全 文 ：山莓叶化学成分分析及其生物碱的抗菌作用
董振生 ,程天印＊ ,李　丹 ,李向勇 ,王　慧
(湖南农业大学 动物医学院 , 湖南 长沙　410128)
摘　要:采用试管法和圆形滤纸层析法 ,鉴定了山莓叶的化学成分 ,结果表明其含有生物碱 、有机
酸 、黄酮及其甙类 、多糖 、香豆素及内酯 ,酚性成分 、鞣质 、多肽及蛋白质 、皂甙 、三帖类 、蒽醌 、强心苷
等多种物质 。采用有机溶剂提取法分离提取其抗菌有效成分-生物碱 ,并用其对几种兽医临床常
见病原微生物进行体外抑菌试验 ,结果表明:山莓叶所含总生物碱对金色葡萄球菌 、猪巴氏杆菌 、大
肠杆菌 、链球菌和沙门氏菌都有明显的抑菌作用 ,最低抑菌浓度分别为:0.125 g/mL , 0.25 g/mL ,
0.125 g/mL ,0 .5 g/mL , 0.125 g/mL。
关键词:山莓叶;有效成分;抗菌作用
中图分类号:S853 .7　　　　文献标识码:A 　　　　文章编号:1004-6704(2008)06-0025-04
Studies on Chemical Composition and Antimicrobial Effect of
the Alkaloid of Rubus Corchorifolius
DONG Zhen-sheng ,CHENG Tian-yin ,LI-dan , LI Xiang-yong ,WANG Hui
(Col lege o f Animal Med ical , HNAU , Changsha 410128)
　　Abstract:The test tube method and iso lated me thod o f the circular filter w ere used to that identify the chemical compotion
of the Rubus corcho rifo lius.The re sults showed:the Rubus corcho rifo lius contains A lkaloid , o rg anic acid , flav oen and fla-
vonoids , pheno lic compo tion , tannin , sugar , coumarin and lactone , po lypeptide and pro tein , saponins , anthraquinone , cardiac
glycoside and so on.Using o rganic so lv ent ex traction method , w e isola ted the alkalo id f rom Rubus co rcho rifo lius and made ant-
iblastic experiment to a few o f original micr oo rganism.The effec t demonstra ted:the A lkalo id from Rubus co rchorifolius have
stronge r bacte rio sta tic to staphy lococcus aureas , pasteur ella malto cida , E.coli , streptococci and salmonella , the M IC are 0.
125g/ mL , 0.25g/ mL , 0.125g/ mL , 0.5g/ m L , 0.125g/ mL.
Key words:Rubus co rchorifolius;Alkaloid;Effectiv e Fragmentation;Iso la ted ;Antimicrobial Effect
　　山莓(Rubus corchorifolius L.f)又名三月泡 、悬钩
子 、龙船泡 、牛奶泡 、树莓 、泡儿刺 ,系蔷薇科(Rosace-
ae)蔷薇亚科悬钩子属(Rubus ,L)中的一种落叶灌木。
广泛分布在我国除东北 、内蒙古 、新疆 、西藏外的其他
各省 、市 、自治区 ,在海拔 300 ～ 1500 m 的向阳山坡 、
溪边 、山谷 、荒地和灌木丛中大量生长。
叶性微苦 ,具有清热利咽 、解毒 、消肿 、敛疮等作
用 ,主治咽喉肿痛 、多发性脓肿 、乳腺炎等症。在湖
南湘西地区 ,群众常将嫩叶捣碎饲喂动物治疗腹泻 。
据资料报道 ,山莓叶含黄酮类 、香豆素 、茶多酚等
药[ 1-3] 。本文采用有机溶剂提取法分离提取其抗菌
有效成分-生物碱 ,并用其对几种兽医临床常见病
[ 收稿日期] 　2008-05-10
[ 基金项目] 　湖南省科技厅资助项目(2007RS4013)
[ 作者简介] 　董振生(1982-), 男 ,山东临朐人 ,硕士研究生 ,研
读方向:中草药开发。
　＊[ 通讯作者]
原微生物进行体外抑菌试验 ,以便为兽医临床合理
使用山莓叶及开发天然抗菌药物提供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　药材
山莓叶采于湖南农业大学校园绿化树的树叶 ,
烘干后粉碎过 20目筛 。
1.2　仪器设备
RE-52A 旋转蒸发器(上海亚华生化仪器厂生
产);WS2-84-73手提式高压蒸汽消毒器(衡阳医
疗器械厂生产);250B恒温生化培养箱(常州华普达
教学仪器有限公司生产),SW -CJ-1F 净化工作台
(苏州安泰空气技术有限公司生产);BS -2F 振荡
培养箱(常州华普达教学仪器有限公司生产)。
1.3　试剂
重氮化试剂 ,硅钨酸试剂 ,碘化铋钾试剂 , 碘化
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汞钾试剂 ,碱性酒石酸铜试剂 , 2 %的红血球悬液 ,
氯化钠白明胶试剂 , 3.5 -二硝基苯甲酸试剂 ,碱性
苦味酸等试剂均为 AR级 ,符合化学成分分析要求 。
白明胶 ,牛肉膏 ,琼脂 ,蛋白胨等均为生化药品 。
1.4　菌种
金黄色葡萄球菌(C56023)、多杀性巴氏杆菌
(Kober-6)、大肠杆菌(C83917)、猪链球菌(Ⅱ型
SS Ⅱ -6)、猪霍乱沙门氏菌(A -72)购于中国兽医
药品监察所菌种室。
1.5　方法
1.5.1　检定液的制备　①水提取液:称取过 20 目
筛的山莓叶粉末 100 g ,加入蒸馏水 1000 mL ,在室
温浸泡过夜 ,水浴回流 1 h ,然后趁热过滤 ,滤液减
压浓缩至每毫升含生药 1 g 。②甲醇与酸性乙醇提
取液:称取过 20 目筛的山莓叶粉末 50 g ,加入 350
mL 甲醇或 0.5 %盐酸乙醇溶液 , 水浴上回流 60
min ,然后趁热过滤。滤液减压浓缩至每 mL 含生药
0.5 g 。 ③生物碱的提取:称取过 20目筛的山莓叶
粉末 100 g ,溶于 85 %乙醇 5 000 mL ,70 ～ 80 ℃恒
温水箱回流提取 3次 ,静置 ,过滤。滤液减压浓缩法
回收乙醇 ,5%盐酸洗脱 ,过滤 。滤液用氯仿萃取 ,弃
去底层氯仿 ,再萃取两次 ,处理后的酸液调 pH 为
6 ,定容为 100 mL ,制成浓度为 1.0 g/mL 的生药 ,
作为总生物碱提取母液 4 ℃冰箱中保存备用 。
1.5.2　有效成分预试验　采用试管预试法和圆形
滤纸层析法分别对山莓叶各种化学成分进行定性检
验 ,检验项目包括酚性成分 、有机酸 、生物碱 、氨基
酸 、蛋白质 、多肽 、氨基酸 、皂甙 、鞣质 、黄酮及其甙
类 、蒽醌及其甙类 、强心甙类 、糖类 、内酯 ,香豆素及
其甙类 、植物甾醇及三萜类 、挥发油及油脂类等化学
成分 。依据其成分的特征性显色反应和沉淀反应 ,
结合其特征理化性质结果进行综合分析判断 。
1.5.3　体外抑菌试验　采用纸片法测定抑菌圈 、试
管法测定最小抑菌浓度(MIC)药[ 4-6] 。
纸片法:先将定性滤纸用直径为 7 mm 的打孔
器打成小圆片 , 121 ℃高压蒸汽灭菌 30 min 备用 。
取琼脂培养基 15 mL 倒入已灭菌的平碟内 ,待冷却
凝固后 ,每碟平分五区 ,编号。在超净台上 ,每平碟
内加入 0.1 mL 菌液铺匀 。然后贴上浸有药液的纸
片 ,每种菌液各做 5个 ,贴好标记 。将平皿盖好 ,置
37℃恒温培养箱中培养 24 h ,测定并记录每个药敏
纸片的抑菌圈直径 ,取平均值 ,即为该药对此菌株的
抑菌结果 。
试管法:取 50支灭菌带棉塞的试管 ,每 10支为 1
组 ,编号。在无菌操作台上 ,每支试管内分别加入肉汤培
养基1 mL。将配制药液作二倍递减浓度稀释(即 1-8
号试管内药物浓度依次为 1 , 0.5 , 0.125 , 0 .063 ,
0.031 , 0.016 , 0 .008 g/ mL)。然后每管分别加入
菌液 0.1 mL ,第 9号试管只加肉汤和药液 ,不加菌
液 ,作为阴性对照 ,观察肉汤或药物是否污染;第 10
号管只加菌液和肉汤 ,不加药液 ,作为阳性对照 ,观
察细菌是否正常生长 。然后将试验管和对照管置
37 ℃的恒温箱中培养 24 h , 观察并判定药物对此
菌株的最小抑菌浓度(MIC)。
抑菌效果判断:D<10.5 mm 为低敏感度;14.5
mm>或=D >10.5 mm 为中度敏感;20 mm >或=
D>14.5 mm 为高敏感度;D >20 mm 为极敏感。
1.5.4 　最低杀菌浓度(MBC)测定 　取上述 M IC
及以上各浓度澄清透明液 0.1 mL 移至琼脂培养的
平皿上 ,均匀推开 ,置 37 ℃恒温箱中培养 18 h 观察
结果并记数 ,菌落数少于 5个的最低浓度为该药物
对该细菌的 MBC 。
2　结果
2.1　化学成分鉴定结果
用酸性乙醇 、水 、甲醇制备检定液 ,采用试管预
试法和圆形滤纸层析法分别检定石菖蒲所含成分 ,
检查结果见表 1。
从表 1可以看出 ,全草含有生物碱 、有机酸 、氨
基酸 、黄酮及其甙类 、多糖 、酚性成分 、鞣质 、多肽及
蛋白质 、皂甙 、三帖类 、蒽醌等有效成分等 。
　　从表 2可以看出 ,山莓叶生物碱对 5 种常见病
原菌均有较强的抑菌作用 ,其中高敏菌有大肠杆菌 ,
金黄色葡萄球菌 , 沙门氏菌 ,抑菌圈直径分别为 16.
41 ±0.52 mm 、15.66±0 .51 mm 和 15.78 ±0.32;
中敏感菌有猪巴氏杆菌 ,抑菌圈直径为 11.45 ±0.
21 mm 。低度敏感的有链球菌 ,抑菌圈直径为 9 .84
±0.47 mm 。
2.2　山莓叶生物碱对 5种病原菌的抑制效果
山莓叶生物碱对兽医临床上 5种常见病原菌的
抑制效果见表 2。
2.3　山莓叶生物碱的最低抑菌浓度(MIC)
由表 3可以看出 ,山莓叶生物碱不同的浓度对
不同菌的抑制效果;随着浓度的降低其抑菌效果相
应降低 。
2.4　山莓叶生物碱的最低杀菌浓度(MBC)
山莓叶生物碱对金色葡萄球菌的 MBC 为 0.125
g/mL;对链球菌的 MBC 为 0.25 g/mL;对沙门氏菌
的 MBC为 0.125 g/mL;对猪巴氏杆菌的MBC为 0.
5 g/mL;对大肠杆菌的 MBC为0.125 g/mL。
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表 1　山莓化学成分鉴定结果
检查项目 　　　　　　试管预试法 　　　　　　　　　　　　　圆形滤低层折法试剂(处理) 结果 试剂(处理) 结果
酚性成分 三氯化铁试验 + 2%三氯化铁乙醇+2%铁氰化钾液等量混合喷雾 +
重氮化试验 +
有机酸 显色试验 + 0.1%甲基红乙醇+0.1%甲基橙乙醇+0.1%石蕊水混合液 +
pH 值 4.8
生物碱 硅钨酸试验 + 改良碘化铋钾试剂喷雾显色 +
碘化铋钾试验 +
碘化汞钾试验 -
氨基酸 加热或加酸沉淀试验 - 0.1%茚三酮水溶液喷雾显色 -
多肽 双缩脲试验 +
蛋白质 茚三酮试验 - +
糖和多糖 碱性酒石酸铜试验 +
α-萘酚试验 +
多糖试验 +
皂甙 泡沫试验 +
L-B反应 +
鞣质 氯化钠白明胶试验 +
三氯化铁试验 +
黄酮及其甙类 盐酸-锌粉试验 + 紫外灯光照明显黄绿色喷三氯化铁后加强 +
荧光试验 +
蒽醌及其甙类 碱性试验 + 喷 2%氢氧化铵液 +
醋酸镁试验 -
强心甙类 3 , 5-二硝基苯甲酸试验 + 先喷 2%3 , 5-二硝基苯甲酸乙醇 ,再喷 4%氢氧化钠乙醇 +
碱性苦味酸试验 +
亚硝酰铁氰化钠试验 -
内酯 、香豆素 异羟肟酸铁试验开环闭环反应
+
+ 喷异羟肟酸铁试剂 +
植物淄醇 、
三萜成分
冰醋酸-浓硫酸试验
氯仿-浓硫酸试验
+
- 喷 5%磷钼酸乙醇液 +
挥发油 挥发油试验 -
油脂类 油脂检查
氰苷 苦味酸钠盐试验 -
注:+表示阳性反应 , -表示阴性反应。
　　 表 2　山莓叶生物碱对兽医临床上
5 种常见病原菌的抑制效果
菌种 抑菌圈直径(mm) 敏感度
金色葡萄球菌 15.66±0.51 高敏(H)
巴氏杆菌 11.45±0.21 中敏(M)
链球菌 9.84±0.47 低敏(L)
沙门氏菌 15.78±0.32 高敏(H)
大肠杆菌 16.41±0.52 高敏(H)
3　讨论
现在已知中草药中具有抗菌活性的有效成分主
要有:多糖 、苷 、生物碱 、有机酸 、黄酮 、挥发油 、鞣质
等 ,这些化学成分对细菌表现出不同的抑制作用。
在实验中山莓叶含有生物碱 、有机酸 、多糖 、鞣质等
有效成分 ,它们对细菌都会产生一定的抑制作用 ,可
进一步进行研究。
结果表明山莓叶不仅对大肠杆菌和金黄色葡萄
球菌有很强的抑菌作用。而且对沙门氏菌 、巴氏杆
菌 、链球菌也有较强的抑菌作用 ,因此 ,可以用于各
种化脓性疾病 ,乳腺炎[ 7] 、腹泻 、仔猪黄痢 、败血症及
胃肠炎等细菌性疾病 。
山莓叶作为一种苗药 ,具有来源广 、价格便宜 、
对多种病原菌均具有较强的抗菌作用等优点 ,是一
种很有开发前景的抗菌中草药 ,可将其有效成分研
制成各类制剂用于兽医临床。
(下转第 30页)
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有感染性[ 5] 。包囊是由于幼虫机械性和化学性刺激
作用于周围的肌纤维引起肿胀和肌纤维膜增生而形
成。
从旋毛虫的生活发育史上看 ,血液中出现大量
幼虫仅在幼虫移行到体循环时出现 ,约在感染后第
12天 ,而且持续时间并不长。这与本次实验中 ,从
血液和血清中难以检测到虫体抗原的实验结果是一
致的 。
3.3　全血样品最早检出阳性抗体的时间
全血样品最早检出阳性抗体的时间为 ,高感染
量组感染后 35 d 、中感染量组和低感染量组为感染
后42 d;血清样品最早检出阳性抗体的时间为:低感
染量组感染后 21 d 、中感染量组和高感染量组为感
染后 28 d 。由于旋毛虫是一个多细胞的个体 ,生活
史复杂 ,其抗原具有复杂性和多源性的特点 ,既有体
抗原 ,也有代谢抗原[ 6] 。这决定了宿主对旋毛虫感
染后产生的免疫应答是一个极其复杂的动态过程 。
本次试验观察到 ,试纸检出的旋毛虫抗体出现的快
慢既与感染量的高低有关 ,也与试验猪的个体差异
有关 ,而且血清样品的检测效果优于全血样品 ,但由
于实验所用的检测器材和检测方法的限制 ,其详细
机理尚有待进一步深入研究。
3.4 　猪旋毛虫病胶体金试纸快速检测法作为免疫
分析技术的一种 ,是抗体技术 、免疫层析技术和金标
显色技术的综合运用。该方法具有试纸携带和保存
方便 ,不需特殊仪器设备和试剂 ,操作简单 、时间短 、
结果直观 、容易判断 、不需要专业技术人员和实验室
等优点 ,而且其特异性 、敏感性基本符合检测需要 ,
既可用于生前检测诊断 ,也可用于屠宰过程的宰后
检验 ,特别适合于基层动物防疫监督机构在旋毛虫
病普查 、产地检疫以及屠宰场宰前 、宰后检疫等各项
工作中采用 。根据实验结果 ,我们建议使用抗体试
纸条检测血清或肌肉样品。
参考文献:
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[ 6] 　李国清.兽医寄生虫学[ M ] .广东高等教育出版社 ,
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(上接第 27页)
　　 表 3　山莓叶生物碱对兽医临床 5种常见病原菌的最低抑菌浓度
菌种 药物浓度(g/ mL)
1 0.5 0.25 0.125 0.063 0.031 0.016 0.008 1 0
金色葡萄球 - - - - + + + +++ - +++
巴氏杆菌 - - - + + + ++ +++ - +++
链球菌 - - + + + + ++ +++ - +++
沙门氏菌 - - - - + + ++ +++ - +++
大肠杆菌 - - - - + + ++ +++ - +++
　　注:“ -”代表抑菌 ,“ +”表示长菌 ,“ ++”表示长菌较多 , “ +++”表示长菌旺盛。
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