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[ 基金项目] 江苏省中医药管理局项目(编号:H 05065) [ 作者简介] 潘金火 ,男 ,教授 ,博士后 , 电话:025-85811517 , E-mai l:panjin huo@163.
com
垂盆草总黄酮中 8种单体成分对肝细胞的保护作用
潘金火 ,潘萍 (南京中医药大学 , 江苏 南京 210046)
[ 摘要] 目的:考察垂盆草总黄酮中已确证的 8种单体成分对肝细胞的保护作用 , 为垂盆草药材质量控制指标成分的筛选提
供依据。方法:取已经确证的垂盆草总黄酮中的 8 种单体成分 , 用二甲基亚砜(DMSO)溶解 ,临用前用培养液稀释成 5 个不同
的浓度 ,分别用 M TT 法检测其对 H2O2诱导的人系 L02肝细胞损伤的保护作用。结果:模型组 OD值与正常组比较差异有极
显著性 ,金丝桃苷(10-1 ～ 10-3 g·L-1)、5 , 4′-二羟基-8 , 3′-二甲氧基黄酮-3 , 7-二-O-β-D-葡萄糖苷(1.0 ～ 10-2 g·L-1)与模型组
比较差异有极显著性 ,而金丝桃苷(10 -4 g·L-1)、苜蓿苷(1.0～ 10-1 g·L-1)和槲皮素(1.0～ 10-2 g·L -1)与模型组比较差异有
显著性。结论:金丝桃苷 、5 , 4′-二羟基-8 , 3′-二甲氧基黄酮-3 , 7-二-O-β-D-葡萄糖苷在一定浓度范围内对 H2O 2所致 L02 肝细
胞损伤有显著的保护作用 ,苜蓿苷和槲皮素也有一定的保护作用。
[ 关键词] 垂盆草;黄酮类单体成分;保肝作用
[中图分类号] R285.6 [ 文献标识码] A [文章编号] 1001-5213(2010)19-1621-03
Study on the pratective effects of eight flaconoids compositions from Hebna Sedi Sarmentosi on
liver cell (LO2)in vitro
PAN Jin-huo , PAN Ping(Nanjing Univ ersity of Chinese Medicine , Jiang su Nanjing 210046 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To obse rve the protectiv e effects of the eight confirmed flav onoids com positions f rom Hebra Sedi
Sarmentosi on liv er cells , to pro vide basis for selec ting the index composition o f quality control for Hebra S edi S armentosi .
METHODS Eight confirmed f laconoids canpositio ns w ere taken , dissolved by DMSO , diluted to five different concentra tions by
culture so lution befo re used , then used the method of M TT to check the pro tectiv e effect on L02 ce ll injured by H2 O2 .RE-
SULTS Compared with the normal g roup , the OD level o f mode l g roup has ext remely significant diffe rence , compa red w ith the
Model g roup , hypericin(10-1-10-3 g·L-1), 5 , 4-dihydro xy-8, 3-dime thoxy-3 , 7-flav onoids-2-O-β-D-g lucosid(1.0-10-2 g·L-1)
had ex tremely significant difference , hypericin(10-4 g·L-1), t ricin-7-O-β-D-lucopy ranoside(1.0-10-1 g·L-1)and que rcetin(1.0-
10-2 g·L-1)had significant difference.CONCLUSION Hype ricin and 5 , 4-dihydroxy-8, 3-dimethoxy-3 , 7-flavonoids-2-O-β-D-
gluco saide have pro tective effect on liv er cell in v itro injured by H 2O 2 , que rcetin and tricin-7-O-β-D-lucopy ranoside also have
some effects on cer tain deg ree.
KEY WORDS:Hebra Sed i S armentosi ;liv er pro tection;monomer composition of flavonoids
垂盆草是景天科植物垂盆草[ Sedum sarmento-
sum .Bunge]的新鲜或干燥全草 ,味甘 、淡 ,性凉 ,具
有清热解毒 、利尿消肿之效 ,主治急 、慢性肝炎 。垂
盆草主要含有糖类 、黄酮类 、三帖类及苷类成分。前
期的实验结果表明 ,垂盆草总黄酮是垂盆草中重要
的保肝降酶活性成分之一 ,且垂盆草总黄酮至少含
有槲皮素 、山柰素 、木犀草素等 8种黄酮类化合物 。
为配合垂盆草活性成分的筛选 、指标成分的确认 、质
量标准的制定 ,在前期实验工作的基础上 ,分别用已
确证的上述 8种黄酮类单体成分 ,考察其对 H2O 2
诱导的 L02肝细胞损伤的保护作用 ,为垂盆草保肝
降酶作用机制的研究和质量标准的制定奠定基础 。
现将方法和结果报道如下。
1 材料
NAPCO5410型 CO 2细胞培养箱(PRECISION
SCIEN TIF-IC);Model550 型酶标仪(BIO-RAD);
H 2O 2(上海化学试剂有限公司);RPMI 1640(GIB-
COBRL);噻唑蓝(M TT)(Fluka 公司);小牛血清
(杭州四季青生物工程材料有限公司);二甲基亚砜
(DMSO)(Sigma 公司);胰蛋白酶(Trypsin , AM-
RESCO公司);人系 L02 正常肝细胞(上海细胞
所);槲皮素对照品(批号 760701)、山柰素对照品
(批号 0861-200002)、木犀草素 对照品(批号
111520-200201)、金丝桃苷对照品(批号 1521-
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200202)、木犀草苷对照品(批号 1192-061019)、槲
皮苷对照品(批号 235-2003012)均购自中国药品生
物制品检定所;5 , 4′-二羟基-3′, 5′-二甲氧基黄酮-7-
O-β-D-葡萄糖苷(苜蓿苷)、5 , 4′-二羟基-8 , 3′-二甲
氧基黄酮-3 ,7-二-O-β-D-葡萄糖苷为自制品(批号分
别为 20050404 , 20050428-1 ,经结构确证和纯度检
查 ,高效液相色谱法测得纯度分别为 97.43%和
97.01%)。
2 方法和结果
2.1 供试品溶液的制备 分别精密称取槲皮素 、山
柰素 、木犀草素 、苜蓿苷 、槲皮苷 、金丝桃苷 、木犀草
苷 、5 ,4′-二羟基 8 , 3′-二甲氧基黄酮-3 , 7-二-O-β-D-
葡萄糖苷10.0 mg ,加入少量 DMSO 溶解 ,临用前用
培养液稀释成 1 g·L-1的溶液 ,用孔径0.22 μm 的
滤器滤过除菌。
2.2 细胞的处理[ 1] L02肝细胞加 RPMI 1640培养
液(加 10%小牛血清),置37 ℃、5%CO 2的培养箱中
培养 ,生长至状态良好时(细胞贴壁生长 ,未发现悬浮
细胞),取对数生长期细胞 ,用0.25%胰蛋白消化后 ,
再用 1640培养液终止消化 ,并吹打均匀 ,调整细胞密
度为 1×108·L-1 ,接种于 96孔板 ,每孔 150μL 细胞
悬液 ,置培养箱中继续培养 ,24 h后供实验用。
2.3 供试品溶液对 H2 O 2所致肝细胞损伤的影
响[ 2-3] 取上述肝细胞 ,吸弃上清液 ,给药组分别加
入适量上述供试品溶液 ,用培养液稀释 ,使终质量浓
度分别为 1.0 , 10-1 , 10-2 , 10-3 , 10-4 g·L-1 。 5 h
后 ,除正常对照组外 ,其余各组均加入 H 2O2 ,终浓
度为0.5 mmo l·L -1 ,继续培养 12 h ,加入 MT T ,4 h
后 ,取出培养板 ,吸弃上清液 ,加入二甲基亚砜 ,每孔
150 μL ,振荡 10 min ,于 570 nm 波长处测吸光度 ,
结果见表 1。
模型组 OD值与正常组比较差异有极显著性 。
金丝桃苷(10-1 ～ 10-3 g·L-1)、5 , 4′-二羟基 8 ,3′-二
甲氧基黄酮-3 , 7-二-O-β-D-葡萄糖苷(1.0 ～ 10-2 g·
L-1)与模型组比较差异有极显著性(P <0.01),而
金丝桃苷(10-4)、苜蓿苷(1.0 ～ 10-1 g·L -1)和槲皮
素(1.0 ～ 10-2 g·L-1)与模型组比较差异有显著性
(P<0.05)。说明金丝桃苷(10-1 ～ 10-3 g·L-1)、5 ,
4′-二羟基 8 ,3′-二甲氧基黄酮-3 ,7-二-O-β-D-葡萄糖
苷(1.0 ～ 10-2 g·L-1)对 H 2O 2所致肝细胞损伤有极
显著的保护作用 ,金丝桃苷(10-4 g·L-1)、苜蓿苷
(1.0 ～ 10-1 g·L -1)和槲皮素(1.0 ～ 10-2 g·L -1)也
有显著的保护作用 ,而槲皮苷 、山柰素 、木犀草苷 、木
犀草素则在上述浓度下未显示出对病理性肝细胞的
保护作用 。
表 1 各供试品溶液对 H 2O 2所致 L02肝细胞损伤的影响( x
±s , n=3)
Tab 1 Effect of each solution fo r test on L02 hepatic ce ll
damage induced by H2O2( x±s , n=3)
组别 剂量/ g·L-1 OD值
正常组 / 1.0±0.03
模型组 / 0.5±0.04a
1.0 0.7±0.04c
10-1 0.6±0.05c
苜蓿苷 10-2 0.6±0.04
10-3 0.6±0.03
10-4 0.6±0.05
1.0 0.6±0.06
10-1 0.60±0.018
槲皮苷 10-2 0.58±0.013
10-3 0.6±0.04
10-4 0.6±0.03
1.0 0.59±0.016
10-1 0.82±0.04b
金丝桃苷 10-2 1.0±0.06b
10-3 0.78±0.022b
10-4 0.72±0.05c
1.0 0.6±0.03
10-1 0.60±0.05
木犀草苷 10-2 0.57±0.018
10-3 0.58±0.04
10-4 0.55±0.027
1.0 0.62±0.04c
10-1 0.64±0.06c
槲皮素 10-2 0.61±0.024c
10-3 0.55±0.03
10-4 0.56±0.06
1.0 0.580±0.011
10-1 0.56±0.04
山柰素 10-2 0.510±0.019
10-3 0.52±0.04
10-4 0.49±0.021
1.0 0.56±0.06
10-1 0.53±0.04
木犀草素 10-2 0.51±0.026
10-3 0.49±0.06
10-4 0.52±0.04
1.0 0.960±0.022b
5 , 4′-二羟基 8 , 3′-二甲
氧基黄酮-3 , 7-二-O-β-D-
葡萄糖苷
10-1 0.84±0.04b
10-2 0.72±0.024b
10-3 0.61±0.012
10-4 0.6±0.04
注:与正常组比较 , a P<0.01;与模型组比较 , bP <0.01, cP<0.05
3 讨论
本实验选择 H 2 O2对肝细胞进行损伤造模 ,
H 2O 2可直接弥散于细胞内与各种细胞成分相互作
用 ,在富含铁的肝细胞内转变为·OH 自由基 , ·OH
自由基可致 DNA 键断裂 ,并与细胞的重要成分起
反应 ,亦可攻击膜磷脂中的多不饱和脂肪酸(PU-
FA),引发膜脂质过氧化链式反应 ,双链脂肪酸过氧
化(聚合)可使 MDA 形成增多 ,肝细胞膜通透性增
加。另外 ,H 2O 2可促进 GSHpx 和 GSH 等抗氧化
物质消耗增多而水平下降 ,清除自由基功能也随之
下降 ,肝细胞损伤进一步加重。
选取正常人肝细胞株(L02 cell),用 H 2O 2造成
肝细胞损伤模型 。我们摸索了不同浓度(0.01 ～ 1
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mmo l·L -1)、不同损伤时间(1 ～ 24 h)的造模效果 ,
最后决定采用0.5 mmol·L-1 、12 h 的造模条件 ,此
时细胞的存活率约为 50%。在各给药组加入药物
后 5 h ,加入 H 2O 2 ,损伤 12 h后 ,用 MT T 法测定各
组细胞的 OD 值 , OD 值的大小与细胞存活率成正
比 ,与细胞死亡率(肝细胞损伤程度)成反比。
体外试验结果提示 ,金丝桃苷 、5 ,4′-二羟基-8 ,
3′-二甲氧基黄酮-3 , 7-二-O-β-D-葡萄糖苷在一定浓
度范围内对 H 2O2所致 L02肝细胞损伤有极显著的
保护作用 ,而苜蓿苷和槲皮素也有一定的保护作用 ,
表明这 4个黄酮类单体成分可能是垂盆草总黄酮中
重要的保肝降酶活性成分之一 ,这为垂盆草保肝降
酶活性成分的筛选提供了一定线索 ,但其确切的保
肝降酶作用及机制有待于进一步动物体内试验验
证。
金丝桃苷最高质量浓度(1 g·L-1)在本实验中
未表现出对 H 2O2所致 L02肝细胞损伤的保护作
用 ,这可能是由于药物浓度过高 ,导致细胞培养液的
渗透压或离子浓度等发生变化 ,而这些变化又可能
对细胞的生长起到抑制作用 。另外 , M TT 法影响
因素较多 ,金丝桃苷在这个浓度的真实作用也许并
未完全表现出来 ,有待通过其他指标如生化酶学指
标等来进一步确证 。
参考文献:
[ 1] 汪德清 ,沈文梅 ,田亚平 ,等.黄芪活性提取成分对膜脂质过氧
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[ 3] 吴祥瑞 ,洪敏 ,华永庆 ,等.茵陈蒿汤与肝细胞结合成分保肝作
用研究[ J] .中药药理与临床 , 2007 ,23(5):1-11.
[收稿日期] 2009-12-27
[ 基金项目] 湖北省科技攻关计划资助项目(编号:2005AA301C37) [ 作者简介] 刘萍 , 女 ,学士 , 主任药师 , 电话:027-67812902 , E-m ail:
znyyyxb@126.com
黄芩苷对小鼠实验性结肠炎的保护作用
刘萍 ,程虹 ,吴东方 (武汉大学中南医院药学部 ,湖北 武汉 430071)
[ 摘要] 目的:观察黄芩苷对三硝基苯磺酸(TNBS)致小鼠实验性结肠炎的保护作用 , 并探讨其作用机制。方法:将 Balb/c小
鼠分为 4 组:乙醇对照组 、TNBS 模型组 、黄芩苷低剂量组和黄芩苷高剂量组。用 TNBS 灌肠诱导小鼠实验性结肠炎模型 ,
TNBS 灌肠 2 h 后 ,灌胃给予黄芩苷 , qd×7 d。第 8 天处死动物 , 观察结肠黏膜的损伤程度 ,测定结肠髓过氧化物酶(MPO)活
性以及丙二醛(MDA)和谷胱苷肽(GSH)的含量。结果:与 TNBS 模型组比较 , 黄芩苷低 、高剂量组小鼠体质量 、大体损伤评
分及组织学表现均显著改善 ,MPO 酶活性显著降低 ,MDA含量减少 ,谷胱苷肽含量增加。结论:黄芩苷可减轻 TNBS 诱导的
小鼠实验性结肠炎 ,作用机制与黄芩苷的抗氧化作用有关。
[ 关键词] 黄芩苷;三硝基苯磺酸;实验性结肠炎;小鼠
[中图分类号] R285.6 [ 文献标识码] A [文章编号] 1001-5213(2010)19-1623-03
The protective effects of baicalin on experimental colitis in mice
LIU Ping ,CHENG Hong ,WU Dong-fang (Depar tment o f Pharmacy , Zhongnan Hospital of Wuhan Unive rsity , Hubei
Wuhan 430071 , China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To observ e the effects of baicalin on experimental co litis induced by trinitrobenzenesulfonic acid
(TNBS)in mice.METHODS Balb/c mice was randomly div ided into four g roups:ethano l contro l , TNBS model g roup and ba-
icalin trea tment g roup(mice was trea ted with 40 and 80 mg·kg-1 baicalin).Experimental co litis w as induced by TNBS.baicalin
was given by o ral administra tion , qd 7 , af te r TNBS t reatment fo r 2 h.Mice w as euthanized on eighth day.The histolo gica l and
micro scopical change s o f co lon w ere obser ved and activity o f myelope rox idase (MPO) and contents of ma londialdehyde
(MDA), g luthathione(GSH)w ere evaluated.RESULTS The histological and micr oscopical changes o f co lon and changes of
body weight in mice we re significantly improved after treatment with 40 and 80 mg·kg -1 baicalin , compa red w ith TNBS model
gr oup.Meanw hile , the activity o f MPO and the content of MDA w as r educed , respectiv ely , the content o f GSH was increased re-
markably in baicalin trea tment g roup.CONCLUSION Baicalin can relieve the symptoms of experimental colitis induced by TN-
BS through the inhibition of o xidation.
·1623·中国医院药学杂志 2010年第 30卷第 19期 Chin H osp Pharm J , 2010 Oct , Vol 30 , No.19