全 文 ：2009年 12月
2009, 31(4):522 -526
中国油料作物学报
Chinesejournalofoilcropsciences
芥蓝与菘蓝族间原生质体融合及杂种愈伤分析
涂玉琴 1, 2 ,孙　建 2 ,葛贤宏1 ,张雪丽 1 ,李再云 1＊
(1.作物遗传改良国家重点实验室 ,华中农业大学植物科学与技术学院 武汉 430070;
2.江西省农业科学院作物研究所 ,油料作物重点实验室 南昌 330200)
　　摘要:运用聚乙烯乙二醇(PEG)和二甲基亚砜(DMSO)共同诱导融合的方法 , 成功获得芥蓝与菘蓝原生质体
融合的再生愈伤。利用 9对 SRAP随机引物对亲本和再生愈伤 DNA进行扩增以鉴别再生愈伤的基因组成 , 结果表
明:在再生愈伤的 DNA条带中 , 与供体菘蓝相同的带占 93.07% ～ 94.16%, 与受体芥蓝相同的条带占 70.24% ～
75.78%, 并有少量新增带和缺失带出现 ,再生愈伤的 DNA带型为双亲的叠加 , 为真正的族间杂种愈伤。类平均法
(UPGMA)聚类分析表明 , 5个杂种愈伤明显聚在一起 ,其遗传组成十分相似 , 与菘蓝的遗传关系较近 , 而与芥蓝的
遗传关系稍远。
关键词:芥蓝;菘蓝;原生质体融合;族间杂种愈伤;SRAP
中图分类号:S565.403　　文献标识码:A　　文章编号:1007-9084(2009)04-0522-05
ProductionandanalysisofintertribalhybridcalifromprotoplastfusionbetweenIsatisindigoticaFort.
andBrassicaoleraceaL.var.alboglabraBailey
TUYu-qin1, 2 , SUNJian2 , GEXian-hong1 , ZHANGXue-li1 , LIZai-yun1＊
(1.NationalKeyLaboratoryofCropGeneticImprovement, ColegeofPlantScienceandTechnology,
HuazhongAgriculturalUniversity, Wuhan430070 , China;2.CropsResearchInstitute, KeyLaboratory
ofOilCrops, JiangxiAcademyofAgriculturalSciences, Nanchang330200 , China)
Abstract:IntertribalhybridcalibetweenIsatisindigoticaFort.andBrasicaoleraceaL.var.alboglabraBailey
wereinducedusingpolyethyleneglycol(PEG3350)anddimethylsulphoxide(DMSO).SRAPanalysiswasmade
toidentifygenomiccomponentofhybridcaliusing9 pairsofrandomlyselectedprimers, theresultsshowedthat
93.07% ～ 94.16%bandsfromthecaliwerethesametothatofI.indigoticadonor, 70.24% ～ 75.78%toB.albo-
glabrareceptor, andtherewereasmalamountofnovelbandsandabsentbandsfromanyoftheparents, indicating
thatthesecalihadhybriditynature.ClusteranalysisbasedonSRAPmarkersshowedgenomicsimilarityofhybrid
cali, andtheircloserdistanttoI.indigoticadonorthantoB.alboglabra.
Keywords:BrasicaoleraceaL.var.alboglabraBailey;Isatisindigotica;Protoplastfusion;Intertribalhybrid
calus;SRAP
收稿日期:2009-06-10
基金项目:国家自然科学基金(30571033)
作者简介:涂玉琴(1981-),女 ,江西高安人 ,博士 ,助理研究员 ,研究方向为油菜遗传育种
＊通讯作者:李再云 ,博士 ,教授 , E-mail:Lizaiyun@mail.hzau.edu.cn
　　栽培作物的远缘野生种蕴含有大量的抗耐性和
优异品质等基因 ,是一个有利用价值的潜在基因库 。
随着作物遗传改良的不断深入 ,远缘野生种优异基
因的利用也越来越多地受到关注 。然而 ,由于受精
前后的杂交不亲和 ,通过有性杂交将这些野生种的
有利基因转移到各种作物中是非常困难的 。而通过
原生质体融合进行体细胞杂交为外源基因的转移提
供了一种有效的方法 ,它能克服有性杂交的不亲和
生殖障碍 [ 1] ,并将两个远缘亲本的核基因组和细胞
质基因组组合在一起 [ 2] 。芸薹属植物是最早进行
体细胞杂交的种属之一 。通过体细胞杂交已经成功
获得芸薹属作物与很多远缘物种之间的属间甚至是
族间杂种 ,使很多性状得到改良 ,如对不同病虫害的
抗性 、脂肪酸含量的改良和细胞质雄性不育系创建
等 [ 3 ～ 6] 。
菘蓝 (IsatisindigoticaFort.)属于十字花科
(Cruciferae)菘蓝族(Isatideae)二年生草本植物 ,是
一种传统的中药材和染料植物 ,具有抗烟草花叶病
毒 [ 7]和抗菌核病 [ 8]的抗性 ,体细胞再生植株的能力
很强[ 9] 。菌核病是由核盘菌引起的一种真菌性病
害 ,主要导致植物茎秆腐烂 ,是我国芸薹属作物中最
严重的病害之一 。芥蓝(BrassicaoleraceaL.var.al-
boglabraBailey)是芸薹属中很重要的栽培作物 ,将
菘蓝中的有利基因和性状导入到芥蓝中 ,可望使芥
蓝的品质和抗性得到改良 ,这对于芥蓝的种质创新
和遗传改良有着非常重要的作用。
1　材料与方法
1.1　试验材料
试验用芥蓝为 “迟花芥蓝 ”。芥蓝和菘蓝种子
由华中农业大学油菜育种研究室提供 ,为辅助授粉
连续自交多代的纯系 。
1.2　方法
1.2.1　叶肉原生质体的分离和提取　分别将芥蓝
与菘蓝的种子用 70%的酒精表面消毒 1 ～ 2min,然
后用 0.1%的 HgCl2溶液浸泡消毒 15min左右 ,最后
用无菌水冲洗 3次 ,接种在 MS培养基上 ,置于组织
培养室发芽(温度 25℃,光周期为 16h)。根据 Han-
sen等[ 10]的程序 ,利用改良的酶解溶液 [ 11]分离并纯
化幼嫩叶片的原生质体。
1.2.2　原生质体的对称融合与愈伤形成　在供受
体原生质体酶解分离之后 ,将供体菘蓝的原生质体
用碘乙酰胺(IOA, 0.62mg/mL)溶液处理 15min左
右 ,以抑制未融合的原生质体提前分裂 ,融合方法参
照 Hansen等的方法进行 [ 3] , 利用聚乙烯乙二醇
(PEG3350)和二甲基亚砜(DMSO)共同诱导融合 。
融合后参照 Peletier等[ 12]和 Hansen等的方法 [ 3] ,
在固液双层培养基 PelB中暗培养 20 ～ 30d左右 ,
待细胞团增大 ,形成肉眼可见的小愈伤组织时 ,将其
挑出转移到愈伤组织增殖培养基 PelC中并转为光
照培养 ,待小愈伤稍大后 ,挑选颜色鲜艳 ,大小合适
的愈伤组织转入新鲜的分化培养基 PelE中继续培
养 。
1.2.3　DNA提取　取双亲幼嫩叶片和从培养基
PelC、PelE中切取幼嫩愈伤组织按照 Doyle等 [ 13]
的 CTAB改良法提取植物基因组总 DNA,用 RNase
A消化除去 RNA,采用紫外分光核酸测定仪测定
DNA质量和浓度 ,并于 1%的琼脂糖凝胶电泳检测
其质量 ,最后稀释到 50ng·μL-1于 -20℃冰箱保存
备用 。
1.2.4　SRAP扩增与电泳检测分析　参照 Li等[ 14]
SRAP引物 、扩增体系和 PCR程序进行 DNA分析 ,
其中引物由上海生工公司合成 。 PCR产物的多态
性展示用 6%的聚丙烯酰胺凝胶进行分离和银染显
影。统计清晰且易辨认的 SRAP条带 ,在同一位点
上有带记为 “ 1”,没有带记为 “0”。用 NTSYS聚类
软件通过相似性系数计算 ,按照类平均法(UPGMA)
进行聚类分析 。
2　结果与分析
2.1　愈伤的再生与培养
利用培养 20d左右的新叶进行叶肉原生质体的
提取 ,分离出的完整叶肉原生质体为透明的绿色球
状(图 1, a),融合操作中可明显观察到两个细胞的
融合过程(图 1, b)。融合操作完成后 ,将融合物于
固液双层培养基 PelB中暗培养 ,前后进行操作 13
次 ,获得融合培养物 104皿 , 30d左右之后共 7皿培
养物(6.73%)中出现肉眼可见的乳白色微小愈伤
颗粒 ,每皿再生的小愈伤颗粒数量较多 ,在 10个以
上 ,直径 0.02 ～ 0.05cm左右 。不同培养皿中融合
物出现可见愈伤的时间在 25 ～ 45d之间 ,每个培养
皿中愈伤不断出现的时间可持续 15d左右。在获得
的 7皿有再生愈伤的培养物中 ,大多数再生微小愈
伤颗粒在出现 5d左右便严重褐化死亡 ,极少数愈伤
能够生长至利用镊子可进行转移操作 ,直径约 0.05
a:有活性的叶肉原生质体;b:正在融合的原生质体;
c:在 PelC培养基上的再生愈伤;d:在 PelE
培养基上褐化了的再生愈伤。 (标尺 1.5cm)。
a, viableprotoplasts;b, protoplastsunderfusion;
c, caliinPelCmedium;d, browncaliin
PelEmedium.(Bar= 1.5cm)
图 1　原生质体融合过程与再生愈伤
Fig.1　Processofprotoplastsfusionandcallusformation
523涂玉琴等:芥蓝与菘蓝族间原生质体融合及杂种愈伤分析
～ 0.1cm。将后者转移至固体增殖培养基 PelC中
光培养 , 10 ～ 15d之后多数原乳白色小愈伤生长为
0.5 ～ 1.5cm左右的晶莹绿色团状愈伤(图 1, c)。
将绿色团状愈伤转移至固体分化培养基 PelE中 ,
10 ～ 15d后所有愈伤褐化严重(图 1, d),没有成功
获得分化的芽状物。
2.2　再生愈伤 DNA的 SRAP分析
利用 9对 SRAP引物对芥蓝 、菘蓝以及随机挑
取的 5个再生愈伤 DNA进行 PCR扩增 ,扩增结果
显示:9对引物共扩增出芥蓝 、菘蓝和 5个再生愈伤
的 DNA条带分别为 289、274和 349、352、348、348、
364条 ,再生愈伤的 DNA条带包括与双亲相同的亲
本带和与双亲不同的新增带(图 2)。 5个再生愈伤
的 DNA条带中与菘蓝相同的带有 255 ～ 258条 ,占
总带数的 93.07% ～ 94.16%;与芥蓝相同的带有
203 ～ 219条 ,占总带数的 70.24% ～ 75.78%;新增
带有 9 ～ 13条 ,占 2.56% ～ 3.57%。另外 ,再生愈
伤的 DNA带与双亲比较还存在缺失带 ,其中缺失菘
蓝的有 16 ～ 19条带 ,占 5.84% ～ 6.93%,缺失芥蓝
的有 70 ～ 86条带 ,占芥蓝 DNA总带的 24.22% ～
29.76%;双亲均缺失的 DNA条带有 5 ～ 6条 。可
见 ,再生愈伤的 DNA组成基本上是菘蓝和芥蓝
DNA的总和 ,说明 5个再生愈伤在 DNA组成上是
菘蓝和芥蓝的真正杂种 ,且杂种愈伤的 DNA组成偏
向菘蓝 ,并伴有双亲 DNA片段的重组和部分片段的
缺失而导致新增带和缺失带的出现。
(C和 I分别表示芥蓝和菘蓝)
(C, B.alboglabra;I, I.indigotica)
图 2　5对 SRAP引物在亲本与再生愈伤中的扩增结果
Fig.2　AmplificationprofilesofparentsandhybridcalliwithfivepairsofSRAPprimer
2.3　聚类分析
NTSYS软件分析表明 , 5个杂种愈伤相互间的
遗传相似系数为 0.931 ～ 0.987,与菘蓝的遗传相似
系数为 0.715 ～ 0.762,而与芥蓝的遗传相似系数为
0.483 ～ 0.521。对遗传相似系数进行类平均法
(UPGMA)聚类分析 ,结果显示 5个再生愈伤明显聚
(C和 I分别表示芥蓝和菘蓝)
(C, B.alboglabra;I, I.indigotica)
图 3　UPGMA聚类图
Fig.2　UPGMAclusterofhybridcaliandtwo
parentsbasedonSRAPmarkers
在一起 ,并与菘蓝聚得更近 ,与芥蓝聚得远一些(图
3)。由此可见 , 5个杂种愈伤的遗传组成十分相似 ,
与菘蓝的遗传关系更近 ,与芥蓝的遗传关系较远 。
3　小结与讨论
3.1　获得芥蓝与菘蓝原生质体融合的族间杂种愈伤
芥蓝(B.oleraceaL.var.alboglabraBailey)是甘
蓝 (B.oleraceaL.)的变种之一[ 15] , 自 1982 年
Schenck等 [ 16]首次获得甘蓝与白菜的体细胞杂种以
来 ,芥蓝等甘蓝类植物先后与甘蓝型油菜 [ 17] 、Mori-
candiaarvensis[ 18] 、萝卜[ 19]等进行了原生质体融合
并获得了体细胞杂种植株。本研究利用 PEG和
DMSO共同诱导融合的方法 ,首次成功获得芥蓝与
菘蓝原生质体融合的再生愈伤 ,随机挑取的 5个再
生愈伤 ,经 SRAP分子标记验证均为芥蓝与菘蓝的
族间杂种 。没有亲本原生质体的再生 ,这可能与对
菘蓝原生质体进行了 IOA的预处理[ 11]和芥蓝原生
质体容易褐化有关 [ 20, 21] , IOA处理可使原生质体生
长钝化[ 11, 22] ,有效阻止了菘蓝自身原生质体的再生
和自身融合。 Tu等 [ 11]在菘蓝与白菜的原生质体融
524 中国油料作物学报　2009, 31(4)
合中利用 IOA对菘蓝进行预处理 ,有效地阻止了菘
蓝自身原生质体的再生和自身融合 。而王晓佳
等 [ 20, 21]研究认为甘蓝叶肉原生质体培养时多数原
生质体在形成可见的微愈伤颗粒后一周左右便明显
褐化 ,不能继续细胞分裂。因此 ,本研究中固液双层
培养基 PelB中大量微小愈伤颗粒严重褐化致死 ,
可能是芥蓝自身原生质体再生和自身融合几乎没有
在增殖培养基 PelC和分化培养基 PelE中存在的
原因。此外 ,本研究中芥蓝与菘蓝的叶肉细胞原生
质体融合的再生愈伤在双层培养基 PelB和分化培
养基 PelE中褐化严重。已有的研究认为褐化是甘
蓝类植物原生质体培养和原生质体融合中普遍发生
的现象 [ 23] ,培养过程中细胞代谢会产生多酚类化合
物的积累 ,而多酚类化合物易氧化为醌类物质 ,从而
抑制细胞团和小愈伤组织的进一步生长 ,甚至褐化 、
解体和死亡 [ 23] 。通过加入一定浓度的抗坏血酸或
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或稀释 、转换新培养基来抑
制酚类物质形成或缓解酚类物质的积累 ,在甘蓝类
植物的原生质体培养中能够有效防止褐化 [ 21, 23 ～ 25] ,
这为芥蓝与菘蓝原生质体融合杂种愈伤的分化成苗
提供了方法参考 ,值得进一步研究。
3.2　关于杂种愈伤的基因组构成
利用 SRAP对亲本和再生愈伤 DNA进行扩增 ,
发现杂种愈伤的 DNA带型尽管多数来自两个亲本 ,
但也有 5.84% ～ 6.93%的菘蓝缺失带 、24.22% ～
29.76%的芥蓝缺失带和 2.56% ～ 3.57%的新增
带 ,这表明杂种愈伤的基因组构成并非简单的双亲
基因组相加 ,还存在复杂的基因组变化 ,这和白菜与
菘蓝体细胞杂种的分析结果相似[ 11] 。基因组的这
些变化的具体机制还有待于进一步研究和探讨 ,可
能与物种间的基因重组 、基因互作以及组织培养等
原因有关。在多种植物的自然形成或是合成的多倍
体中都观察到了不同的遗传起源和表观遗传的变
化 ,例如序列消除 、染色体重排 、基因沉默 、DNA的
甲基化和转座子的激活等 [ 26, 27] 。这些变化出现在
杂种的 F1 ,或者发生在基因组加倍期间或之后 [ 28] ,
从而导致杂种的基因组结构发生改变 [ 29] 。
参考文献:
[ 1] 　GlimeliusK, FahlessonJ, LandgrenM, etal.Genetransfer
viasomatichybridizationinplants[ J] .TrendsBiotech,
1991, 9:24-30.
[ 2] 　LiuJH, XuXY, DengXX.Intergenericsomatichybrid-
izationanditsapplicationtocropgeneticimprovement
[ J] .PlantCellTissueOrgCult, 2005, 82:19-44.
[ 3] 　HansenLN, EarleED.SomatichybridsbetweenBrassica
oleraceaL.andSinapisalbaL.withresistancetoAlternar-
iabrassicae(Berk.)Sacc[ J] .TheorApplGenet, 1997,
94:1 078-1 085.
[ 4] 　SigarevaM, RenJ, EarleED.Introgressionofresistance
toAlternariabrassicicolafromSinapisalbatoBrassicaol-
eraceaviasomatichybridizationandback-crosses[ J] .
CruccifNewsl, 1999, 21:135-136.
[ 5] 　Hu, Q, HansenLN, LaursenJ, etal.Intergenerichybrid
betweenBrassicanapusandOrychophragmusviolaceus
containingtraitsofagronomicimportanceforoilseedrape
breeding[ J] .TheorApplGenet, 2002, 105:834-840.
[ 6] 　WangYP, SonntagK, RudlofE.Developmentofrape-
seedwithhigherucicacidcontentbyasymmetricsomatic
hybridizationbetweenBrassicanapusandCrambeabys-
sinica[ J] .TheorApplGenet, 2003, 106:1 147-1 155.
[ 7] 　王启燕 ,王先彬.抗 TMV感染物质 -板蓝根 [ J] .华北
农学报 , 1988, 3(4):92-95.
[ 8] 　赵合句 ,黄永菊 , 王玉叶.油菜与菘蓝属间杂交育种研
究 [ J] .中国农业科学 , 1994, 27(3):89-91.
[ 9] 　HuQ, AndersenSB, HansenLN.Plantregenerationfrom
mesophylprotoplastsinIsatisindigotica[ J] .PlantCell
TissueandOrgCult55, 1998, 2:155-157.
[ 10] 　HansenLN, EarleED.Regenerationofplantsfrompro-
toplastsofrapidcyclingBrassicaoleraceaL.[ J] .Plant
CelRep, 1994, 13:335-339.
[ 11] 　TuYQ, SunJ, LiuY, etal.Productionandcharacteriza-
tionofintertribalsomatichybridsofRaphanussativus
andBrassicarapawithdyeandmedicinalplantIsatisin-
digotica[ J] .PlantCellReports, 2008, 27:873-883.
[ 12] 　PeletierG, PrimardC, VedelF, etal.Intergenericcyto-
plasmichybridizationinCruciferaebyprotoplastfusion
[ J] .MolGenGenet, 1983, 191:244-250.
[ 13] 　DoyleJJ, DoyleJL.ArapidDNAisolationprocedure
forsmallquantitiesoffreshleaftissue[ J] .Phytochem
Buletin, 1987, 19:11-15.
[ 14] 　LiG, QuirosCF.Sequence-relatedamplifiedpolymor-
phism(SRAP), anewmarkersystembasedonasimple
PCRreaction:itsapplicationtomappingandgenetag-
ginginBrasica[ J] .TheorApplGenet, 2001, 103:455
-461.
[ 15] 　周太炎.中国植物志(33卷)[ M] .北京:科学出版社 ,
1987.14-31.
[ 16] 　SchenckHR, RobblenG.Somatichybridsbyfusionof
protoplastsfromBrassicaoleraceaandB.campestris[ J] .
ZPflanzenzuchtg, 1982, 89:278-288.
[ 17] 　SundbergEU, LagercrantZ, GlimeliusK.Efectsofcell
typeusedforfusiononchromosomeeliminationand
chloroplastsegregationinBrassicaoleracea(+)Brassi-
525涂玉琴等:芥蓝与菘蓝族间原生质体融合及杂种愈伤分析
canapushybrids[ J] .PlantSci, 1991, 78:89-98.
[ 18] 　IshikawaS, BangSW, KanekoY, etal.Productionand
characterizationofintergenericsomatichybridsbetween
MoricandiaarvensisandBrasicaoleracea[ J] .Plant
Breed, 2003, 122:233-238.
[ 19] 　YamanakaH, KuginukiY, KannoT, etal.Efficientpro-
ductionofsomatichybridsbetweenRaphanussativusand
Brassicaoleracea[ J] .JpnJBreed, 1992, 42:329-339.
[ 20] 　王晓佳 ,宋　明 , 陈世儒 ,等.甘蓝 CMS系的原生质体
培养与植株再生 [ J] .西南农业大学学报 , 1991, 13
(4):399-404.
[ 21] 　王晓佳 ,陈世儒 , 宋　明.皱叶甘蓝的原生质体培养
与植株再生 [ J] .植物学报 , 1993, 35(2):107-114.
[ 22] 　HansenLN, EarleED.TransferofresistancetoXan-
thomonascampestrisintoBrassicaoleraceaL.byproto-
plastfusion[ J] .TheorApplGenet, 1995, 91:1 293 -
1 300.
[ 23] 　薛红卫 , 卫志明 , 许智宏.甘蓝的原生质体培养及遗
传转化 [ J] .植物学通报 , 1995, 12(增刊):7-16.
[ 24] 　卫志明 , 许智宏.花椰菜叶肉原生质体培养再生植株
[ J] .园艺学报 , 1992, 12(3):171-175.
[ 25] 　卫志明 , 许智宏.影响花椰菜下胚轴原生质体培养和
植株再生的因素 [ J] .植物生理学报 , 1990, 16(4):
394-400.
[ 26] 　SongK, LuP, TangK, etal.Rapidgenomechangein
syntheticpolyploidsofBrasicaanditsimplicationsfor
polyploidyevolution[ J] .ProcNatlAcadSciUSA, 1995,
92:7 719-7 723.
[ 27] 　LiuB, WendelJF.Epigeneticphenomenaandtheevolu-
tionofplantalopolyploids[ J] .MolPhylEvol, 2003, 29:
365-379.
[ 28] 　MaXF, GustafsonJP.Genomeevolutionofpolyploids:
aprocessofcytologicalandgeneticdiploidization[ J] .
CytogenetGenomeRes, 2005, 109:236-249.
[ 29] 　MadlungA, ComaiL.Theefectofstressongenomereg-
ulationandstructure[ J] .AnnBot, 2004, 94:481-495.
读 《长江蔬菜 》获一本万利
种植者致富宝典　管理者决策参谋　经营者生财指南
一本权威的精品期刊:报道全国蔬菜种植新技术 、名优品种 、管理经验和致富
信息;科学权威 、针对性强 、通俗易懂;荣获第三届国家期刊奖 、全国优秀农业期刊
一等奖 ,全国中文核心期刊 。
一本实用的超值期刊:主要读者为蔬菜种植专业户 、技术推广管理人员和种
子经销商 。创刊 25年 ,发行量稳居全国同类期刊首位 ,为读者带来丰厚经济回
报 。
欢迎订阅 2010年 《长江蔬菜 》技术版(上半月刊)全国各地邮政局均可订阅 ,
邮发代号:38-129。每月一刊 ,每册定价 4.80元 ,全年 57.60元 。
地　　址:湖北省武汉市万松园路 15号
邮　　编:430022
征订电话:(027)85776183 (传真)
邮　　箱:cjsczzs@263.net网　　址:www.cjveg.com
526 中国油料作物学报　2009, 31(4)