全 文 ：收稿日期:2009-02-02
基金项目:河北省科技攻关项目(05276416);唐山市科技攻关项目(03132001A)
作者简介:客绍英(1968-),女 ,河北迁安人 ,教授 ,硕士 ,主要从事药用植物学与生物技术方面的研究。
通讯作者:刘玉军(1962-),男 ,山东诸城人 ,教授 ,博士 ,博士生导师 ,主要从事生物技术研究。
菘蓝试管苗玻璃化过程中抗氧化物酶活性的变化
客绍英1 , 2 ,张胜珍2 ,刘玉军1
(1.北京林业大学 生物科学与技术学院 ,北京　100083;2.唐山师范学院 生命科学系 ,河北唐山　063000)
　　摘要:为明确植物体内抗氧化酶活性变化与组培玻璃苗发生的关系 ,以菘蓝(Isatis indigotica Fort.)正常试管苗和
玻璃苗为研究材料 ,对其抗氧化物酶活性和膜脂质过氧化水平进行了比较分析。结果表明:正常苗和玻璃苗中过氧
化物酶(POD)活性随培养时间的延长先降低后升高 , 过氧化氢酶(CAT)活性先升高后降低 ,过氧化物歧化酶(SOD)活
性和丙二醛(MDA)含量始终呈上升趋势。同一培养时期 , 玻璃苗中 CAT、SOD活性均低于正常苗 , 而 MDA水平远远高
于正常苗 。表明组培过程中有氧自由基的胁迫 ,而玻璃苗细胞内保护酶的调节功能紊乱 , 从而发生了更严重的脂质
过氧化。此外 ,与正常苗相比 , 玻璃苗中 POD同工酶电泳谱带出现增加 、缺失等异常现象 , 表明玻璃苗中酶的表达失
常 ,遗传稳定性改变。
关键词:菘蓝;玻璃化;抗氧化物酶;丙二醛
中图分类号:S682.01　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2009)03-0154-05
The Changes of Antioxidant Enzymes Activity of
Isatis indigotica Fort.during Vitrification in vitro
KE Shao-ying1 , 2 ,ZHANG Sheng-zhen2 , LIU Yu-jun1
(1.College of Biological Sciences and Biotechnology ,Beijing Forestry University ,Beijing　100083 ,China;
2.Department of Life Sciences ,Tangshan Teachers College ,Tangshan　063000 ,China)
Abstract:The normal and vitrified plantlets of Isatis indigotica Fort.cultured in vitro were experiment materials , the
changes of activitities of antioxidant enzyme and stress by oxygen free radicals were investigated.The results showed that:
in the course of culture of Isatis indigotica Fort.shoots , the activity of Peroxidase(POD)in both normal and vitrified shoots
increased at first and then decreased.The activity of Catalase(CAT)decreased at first and then increased.The activity of
Superoxide dismutase(SOD)andMalondiadehyde(MDA)content were gradually increased.The activities of CAT and SOD
in vitrified shoots were lower than those in normal shoots ,but MDA levels in vitrified shoots was higher than that in nor-
mal shoots.It can be inferred that the function of protective enzymes of vitrified shoots was abnormal , so the vitrified
shoots were stressed and destroyed by oxygen free radicals more heavily than normal shoots.In addition , the belts of Perox-
idase isozymes of vitrified shoots lost or added compared with normal shoots.This result indicated that the expression of
isozymes was abnormal and the hereditary stability of vitrified shoots have changed.
Key words:Isatis indigotica Fort.;Vitrification;Antioxidant enzymes;Malondiadehyde
　　菘蓝(Isatis indigotica Fort.)为大青叶 、板蓝根的
主要来源 ,有清热解毒 、凉血利咽 、抗菌抗病毒作用 ,
是一种重要的药用植物[ 1] ,药用量较大 ,市场紧缺 。
利用组织培养技术可在短期内快速获得大量可利用
的材料 ,但笔者在对菘蓝进行组培时发现其玻璃化
比例较高 ,给组培快繁带来很大影响。
试管苗玻璃化是组培过程中普遍发生的一种生
理病变 ,其症状为试管苗矮小 、茎叶肿胀畸形 、组织
半透明水浸状 。试管苗玻璃化后分化能力低下 ,难
以增殖生根成苗 ,严重影响组培苗的繁殖率[ 2 , 3] 。
由于试管苗玻璃化现象的普遍性及危害性 ,玻璃化
发生的原因和防止措施逐渐受到较多的注意和研
华北农学报·2009 , 24(3):154-158
究。玻璃苗的解剖学特点 、生理生化变化也逐渐被
揭示[ 4 ,5] 。有证据表明 ,玻璃苗细胞含水量及丙二
醛(MDA)含量均远高于正常苗[ 6] 。MDA是活性氧
自由基攻击生物膜发生膜脂质过氧化的产物之一 ,
可以引起细胞膜的严重破坏 ,使膜失去正常膨压 ,造
成组织过度吸水 ,引发玻璃苗的发生[ 7] 。超氧化物
歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶
(CAT)等是生物体防御活性氧毒害的保护性酶 。王
纪方等[ 8]对丝石竹玻璃苗生理生化特性进行了研
究 ,认为玻璃化现象的引发与等保护酶的失常密切
相关 。谢芝馨等[ 9]对大葱玻璃苗中抗氧化物酶的活
性进行了研究 ,发现 SOD 、POD 、CAT 活性均存在异
常。但由于材料不同 ,玻璃苗中抗氧化物酶活性变
化趋势并不相同 ,甚至出现相反的结果。本试验对
菘蓝正常苗与玻璃苗中 SOD 、POD 、CAT 的活性变化
进行了研究比较 ,旨在进一步明确植物体内抗氧化
物酶活性变化与玻璃苗发生的关系 ,为玻璃苗的防
治提供理论参考 。
1　材料和方法
1.1　供试材料及试材培养
以菘蓝种子为外植体接种于 1/2MS 培养基中 。
培养 7 ～ 10 d ,在超净工作台上切取上胚轴 ,转接入
继代培养基中 ,继代培养基为:MS+NAA 0.2 mg/L
+6-BA 2.0 mg/L +蔗糖 30 g/L +琼脂 5.5 g/L ,
pH5.8。组培苗在培养温度(25±2)℃,光照时间 12
h/d ,光照强度 1 500 ～ 2 500 lx 的条件下培养。根据
菘蓝组培苗外部形态进行分类 ,共分为正常苗 、轻度
玻璃化苗 、重度玻璃化苗等 3类[ 10] 。
1.2　试验方法
1.2.1　SOD 、POD 、CAT 活性及 MDA含量的测定　
SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)法[ 11]测定 ,POD活性
采用愈创木酚法[ 11] 测定 , CAT 活性采用紫外吸收
法[ 11]测定 。MDA含量采用硫代巴比妥酸显色法测
定[ 12] 。
1.2.2　POD 同工酶的测定　取正常苗 、轻度玻璃
苗 、重度玻璃苗各 1.0 g ,分别加 0.05 mol/L 磷酸缓
冲液(pH 7.8 ,含 1%的聚乙烯吡咯烷酮和 0.2%乙
二胺四乙酸)5 mL ,冰浴研磨成匀浆后 , 13 000 r/min
4℃离心 20 min ,吸取上清液贮于冰箱备用 。采用垂
直板聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,分离胶(pH 8.9),浓度为
7.5%,100 V 电压 ,浓度胶(pH 6.7),浓度为 2.5%,
150 V电压 ,醋酸联苯胺染色后观察[ 11] 。
2　结果与分析
2.1　菘蓝正常苗与玻璃苗主要形态特征
　　菘蓝正常试管苗生长健壮 ,茎节间明显 ,叶片绿
色 ,薄而平展(图 1-A)。轻度玻璃化苗茎肥大 、半透
明水浸状 ,叶片狭小 ,边缘卷曲半透明 ,叶色黄绿 、白
绿或墨绿 ,茎叶均脆弱易碎(图 1-B)。重度玻璃化
苗植株矮小 ,茎透明肿胀 ,无明显的节间 ,叶片肥厚 、
扭曲 、透明 ,叶色墨绿 ,茎叶均脆弱易碎(图 1-C)。
A.正常苗;B.轻度玻璃化苗;C.重度玻璃化苗。
A.Normal shoots;B.Low-grade vitreous shoots of Isatis indigotica Fort;C.High-grade vitreous shoots.
图 1　菘蓝正常试管苗与玻璃苗形态比较
Fig.1　Comparison of morphology between vitreous shoots and normal shoots of Isatis indigotica Fort.cultured in vitro
2.2　菘蓝正常组培苗与不同程度玻璃苗 MDA含
量的比较
MDA作为氧自由基攻击生物膜 ,发生脂质过氧
化反应的产物之一 ,是膜脂质过氧化伤害的内在生
理指标。由图 2-A可见 ,无论正常的组培苗还是玻
璃苗 ,MDA水平都随培养时间的延长而升高 ,而且
玻璃苗的MDA含量(以鲜质量计)远远高于正常苗 。
说明菘蓝组培苗在培养条件下有过量的氧自由基的
胁迫 ,发生了脂质过氧化伤害 ,而且玻璃苗的脂质过
氧化伤害程度远比正常苗严重。
2.3　菘蓝正常苗和玻璃苗中 SOD、POD、CAT活
性的差异
　　SOD是植物体内清除自由基最关键的保护酶之
一 ,主要催化超氧阴离子自由基(·O2-)发生歧化作
用生成分子氧和 H2O2 ,以消除毒性较大的自由基
·O2-的毒害[ 13] 。由图 2-B可以看出 ,无论在正常苗
还是玻璃苗中 SOD 活性(以鲜质量计)都随着培养
时间的延长而呈上升趋势 ,升高幅度依次为:重度玻
3期 客绍英等:菘蓝试管苗玻璃化过程中抗氧化物酶活性的变化 155　
璃化苗>轻度玻璃化苗正常苗 ,表明在组培过程中
有某种胁迫因素存在 ,使试管苗的氧自由基代谢不
平衡而积累了过量氧自由基 ,激发了 SOD活性的升
高 ,与正常苗相比 ,玻璃苗SOD活性升幅较大 ,表明
玻璃苗受到了更严重的胁迫 。此外 ,在同一培养时
间下 ,正常苗 SOD活性远高于轻度玻璃化苗和重度
玻璃化苗 ,表明正常试管苗清除自由基能力远远高
于玻璃化苗 ,因而尚能维持氧自由基代谢的平衡 。
图 2　菘蓝正常苗与玻璃苗不同培养时期 MDA 含量(A)与 SOD(B)、POD(C)、CAT活性(D)的变化
Fig.2　The change of MDA contents(A)and activities of SOD(B), POD(C), CAT(D)in
vitrified and normal shoots during micropropagation of Isatis indigotica Fort
　　POD和CAT 可以清除H2O2使之转化为H2O ,另
外还具有减少氧化力更强的·OH 生成的作用 ,因而
在抗氧化胁迫中具有重要作用 。由图 2-C 可知 ,随
培养时间的延长 ,菘蓝正常苗 、轻度玻璃苗和重度玻
璃苗中 POD活性(以鲜质量计)均大致呈现先降低
后升高的趋势 ,但正常苗 POD活性前后变化不大 ,
而轻度玻璃苗和重度玻璃苗 POD活性则表现为先
小幅下降 ,而后大幅上升 。在同一培养时期 ,POD活
性大致为玻璃苗>正常苗 。
由图 2-D可知 ,随培养时间的延长 ,菘蓝正常
苗 、轻度玻璃苗和重度玻璃苗 CAT 活性(以鲜质量
计)呈先升高而后降低的趋势 ,与 POD活性变化趋
势完全相反。三种材料中 ,正常苗 CAT 活性升降幅
度最小 ,轻度玻璃苗次之 ,重度玻璃苗变化最大 。在
同一培养时期 ,CAT 活性表现为正常苗>玻璃苗 ,与
POD活性变化也呈相反趋势。玻璃苗中 POD 、CAT
活性剧烈变化 ,且变化趋势相反 ,表明玻璃苗中保护
酶系统的调节功能可能已发生紊乱。
2.4　过氧化物酶同工酶谱的分析
由图 3可以看出 ,正常苗 、轻度玻璃化苗和重度
玻璃化苗在酶带数量 、带型宽窄 、酶带颜色深浅等方
面均存在明显差异 。菘蓝正常苗有A ,C ,D ,E 4条酶
1.轻度玻璃化苗;2.重度玻璃化苗;3.正常苗。
1.Low-grade vitreous shoots;2.High-grade vitreous shoots;3.Normal shoots.
图 3　菘蓝正常组培苗与玻璃苗 POD 同工酶电泳比较
Fig.3　Comparison of POD isozyme between normal and vitrified shoots of Isatis indigotica Fort.cultured in vitro
156　 华　北　农　学　报 24卷
带 ,其 Rf 分别 0.088 ,0.195 ,0.287和 0.330。轻度玻
璃化苗与正常苗相比 ,E 谱带缺失 ,此外 C , D酶带
较宽 ,且 C 谱带颜色明显深于正常苗中相应谱带 。
重度玻璃化苗除 A酶带与正常苗相似外 ,其余酶带
均出现较大差异 ,即 C , D , E 酶带的减弱及 B酶带
(Rf =0.177)的增加 。
3　讨论
3.1　玻璃化现象与 POD、SOD 、CAT活性的关系
植物能通过多种途径产生各种活性氧。在正常
生理条件下 ,植物体内的活性氧不足以使植物受到
伤害 ,因为植物在长期进化过程中形成了一个完善
的清除活性氧的保护酶系统(主要包括 CAT 、 POD
和SOD),使活性氧的产生与清除维持在一个动态平
衡状态[ 13] 。而当植物遇到胁迫等逆境及衰老时 ,这
种平衡即遭到破坏 ,活性氧产生加快 ,清除系统的功
能降低 ,这些都致使活性氧在体内积累从而导致生
理代谢功能紊乱 ,产生一些不适于植物生长的因子 ,
影响植物细胞和组织形态发生的进行[ 14] 。在植物
组织培养过程中常有一些不符合植物生长要求的因
素 ,例如激素浓度 、水分状况 、光照及温度等条件的
不适 ,从而使组培苗处于各种不适合的“微环境”因
子的胁迫中 ,其体内活性氧的产生不可避免 。如果
试管苗保护酶系统活性较强 ,能把试管苗体内的活
性氧及时清除 ,则组培苗的外部形态及内部代谢不
会受到影响 ,仍表现为正常苗 。但当活性氧的积累
量过多 ,超过生物体内在的防御能力时 ,氧自由基就
会进攻膜系统而发生膜脂质过氧化 ,使生物膜受到
伤害 ,并伴随乙烯 、MDA等有害物质的产生 ,这些物
质反过来又加重膜损伤 ,导致生物膜透性增加 ,蛋白
质 、核酸等生物大分子失活 ,最终使试管苗畸形生
长 ,产生玻璃化现象[ 15] 。
SOD 、POD 、CAT 在活性氧清除过程中虽然各自
的作用不同 ,但三者协调一致使植物氧自由基维持
在一个低水平上 ,才能防止自由基对植物细胞的伤
害[ 16] 。而本试验菘蓝组培苗在培养过程中 SOD 、
POD 、CAT 活性变化并不一致。随培养时间的延长 ,
正常组培苗和玻璃化组培苗中 SOD活性均呈上升
趋势;POD活性先降低后大幅升高 ,而 CAT 活性变
化与 POD趋势相反 ,呈先升高后降低的趋势。对于
同一培养时期的试管苗来说 ,玻璃苗中 POD活性高
于正常苗而 SOD 、CAT 活性却低于正常苗 。这说明
细胞内保护酶活性的调节出现了不同步的现象 ,而
细胞内保护酶调节的不同步通常是细胞调节功能紊
乱的表现 。说明玻璃苗虽然表面上仍然没有死亡的
迹象 ,但是其细胞内保护系统的调节功能已经发生
了紊乱[ 17] 。
就组培过程中正常苗与玻璃苗 SOD 、POD 、CAT
活性变化幅度来看 ,正常苗变化幅度均较小 ,而玻璃
苗中酶活性均发生了剧烈变化。已有研究表明
SOD 、POD 、CAT均为诱导酶 ,逆境条件下自由基的产
生可诱导其活性的升高[ 18] , 正常苗中 SOD 、POD 、
CAT活性变化幅度均较小 ,而玻璃苗中酶活性变化
幅度大 ,表明玻璃苗在组培过程中受到的胁迫程度
要远远高于正常苗 ,有更多的自由基的产生 。MDA
作为氧自由基攻击生物膜 、发生膜脂质过氧化反应
的产物之一 ,可作为膜脂质过氧化伤害的内在生理
指标 。本试验对 MDA 检测结果为:重度玻璃化苗
MDA含量高于轻度玻璃化苗 ,轻度玻璃化苗又高于
正常苗。此结果进一步证明了玻璃苗中确实发生了
严重的膜质过氧化伤害 ,并引起了生物膜的严重破
坏 ,使膜失去正常膨压 ,组织吸水失控 ,从而使玻璃
苗表现茎叶肿胀现象。这与赵剑等[ 7]的研究结果是
一致的。
3.2　玻璃化现象与 POD同工酶的关系
同工酶是催化相同反应而结构及理化性质不同
的酶分子 ,POD同工酶则是一族充当H2O2 氧化供氧
体的同工酶 。在高等植物体内编码 POD 同工酶的
基因有 40多个 ,而各种内因(激素 、离子调控)和外
因(胁迫 、衰老)均可作用于同工酶基因的表达 ,基因
表达产物的差异最终反映在化学组成和功能各异的
各种同工酶的形成上[ 19] 。本试验结果表明菘蓝正
常组培苗和玻璃苗的 POD同工酶种类存在明显不
同。其他植物中也有类似现象。例如谢芝馨等[ 9]发
现大葱玻璃苗中 POD和酯酶同工酶谱带均出现了
增加 、缺失等现象 。贾炜珑等[ 6]也发现康乃馨玻璃
苗酯酶同工酶谱带比正常苗丢失 4 ～ 5条 。分析以
上现象产生的原因可能为:玻璃化现象是生长因子
不平衡的产物 。在一定范围内植物可以适应培养条
件的不适宜状况 ,但超过一定范围 ,则可引起基因功
能活动的改造即关闭一个基因位点或打开另一个基
因位点 ,发生或加强一种同工酶的合成 ,完全或局部
停止另一种同工酶的合成[ 20] 。玻璃苗与正常苗中
同工酶数量及种类的差别表明玻璃苗在基因的表达
和调控上出现了异常[ 8] 。
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