全 文 ：菘蓝根腐病菌毒素最适浓度的筛选及其对菘蓝幼苗可溶性蛋白的影响
陈桂平 ,客绍英 ,陈玉芹　(唐山师范学院生命科学系 ,河北唐山 063000)
摘要　[目的 ]为深入研究菘蓝对根腐病的抗性机制提供理论依据。 [方法]采用不同浓度菘蓝根腐病菌毒素处理菘蓝幼苗 , 筛选最适
处理浓度;对最适浓度毒素处理过的菘蓝幼苗的外部形态进行鉴定 ,并测定其可溶性蛋白的含量。 [结果]稀释 10、20倍毒素处理过的
菘蓝幼苗在试验期间全部萎蔫死亡 ,稀释 40、50倍毒素处理过的菘蓝幼苗在试验期间大部分无病变现象 ,稀释 30倍毒素处理过的菘蓝
幼苗病变现象明显 ,处理 72h后 50%幼苗萎蔫死亡。经稀释 30倍毒素处理的菘蓝幼苗可溶性蛋白的谱带大体相同 ,但也出现了个别特
异性条带;经毒素处理的样品蛋白条带数多于对照 ,且染色较深。 [结论 ]菘蓝根腐病菌毒素的筛选压力以稀释 30倍最好。
关键词　菘蓝;根腐病菌;可溶性蛋白
中图分类号　S432　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)33-16392-03
SelectiononOptimalConcentrationofPathotoxinProducedbyRootRotFungusinIsatisindigoticaFort.andItsEffectonSoluble
ProteininIsatisindigoticaFort.Seedlings
CHENGui-pingetal　(LifeScienceDepartmentofTangshanNormalUniversity, Tangshan, Hebei063000)
Abstract　[ Objective] TheaimwastoprovidethetheoreticalbasisforfurtherstudyonresistancemechanismofIsatisindigoticaFort.onroot
rotdisease.[ Method] I.indigoticaseedlingsweretreatedbypathotoxinproducedbyrootrotfungusinI.indigoticawithdifferentconcn.,
andtheoptimaltreatmentconcn.wasselected.TheexternalmorphologiesofI.indigoticaseedlingstreatedbypathotoxinwiththeoptimalcon-
cn.wereidentified, andthesolubleproteincontentsinI.indigoticaseedlingsweredetermined.[ Result] TheI.indigoticaseedlingstreated
bypathotoxinwhichwasdiluted10and20timeswerealwiltinganddeadduringtestperiods, andthosetreatedbypathotoxinwhichwasdilu-
ted40 and50timeshadnolesionsphenomenonduringtestperiodsandthosetreatedbypathotoxinwhichwasdiluted30timeshadobviousle-
sionsphenomenon, and50%seedlingswerewiltinganddeadafter72hofthetreatment.TheproteinbandsofI.indigoticaseedlingstreated
bypathotoxinwhichwasdiluted30timeswereroughlyequal, butthereweresomespecificbandsappearedalso.Proteinbandsofthesamples
treatedbypathotoxinwasmorethanthatofCK, andthestainofthebandswasrelativelydark.[ Conclusion] Diluting30timeswasthebest
screeningstressofpathotoxinproducedbyrootrotfungusinI.indigotica.
Keywords　IsatisindigoticaFort.;Rootrotfungus;Solubleprotein
基金项目　唐山市科技局资助项目(06234501A-9)。
作者简介　陈桂平(1972-),女 ,河北泊头人 , 硕士 ,副教授 ,从事植物
分子遗传学研究工作。
收稿日期　 2009-07-21
　　菘蓝根腐病是菘蓝的主要病害之一 ,严重影响菘蓝的品
质和产量。根腐病由镰刀菌属真菌侵染所致 ,镰刀菌毒素被
认为是导致植物产生病害的主要原因之一 [ 1] 。近年来 ,有关
毒素生物活性的鉴定研究较多 ,如王福妹等用毒素针刺番茄
叶片使之产生褪绿斑 ,说明毒素对叶细胞具有杀伤作用 ,且
毒素对叶片的损伤程度与其浓度具有密切的关系 ,高浓度毒
素致病力较强 ,稀释 100×以上的低浓度毒素几乎无致病
力 [ 2] 。因此 ,筛选毒素对植物作用的最适浓度 ,进而研究植
物的抗病机理具有非常重要的意义 。
病原相关蛋白(Pathogenesis-relatedproteins, PRs)也称病
程相关蛋白 ,是植物被病原菌感染后形成的与抗病性有关的
一类可溶性蛋白 [ 3] 。而可溶性蛋白质对生物的生长发育起
着至关重要的作用 ,植物的某些病害可能与可溶性蛋白种类
及含量有关。笔者研究了菘蓝幼苗经根腐病菌毒素处理前
后样品可溶性蛋白谱带的变化 ,揭示其可能存在的病程相关
蛋白 ,以期为深入研究该病的抗性机制和有效防治提供理论
依据。
1　材料与方法
1.1　材料　供试菌种为菘蓝根腐病病原菌(河北农业大学
提供)。
1.2　方法
1.2.1　根腐病菌最适浓度的筛选。
1.2.1.1　菘蓝幼苗的培养。挑选饱满的宽叶菘蓝种子 ,流
水浸泡 3 h。在超净工作台上用无菌水冲洗 3 ～ 4次 ,然后用
70%乙醇表面消毒 30s, 0.1%升汞消毒 6～ 12 min,无菌水冲
洗 4次 ,接种于 1/2MS培养基中。置于 23 ℃温箱中培养。
1.2.1.2　不同浓度粗毒素提取液的配制。将根腐病菌粗毒
素原液用 Hogland营养液分别稀释 10、20、30、40、50倍 ,各取
100ml待用。
1.2.1.3　不同浓度不同时间毒素处理菘蓝幼苗的表观鉴
定。取配制好的不同浓度的粗毒素提取液及 Hogland营养液
(对照组)各 20 ml分装于 6个 80 ml的小烧杯中 ,将整齐一
致的菘蓝幼苗根部浸泡于小烧杯内 ,每烧杯 3棵 , 5个重复。
将幼苗放入恒温培养箱中 23℃培养 ,每隔 6、12、24、48、
72 h观察 1次 ,记录幼苗萎蔫情况和死亡比例 ,筛选出致病
效果最好的毒素浓度作为毒素胁迫菘蓝幼苗的最适浓度。
1.2.2　可溶性蛋白分析。
1.2.2.1　可溶性蛋白的 SDS-PAGE电泳分析。
(1)样品制备。配置最适浓度的毒素 100 ml,平均分装
于 5个 80ml的小烧杯中 ,每烧杯 20 ml,另取 1个小烧杯装
20 mlHogland营养液为对照 ,将整齐一致的菘蓝幼苗根部浸
泡其中 ,每烧杯若干棵 ,每隔 6、12、24、48、72 h取样 1次。采
用改良丙酮沉降提取法提取可溶性蛋白 ,挑选较好的样品置
于 -20℃环境中保存 。
(2)电泳。采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶进行电泳 ,分
离胶浓度 10%, pH值 8.8;浓缩胶浓度 5%, pH值 6.8;电极
缓冲液为 Tris-甘氨酸(pH值 8.3)。以溴酚蓝甘油为指示
剂 ,双板电泳 ,电泳初始电流 20 mA,待样品前沿进入分离胶
时 ,电流调至 50 ～ 60 mA,电压为 100 V,电泳至溴酚蓝标志
到达距凝胶前沿 1.5cm时停止电泳。
(3)考马斯亮蓝 G-250染色 、固定 、照像 、绘图。计算条
带迁移率 Rf值。
责任编辑　常俊香　责任校对　傅真治安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(33):16392-16394
1.2.2.2　可溶性蛋白含量测定。
(1)样品提取。称取样品各 0.25g,加入少量石英砂和 5
ml提样缓冲液研磨成匀浆 , 3 000r/min离心 10min,取上清 。
(2)蛋白质含量测定。吸取样品提取液 1.0 ml,放入具
塞试管中(每个样品重复 2次),加入 5 ml考马斯亮蓝 G-250
溶液 ,充分混匀 ,放置 2 min后在 595 nm处比色 ,测定其吸光
度 ,并通过标准曲线计算蛋白质含量。
2　结果与分析
2.1　不同浓度不同时间毒素处理后幼苗的表观鉴定结果　
由表 1和图 1可知 ,稀释 10 ×、20×毒素试验期间菘蓝幼苗
全部萎蔫或死亡 ,稀释 40×、50×毒素试验期间大部分菘蓝
幼苗无病变现象 ,而稀释 30×毒素处理的幼苗病变现象明
显 ,且处理 72h后 50%菘蓝幼苗萎蔫死亡。说明稀释 30×
为毒素最佳选择压力。
表 1　不同浓度不同时间毒素处理后幼苗的表观鉴定结果
Table1　TheexternalcharacteridentificationofIsatisindigotiaFortseedlingstreatedbydifferenttimeanddifferentconcentration
毒素稀释倍数
Dilutiedmultipleoftoxin
菘蓝幼苗表观特征
ExternalcharacteridentificationofIsatisindigotiaFortseedling
10× 菘蓝幼苗 6h即出现萎蔫, 12h时幼苗接近死亡, 72h时幼苗全部死亡(图 1A)
20× 菘蓝幼苗萎蔫和死亡时间推迟至 12、24、72h时幼苗全部死亡(图 1B)
30× 菘蓝幼苗萎蔫和死亡时间推迟至 24～ 48h, 72h时幼苗约 50%死亡(图 1C)
40× 菘蓝幼苗无死亡苗出现 ,但大部分幼苗萎蔫(图 1D)
50× 菘蓝幼苗无死亡苗出现 ,且幼苗萎蔫程度比 40倍毒素处理的低(图 1E)
对照组 Control 幼苗在整个试验段内一直健康成长(图 1F)
注:图中 A～E分别代表毒素稀释 10～ 50倍的处理 , F为对照;① ～⑤分别代表 6、12、24、48、72h的处理。
Note:A-Estandfortreatmentbytoxindilutedby10-50timesandFstandsforcontrol;①-⑤ standfortreatmentafter6, 12, 24, 48, 72h.
图 1　不同浓度不同时间毒素处理后幼苗的表观鉴定结果
Fig.1　TheexternalcharacteridentificationofIsatisindigotiafortseedingtreatedbydifferenttimeanddifferentconcentration
2.2　SDS-PAGE电泳图谱分析　由图 2可知 ,稀释 30倍毒
素处理后 , 6个样品的主谱带基本一致 ,每样品至少出现 30
条清晰的谱带 ,其中共有带大约占 94%,差异条带约占 6%,
A、B、C、D为 6个样品的主带 ,着色较深。总体来看 ,经过毒
素处理的样品条带较对照多且着色较深 。其中处理 12 h的
样品较其他样品多 1条 E带(其他样品的 E带不清晰);处理
12、24 h的样品较其他样品多 1条 F带 ,处理 6 h的样品和对
照样品无 G带 ,处理 12 h的样品较其他样品多 1条 H带 ,处
1639337卷 33期　　　　　　　　　　　陈桂平等　菘蓝根腐病菌毒素最适浓度的筛选及其对菘蓝幼苗可溶性蛋白的影响
理 6、48h的样品整体上谱带着色较浅 ,但也可能是电泳操作
不精确造成的 。另外 ,同一种蛋白谱带在不同样品中的带
宽 、颜色深浅不同 ,如 E带在处理 12 h样品中着色最深 , B带
在处理 24h样品中最宽 ,说明不同时间段样品中可溶性蛋白
的种类和含量不同。
注:蛋白带A、B、C、D、E、F、G、H的迁移率依次为 0.075、0.448、
0.687、0.851、0.119、0.254、0.537、0.881。
Note:A-Hstandfordiferentproteinbands, withRfof0.075, 0.448,
0.687, 0.851, 0.119, 0.254, 0.537, 0.881resp.
图 2　处理不同时间样品的电泳图谱
Fig.2　Theelectrophoresisofthesamplestreatedfordifferent
time
表 2　不同时间段样品的吸光度及蛋白质含量
Table2　Theabsorbencyandproteincontentofthesamplesatdifer-
enttime
处理时间
Treating
time
吸光度
Absorbency
平均吸光度
Avarage
absorbency
蛋白质含量
μg/g
Contentofprotein
0 0.558 0.552 0.594 0.568c 440.382
6 0.590 0.556 0.562 0.569c 441.479
12 0.596 0.577 0.556 0.576c 446.958
24 0.637 0.598 0.667 0.634b 494.630 4
48 0.651 0.666 0.657 0.658b 514.356
72 0.822 0.792 0.804 0.806a 636.936
图 3　不同处理时间样品可溶性蛋白含量变化
Fig.3　Thechangesofthecontentofsolubleproteininsamples
treatedfordifferenttime
3　结论与讨论
3.1　毒素最适浓度的筛选　自 20世纪 80年代开始 ,以病菌
粗提液为选择压的技术在水稻抗病突变体离体筛选中得到
广泛应用 [ 4] 。有关稻瘟病菌培养液产生致病毒性的现象和
鉴定方法曾有报道 [ 5-7] ,病毒粗提液的毒性因毒素浓度和品
种遗传背景不同而具有明显差异 ,毒素浓度越大其毒性越
强。该研究用粗毒素提取液对菘蓝幼苗的生长产生了一定
的毒负作用 ,说明粗毒素具有一定的致病力。不同浓度粗毒
素提取液处理后菘蓝幼苗均出现萎蔫状况 ,但萎蔫时间和程
度不同 ,稀释倍数低的毒素处理后幼苗萎蔫和死亡程度较
高 ,稀释倍数高的毒素处理后幼苗萎蔫和死亡程度较低;稀
释 30×毒素处理的幼苗开始无明显病变现象 ,随着处理时间
的延长幼苗病变现象逐渐明显 ,处理 72 h时幼苗接近 50%
死亡;由此可以确定稀释 30×为毒素最适浓度。以此最适浓
度为选择压力可对菘蓝幼苗机体的变化进行深入研究。
3.2　最适毒素浓度胁迫下菘蓝幼苗可溶性蛋白的变化　健
康植物中不存在病原相关蛋白或含量较低 ,而当植物被病原
菌感染或诱导后 ,病原相关蛋白则迅速产生并累积 ,在植物
总蛋白电泳图谱上出现新的蛋白带或强烈增加的蛋白带 [ 8] 。
该试验结果表明 ,高浓度毒素处理的菘蓝可溶性蛋白的含量
比低浓度处理和对照多 ,其原因是毒素对菘蓝幼苗产生毒害
后 ,菘蓝体内很多平衡遭到破坏 ,蛋白质合成增加 ,可溶性蛋
白质含量增加。由图 3可知 ,随着病毒处理时间的延长 ,菘
蓝体内可溶性蛋白含量呈上升趋势。
由 SDS-PAGE电泳图谱可知 ,诱导产生(或增强)的蛋白
谱带一般出现在诱导处理后 24、48 h,且随着处理时间的延
长新增蛋白带的数量仍有增加趋势。随着 PRs研究的广泛
开展 ,人们在越来越多的植物体中诱导产生了 PRs。大量研
究表明 , PRs可参与植物的诱导抗病性 ,几丁质酶和 β-1, 3-
葡聚糖酶是植物潜在的抗病物质 [ 9] 。该试验初步证明 ,当菘
蓝受到毒素胁迫时 ,随着胁迫时间的延长菘蓝体内可溶性蛋
白的种类和数量均有所增加 ,但有关这些可溶性蛋白的进一
步签定及其与菘蓝抗病机理之间的关系尚有待于进一步
研究。
参考文献
[ 1] 邰连春.板蓝根病害的发生及其防治方法 [ J] .中国林副特产, 2005
(3):54-55.
[ 2] 王福妹 ,樊慧梅 ,闫建芳,等.番茄煤霉病菌致病毒素提取及其活性测
定[ J] .安徽农业科学 , 2006, 34(5):938-939, 941.
[ 3] SUNITAF, BISARIAVS,SRIVASTAVAAK.Biotechnologicalaspectsof
theproductionoftheanticancerdrugpodophylotoxin[ J].ApplMicrobiol
Biotech-nol, 2004, 65:504-519.
[ 4] 李朝灿 ,甘代耀.水稻抗瘟突变体筛选的初步研究 [ J].福建农业科技,
1985(6):34-44.[ 5] 张君成 ,韦绍兴 ,张超冲.稻瘟病菌粗毒素的定量生物测定法研究[ J].
河北农业大学学报, 1996, 19(3):24-28.
[ 6] 郑祖玲 ,褚启人 ,张承妹.稻瘟病原菌粗毒素对水稻的致病性 [ J].上海
农业学报, 1985(2):85-90.
[ 7] 王金陵 ,陈璋,陈启峰.稻瘟病菌粗毒素的制备及其对水稻毒性的测定
[ J].福建农学院学报 , 1988, 17(4):318-322.
[ 8] 杨显志 ,郭仕平 ,张玲琪.鬼臼类植物产鬼臼毒素内生真菌的筛选[ J].
天然产物研究与开发 , 2003, 15(5):419-422.
[ 9] 蓝海燕 ,田颖川 ,王长海 ,等.表达B21, 32葡聚糖酶及几丁质酶基因的
转基因烟草及其抗真菌病研究 [ J].遗传学报 , 2000, 27(1):70-77.
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