程明，等． 30 种植物杀鼠活性研究
［J］．西北植物学报，2007，27( 12) : 2545-2550．
［18］ 徐姗，董必焰．华北地区部分乌头属植物资源调查
［J］．江苏农业科学，2009，( 06) :
櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨櫨
421-425．
(上接第 11 页)
［19］ Olof Emanuelsson，Henrik Nielsen，Soren Brunak ，et
al． Predicting subcellular localization of proteins
based on their N-terminal amino acid sequence［J］．
Journal of Molecular Biology，2000，300: 1005-1016．
［20］ 张太奎，刘峥，朱芳明，等． 10 种观赏植物查尔酮合
成酶基因生物信息学分析［J］． 西部林业科学．
2013，42( 05) : 63-67．
［21］ Petersen TN，Brunak S，von Heijne G，and Nielsen H．
SignalP 4． 0: discriminating signal peptides from
transmembrane regions［J］． Nature Methods，2011，
( 08) : 785-786．
［22］ Pollastri G，Martin AJM，Mooney C，et al． Accurate
prediction of protein secondary structure and solvent
accessibility by consensus combiners of sequence and
structure information［J］． BMC Bioinformatics，2007，
( 8) : 201．
［23］ Arnold K，Bordoli L，Kopp J，and Schwede T． The
SWISS-MODEL Workspace: A web-based environ-
ment for protein structure homology modelling［J］．
Bioinformatics，2006，( 22) : 195 -201．
［24］ 杨益淼．红松查尔酮合成酶基因( PkCHS) 克隆与
外源因素对其表达的影响［D］． 2013 年哈尔滨工
业大学硕士毕业论文 1-2．
［25］ 李冬梅，朱根发，操君喜，等．兜兰查尔酮合成酶基
因的克隆与表达分析［J］．热带作物学报． 2012，33
( 04) : 655-662．
［26］ 阮美颖，万红建，叶青静，等．番茄查尔酮合成酶基
因的鉴定及生物信息学分析［J］． 分子植物育种．
2013 ，11( 03) : 379-384 ．
·12·
李璟琦，等:陕西秦岭乌头属植物资源及其利用研究