全 文 ：窄叶菘蓝体细胞无性系根腐病抗性的 RAPD分析
陈桂平 , 客绍英 , 陈玉芹
(唐山师范学院生命科学系 ,河北唐山 063000)
摘要:在一定浓度根腐病菌粗毒素的胁迫下 ,对窄叶菘蓝体细胞无性系植株的根腐病抗性进行了筛选 ,初步获得
了具有表型抗性的植株。取同一个无性系的窄叶菘蓝植株及其亲本 , 提取其 DNA, 经过检测后进行 RAPD分析。通
过对 40个引物筛选和反应参数优化 , 选用 20个随机引物对 DNA样品进行 RAPD扩增 , 12个获得较为清晰的扩增谱
带。对 RAPD扩增结果的分析表明 ,无性系植株的遗传背景一致性很好 ,但也发生了 DNA水平的变异 ,为进一步从分
子水平鉴定菘蓝抗性突变体和分离抗病基因提供理论依据。
关键词:菘蓝;根腐病;RAPD;无性系
中图分类号:S567.23+9.034 文献标志码:A 文章编号:1002-1302(2009)06-0060-02
收稿日期:2009-04-01
基金项目:河北省唐山市科技局资助项目(编号:06234501A-9)。
作者简介:陈桂平(1972—),女 ,河北泊头人 ,硕士 ,副教授 ,主要从事
植物分子遗传学研究与教学工作。 Tel:(0315)3863212;E-mail:
chenguiping968@sohu.com。
菘蓝(Isatistinctoriavar.indigotica)是一种有重要开发前
景的药用植物 [ 1] ,近年来 ,菘蓝在种植过程中常患根腐病 ,严
重影响产量和品质 。利用植物组织培养技术筛选抗病突变
体 ,一般将病原菌毒素加入培养基中作为选择因子 ,正向筛选
抗病细胞和植株 [ 2] 。本文运用 RAPD技术分析经一定浓度根
腐病菌粗毒素处理的窄叶菘蓝亲本及无性系的基因组 DNA,
为进一步分离抗性基因和培育抗病品种打下基础 。
1 材料与方法
1.1 试验材料
挑选饱满的窄叶菘蓝种子 ,流水浸泡 3h。在超净工作台
上无菌水冲洗 3 ～ 4次 , 70%乙醇表面消毒 30 s, 0.1%氧化汞
消毒 6 ～ 12 min, 无菌水冲洗 4次 , 接种于 1 /2MS培养基 。
5 ～ 7 d幼苗长至 4 ～ 5cm时 ,切取下胚轴 ,转接入继代培养基
中促芽;将幼芽接入 MS培养基中留作亲本 。 21 d继代 1次 ,
4次后壮苗 21d,然后接入含有一定浓度根腐病粗毒素的生
根培养基 ,待植株表型出现差异后(约 20 d)即可选取 1个无
性系及其亲本植株的根作为试验材料 。最后选取来自同一颗
种子 ,经过 10-3个 /ml的孢子菌悬液所对应的粗毒素侵染过
的无性系 Z16的苗 (由第 16颗种子繁殖成的无性系 )作
RAPD分析 。
根腐病菌由患根腐病的菘蓝植株的根部分离获得 ,经初
步鉴定属半知菌亚门尖孢镰刀菌属 。
1.2 试剂
TaqDNA聚合酶 、dNTPs、DNA标准分子量均购自北京宝
生生物有限公司;随机引物购自北京鼎国昌盛生物技术有限
责任公司;其他化学试剂均为国产分析纯 。
1.3 模板 DNA的提取及浓度测定
菘蓝总 DNA提取采用改良的 SDS微量提取法 [ 3] 。用紫
外分光光度计测定浓度并稀释成 50ng/μl,用于 PCR扩增 。
1.4 RAPD扩增及电泳分析
模板 DNA2μl, 0.4μmol/L引物 1μl, 10×PCR缓冲液 2
μl, 2.5mmol/LdNTPs1.6μl, Taq酶 0.5μl(1 U), SDW12.9
μl。反应程序为 94℃预变性 5min;94℃变性 1 min, 34 ℃退
火 1 min, 72℃延伸 1 min, 35个循环;最后 72 ℃延伸 10 min。
反应完成后取 10 μl扩增样品进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳分
析 ,在凝胶成像系统(美国 Bio-Red公司)上观察并照像 。
2 结果与分析
2.1 窄叶菘蓝幼苗性状分析
所选无性系植株 Z16共 7株 ,编号为 0、1、2、3、4、5、6。 0
号为亲本 ,其他来源于 0号种子 。对菘蓝幼苗进行外部性状
及生长状况观察显示:亲本 0号性状为 7片叶 ,生长状况良
好;生长状况最好的是 5、6号 , 2个植株的形状差异不明显 ,
生长的叶片分别为 12片与 10片 ,株高相同;2号植株稍逊于
5、6号 ,具有 10片叶 ,株高与前者相同但叶片发黄;1号植株
稍逊于 2号 ,具有 8片叶 ,叶片发黄;3、4号情况基本相同 ,生
长状况最差 ,分别只有 5片和 6片叶 ,且叶片发黄程度较高 ,
有些叶片已发生萎蔫 。总体趋势为:5号 、6号 >2号 >1号 >
0号 >3号 、4号 。
2.2 窄叶菘蓝幼苗 DNA的提取及分析
按改良的 SDS法对菘蓝嫩叶 DNA进行抽提 ,经 0.8%琼
脂糖凝胶电泳检测 ,紫外光下进行观察拍照 ,见图 1。结果显
示菘蓝的 DNA主带基本无弥散 ,较完整 ,可用于进一步分析 。
2.3 引物的筛选及 DNA扩增结果
7份样品材料对 A和 D系列的 40个 10 bp随机引物进
行扩增筛选 , 20个引物扩增产物有条带(表 1), 12个有效引
物扩增效果较好 。不具有多态性的 8个引物分别是 A4、A1、
A12、A5、A18、D3、D10、D19, 具有差异带谱的引物为 A19、
A10、D5、D7。
图 2为引物 A18的扩增结果 , 7个样品电泳带谱是相同
的 ,都有 1 000 bp和 2 200 bp2条主亮带 ,其他条带基本一
致 。图 3是引物 D7的扩增结果 , 7个样品中 2、3、4、5号有相
同带谱 ,并且比亲本 0号多 2个条带 , 分别是 750 bp和
500bp。1、6号比亲本多 1条带 ,为 750bp。
—60— 江苏农业科学 2009年第 6期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2009.06.054
表 1 RAPD分析所用随机引物编号和序列
A组引物 碱基序列(5※ 3) D组引物 碱基序列(5※3)
A1 CAGGCCCTTC D3 GTCGCCGTCA
A3 AGTCAGCCAC D5 TGAGCGGACA
A4 AATCGGGCTG D6 ACCTGAACGG
A5 AGGGGTCTTG D7 TTGGCACGGG
A8 GTGACGTAGG D10 GGTCTACACC
A9 GGGTAACGCC D13 GGGGTGACGA
A10 GTGATCGCAG D19 CTGGGGACTT
A12 TCGGCGATAG
A13 CAGCACCCAC
A15 TTCCGAACCC
A17 GACCGCTTGT
A18 AGGTGACCGT
A19 CAAACGTCGG
3 讨论
利用根腐病粗毒素液为筛选剂筛选窄叶菘蓝抗根腐病突
变体是进行菘蓝抗病育种的重要手段之一 。利用 RAPD技术
对这些性状能够早期选择 ,节省大量的人力 、物力和时间 ,提
高育种的效率 。并且在 RAPD分析中 ,可以发现表现型正常
的无性再生系在基因组 DNA上有可能发生变异 ,为认识无性
系变异提供了更为确凿的证据 。本试验通过组织培养 ,经丛
生芽途径建立了多个窄叶菘蓝体细胞无性系 。在根腐病粗毒
素的胁迫下 ,正向筛选抗病植株 ,初步获得了具有表型抗性的
植株 。以表型抗性植株为试验材料 ,利用 RAPD技术对体细
胞无性系进行分析 ,找出无性系植株与亲本植株的差异条带 ,
推断与根腐病抗性的关系。
DNA样品的 RAPD检测结果表明 ,多数引物对无性系 7
棵植株的扩增条带没有差异 ,说明同一无性系植株的遗传基
础相近 ,基因组 DNA有高度的同源性;引物 A19、A10、D5、D7
对无性系 Z16 7棵植株的扩增条带出现多态性 ,说明在继代
过程中会发生一定程度的 DNA变异 。这些差异条带可能与
根腐病的抗性有关 。孙光祖等利用 RAPD技术验证了小麦抗
赤霉病突变体选育 [ 4] 。 Casler等利用 RAPD技术测出了匍匐
剪股颖无性系之间的差异 [ 5] 。张小红等利用 RAPD技术对 2
个小麦抗赤霉变异系的分析 ,证实了差异的 2个片段与赤霉
病抗性有关 [ 6] 。因此 ,可以肯定 ,利用 RAPD技术筛选和鉴定
抗病突变体是一种有效的方法 ,但是真核生物 DNA分子大部
分是调节基因或重复序列或内含子 ,能够表达的基因序列很
少 ,扩增量可能达不到检测的水平 ,所以 RAPD的多态性不直
接等同于基因水平上的多态性 [ 7 ] 。这些差异带是否在基因
内 ,是内含子还是一些不表达的重复序列 ,与根腐病抗性是否
有关 ,还有待于进一步研究 。
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