全 文 ：段英姿． 四倍体菘蓝 ISSR － PCR反应体系优化与遗传差异分析［J］． 江苏农业科学，2012，40(9) :36 － 39．
四倍体菘蓝 ISSR － PCR反应体系优化与遗传差异分析
段英姿
(唐山师范学院生命科学系，河北唐山 063000)
摘要:采用单因子试验，研究引物、dNTPs、Mg2 +、Taq DNA聚合酶及退火温度对 PCR 扩增的影响，用其建立优化
四倍体菘蓝的 ISSR － PCR反应体系，分析不同四倍体菘蓝株系的遗传差异性。结果发现 ISSR － PCR 最佳反应体系
为:在 25 μL的反应体系中，引物浓度为 0． 76 μmol /L，dNTPs浓度为 190 μmol /L，MgCl2 浓度为 200 μmol /L，Taq DNA
聚合酶用量为 1． 5 U，模板 DNA浓度为 20 ng /μL;确定了不同引物最佳退火温度;菘蓝株系间具有中等偏高的遗传差异
性，多态性条带达 58． 22%。表明采用单因子试验可以快速建立 ISSR － PCR反应体系，可用于菘蓝遗传差异性分析。
关键词:四倍体;菘蓝;遗传差异性;ISSR － PCR;退火温度
中图分类号:S567． 23 + 9． 03 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2012)09 － 0036 － 03
收稿日期:2012 － 02 － 09
基金项目:河北省唐山市科技攻关项目(编号:04360701B － 10)。
作者简介:段英姿(1974—) ，女，山东人，硕士，讲师，主要从事植物遗
传育种与生物技术教学和科研工作。Tel: (0315)3863212;
E － mail:dyz03247@ sohu． com。
菘蓝(Isatis indigotica Fort．)以根和叶入药，在临床上主
要用于治疗流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性乙型脑炎、急
性传染肝炎及咽喉肿痛等，市场对此需求量较大。因此，为了
适应生产的需要，很多研究已经培育出四倍体菘蓝［1］。
ISSR (inter － simple sequence repeats)是在微卫星技术上
发展起来的一种分子标记技术［2］，与其他标记技术相比，具
有稳定性好、多态性高、操作简单、快速等特点，被广泛应用于
遗传多样性的研究。目前，适用于四倍体菘蓝的ISSR － PCR
反应体系和遗传多样性研究还未见报道。本试验主要研究反
应体系中 Mg2 +、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、引物浓度等对 PCR
反应的影响，以及引物退火温度的确定，建立适用于四倍体菘
蓝的 ISSR － PCR反应体系，并对不同四倍体株系进行遗传差
异性分析，为研究四倍体菘蓝遗传稳定性奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料与试剂
实验室培育并经过细胞学鉴定为四倍体的菘蓝的不同株
系［1］;ISSR 引物、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、Buffer、Marker 及
AgroseI琼脂糖等购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1． 2 菘蓝基因组 DNA的提取
采用改良的 CTAB法提取 DNA［3］，紫外分光光度计检测
其质量和浓度，最后稀释调整 DNA 浓度至 20 ng /μL，放入
－ 20 ℃ 冰箱中贮存备用。
1． 3 ISSR反应体系的建立与优化
1． 3． 1 PCR反应及电泳 试验采用的反应程序为:95 ℃充
分变性 5 min;94 ℃变性 1 min，52 ℃退火 1 min，72 ℃延伸
2 min，37 个循环;72 ℃延伸 5 min，4 ℃终止反应保存。PCR
产物在 1． 8%琼脂糖凝胶上电泳分离，用 DL 2000 作为标准
相对分子量对照。溴化乙锭(EB)染色显带，紫外光下 UV 凝
胶成像系统观察并成像。
1． 3． 2 ISSR － PCR 最佳反应体系的筛选 经预试验初步筛
选出扩增片段清晰、扩增条带多的引物 M67，序列为 DBD
(AC)7。针对 Mg2 +浓度、Taq DNA 聚合酶量、dNTPs 浓度、引
物浓度及退火温度分别设计单因子试验，其中 Mg2 +浓度分别
为 180、200、220、240、260 μmol /L，Taq DNA 聚合酶量分别为
1. 0、1． 5、2． 0 U，dNTPs 浓度分别为 110、130、150、170、
190 μmol /L，引物浓度分别为 0． 48、0． 56、0． 64、0． 76、
0． 80 μmol /L;退火温度分别为 46． 3、47． 1、48． 4、49． 8、51． 3、
52． 7、54． 1、55． 6、56. 9、57． 7 ℃。
1． 3． 3 ISSR数据统计与分析 利用上述已筛选建立的 ISSR
反应体系对合成的 60 条 ISSR 引物进行二次筛选，并选用扩
增结果较好的 19 个 ISSR 引物对 1 个二倍体和 10 个四倍体
株系样品的总 DNA进行扩增，分析其遗传差异性。选择扩增
条带较为清晰且有多态性的 ISSR标记进行数据统计，对照反
应产物在胶上的对应位置，有扩增条带的记为“1”，无扩增条
带的记为“0”，得到原始数据。根据出现频率≤0. 99 的条带
定位多态位点，并计算多态位点百分率。利用 DPS 数据处理
系统 0 － 1 数据系统聚类分析软件完成聚类分析。
2 结果与分析
2． 1 ISSR － PCR反应体系的筛选
改变 ISSR － PCR 反应体系中的不同因子，扩增结果见图
1 至图 5。
2． 1． 1 引物浓度的影响 如图 1 所示，除引物浓度为
0． 48 μmol /L 时部分主带减弱外，引物浓度 0． 56 ～ 0． 76 μmol /L
ISSR扩增的谱带均保持稳定，且条带清晰可辨，0． 80 μmol /L
时带形减弱。结果表明，在 25 μL 反应体系中引物浓度定为
0． 76 μmol /L为佳。
2． 1． 2 dNTPs 浓度的影响 如图 2 所示，dNTPs 浓度为
190 μmol /L 时扩增产物清晰且条带整齐，没有带缺失现象，
表明 190 μmol /L为 25 μL 反应体系最佳 dNTPs浓度。
2． 1． 3 Mg2 + 浓度的影响 如图 3 所示，Mg2 + 浓度
200 μmol /L 时扩增产物清晰且条带整齐，没有带缺失现象;
随着浓度的升高，Taq DNA聚合酶活性受到影响，导致带缺失
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DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2012.09.090
现象。表明 200 μmol /L为 25 μL反应体系最佳 Mg2 +浓度。
2． 1． 4 Taq DNA聚合酶量的影响 如图 4 所示，Taq DNA聚
合酶用量为 1． 5 U 时扩增带型清晰、整齐，是比较理想的结
果;2． 0 U时有条带缺失或稍弥散。在考虑节约酶用量的条
件下，25 μL ISSR － PCR 反应体系中采用 1． 5 U Taq DNA 聚
合酶比较适宜。
2． 1． 5 退火温度的确定 从 60 条 ISSR 引物中共筛选出条
带清晰、重复性好、阴性对照无带的 19 个随机引物作为正式
扩增引物。对不同引物的最佳退火温度进行筛选，部分扩增
结果见图 5。不同退火温度对 ISSR － PCR扩增结果影响差异
较大。ISSR － PCR 反应中的退火温度与引物合成报告单上
的 Tm值紧密相关，但两者并不一致，大多数引物在退火温度
为 52 ℃时均有清晰、稳定的扩增片段，少数引物表现出退火
温度偏高或偏低现象，筛选的 19 个引物的最佳退火温度见
表 1。
2． 2 不同二倍体、四倍体菘蓝株系的 ISSR扩增
用筛选的 19 个随机引物对 11 个株系进行扩增，19 个引
物共扩增出 213 个 DNA 条带，平均每个引物扩增的 DNA 带
数为 11． 21 条。其中，多态条带总数为 124 条，多态性条带百
分率达到 58． 22%，说明它们具有中等偏高的遗传差异性。
部分引物在 11 个株系中的 ISSR 扩增结果见图 6，可知四倍
体株系与二倍体株系之间除主条带一致外条带数量和大小都
存在差异，有些四倍体株系条带数多于二倍体，有些少于二倍
体，显示了其遗传差异性。
2． 3 ISSR聚类分析
根据任意 2 株系间的 ISSR电泳条带数据，采用 DPS数据
处理系统，利用 Jaccard 法计算出各株系间的遗传距离(表
2) ，构建聚类图(图 7) ，可以看出:20a与 wdb6 的遗传距离为
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表 1 ISSR引物和最佳退火温度
引物编号 引物序列 退火温度(℃)
M61 (AC)8YA 52． 7
M62 (GA)8YC 54． 1
M63 (AC)8YT 56． 9
M64 HVH(TG)7 55． 6
M65 (GACA)4 52． 7
M66 BHB(GA)7 52． 7
M67 DBD(AC)7 52． 7
M68 VHV(GT)7 49． 8
M69 (GGAT)4 51． 3
M610 (CTTCA)3 52． 7
M611 BDB(CA)7 52． 7
M612 HBH(AG)7 54． 1
M613 (GA)8YT 52． 7
M614 VBV(AT)7 51． 3
M615 (GATA)4 52． 7
M616 (GACA)4 51． 3
M617 (GGAGA)3 52． 7
M618 (TGCA)4 52． 7
M619 (AG)8YC 55． 6
表 2 Jaccard系数估算的 11 个株系间的遗传距离
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1
2 0． 211 0
3 0． 938 7 0． 893 3
4 0． 616 2 0． 524 0 0． 704 6
5 0． 469 7 0． 301 4 0． 692 7 0． 321 6
6 0． 239 0 0． 883 7 0． 577 2 0． 797 1 0． 670 0
7 0． 431 6 0． 299 4 0． 698 7 0． 316 5 0． 256 7 0． 852 4
8 0． 673 3 0． 536 0 0． 727 3 0． 614 4 0． 459 4 0． 703 3 0． 440 1
9 0． 469 7 0． 313 1 0． 698 7 0． 316 5 0． 256 0 0． 820 6 0． 000 0 0． 445 3
10 0． 602 9 0． 459 4 0． 666 9 0． 419 2 0． 384 0 0． 804 0 0． 153 1 0． 336 7 0． 143 9
11 0． 209 6 0． 349 3 0． 841 7 0． 530 6 0． 503 5 0． 196 0 0． 299 4 0． 721 4 0． 296 9 0． 452 1
0，当遗传距离在 0． 15 左右时，20a、wdb6 与 39a 归为最近一
类。而当遗传距离在 0． 2 左右时，二倍体、wdb20 和 37a 具有
相同的遗传距离，归为一类。当遗传距离在 0． 55 左右时，97a
和 wyt具有相同的遗传距离，归为一类。当遗传距离在 0． 63
时，11 个株系被分为两大类，第一类包括 97a、wyt;第二类包
括二倍体、wdb20、29a、wdb8、20a、wdb5、wdb6、39a、37a，共 9
种。在 0． 22 ～ 0． 33 遗传距离内，11 个株系可以分为 5 类，分
类显得较多，表明四倍体株系虽然都来源于二倍体，但是存在
不同程度的变异。
3 讨论
3． 1 各因素对菘蓝 ISSR － PCR反应体系的影响
试验中发现，Mg2 +浓度与 Taq DNA聚合酶量比例对扩增
结果影响较大，使用大量的 Taq DNA 聚合酶不仅增加试验成
本，而且极易产生非特异性扩增产物;使用量过低则会导致产
物的合成效率下降，因此应选择合适的酶用量。同时 Taq
DNA聚合酶是 Mg2 +依赖性酶，对 Mg2 +浓度非常敏感，Mg2 +
太少会降低 Taq DNA聚合酶的功效，使得 PCR 合成率下降，
太多又会导致非特异性扩增的增加，所以 Mg2 +的量要和 Taq
DNA聚合酶的量搭配合适。dNTPs作为 PCR 反应的原料，量
太少会使扩增反应进行不完全，而用量过多则可能导致 PCR
错配甚至产生非特异性扩增，这与王亚等的报道［4］相似。另
外，引物的退火温度对扩增条件影响也较大，虽然每个引物都
有一定的 Tm值，但是试验发现该值并不适合每个物种，有的
偏低，有的偏高，因此需要筛选每个引物的退火温度，才能达
到最佳效果。ISSR － PCR 对模板的要求并不严格，本研究采
用的基因组 DNA浓度为 20 ng /μL，能取得良好的扩增效果。
因此，筛选建立的菘蓝 ISSR标记的最佳PCR反应体系
(下转第 39 页)
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櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
(上接第 38 页)
为:25 μL的反应体系中，引物浓度 0． 76 μmol /L，dNTPs 浓度
190 μmol /L，MgCl2 浓度 200 μmol /L，Taq DNA 聚合酶用量
1. 5 U，模板 DNA浓度 20 ng /μL;不同引物退火温度不同。
3． 2 不同四倍体菘蓝株系遗传差异性
利用 ISSR技术对 11 个不同株系的菘蓝进行扩增、聚类
分析可知，10 个四倍体株系虽然都来源于二倍体材料，但是
除主条带与二倍体保持一致外，每个株系还存在部分多态位
点，其中四倍体 wdb20、37a和二倍体遗传距离最近，多态位点
少;97a、wyt与二倍体的遗传距离最远。原因可能是染色体
诱变加倍时，秋水仙碱的浓度、作用时间、作用部位以及外部
环境条件的差异造成了菘蓝同源四倍体在遗传结构(基因组
DNA)上发生变异的程度不一。这与赵卫国等利用 ISSR分析
桑树二倍体及同源四倍体遗传差异中的结果［5］相似。但与
栾丽等用 SSR标记检测水稻二倍体与同源四倍体的遗传差
异的结果［6］差异较大。
11 个不同株系的菘蓝经过合适的引物扩增，共扩增出
213 条清晰的条带，得到的多态性比例为 58． 22%，遗传距离
为 0． 143 9 ～ 0． 938 7，说明不同株系间的遗传差异可以用
ISSR 技术研究。综上所述，该研究利用 ISSR 标记技术初步
揭示了同源四倍体不同株系及其二倍体间的遗传差异，为进
一步在分子水平面向多方向研究多倍体菘蓝植物提供了理论
基础。但是对于都是来源于二倍体的同源四倍体不同株系为
什么会有这么大差异的研究，目前还处于起始阶段，可供参考
的资料还很少，还需要进一步的研究。
参考文献:
［1］段英姿，陈玉琴，柴凤瑞． 秋水仙碱诱导菘蓝多倍体的研究［J］．
唐山师范学院学报，2006，28(2) :21 － 23．
［2］廖 丽，郭巧生． 夏枯草 ISSR 分子标记技术的建立与体系优化
［J］． 中草药，2009，40(7) :1131 － 1134．
［3］段英姿，客绍英，马艳芝，等． 四倍体菘蓝基因组 DNA 提取方法
的比较［J］． 安徽农业科学，2010，38(17) :8869 － 8870，8885．
［4］王 亚，郭志强，王宏伟，等． 单雌蓖麻 ISSR － PCR反应体系的建
立和优化［J］． 山西农业科学，2010，38(1) :15 － 18．
［5］赵卫国，苗雪霞，黄勇平，等． 桑树二倍体及其同源四倍体遗传差
异的 ISSR分析［J］． 蚕业科学，2005，31(4) :393 － 397．
［6］栾 丽，孔繁伦，何 涛，等． 用 SSR标记检测同源四倍体与二倍
体水稻的遗传差异［J］． 应用与环境生物学报，2004，10(5) :
556 － 558．
王加连． 基于生物信息学的雁形目鸟类分类及其系统发育关系［J］． 江苏农业科学，2012，40(9) :39 － 41．
基于生物信息学的雁形目鸟类分类及其系统发育关系
王加连
(江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室 /盐城师范学院生命科学与技术学院，江苏盐城 224002)
摘要:为进一步探讨雁形目复杂富有争议的系统发育关系，基于生物信息学方法，从 GenBank获取 27 属 50 种雁
形目鸟类 Cyt b基因，采用贝叶斯方法重建系统发育树。通过与现有形态学及分子生物学研究结果比较，支持将雁形
目分为鸭科、鹊雁科、树鸭科和鸭科，鸭科分为硬尾鸭亚科、雁亚科和鸭亚科的观点。
关键词:Cyt b基因;分类;系统发育;雁形目
中图分类号:S811． 5 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2012)09 － 0039 － 03
收稿日期:2012 － 02 － 21
基金项目:国家自然科学基金(编号:31071897) ;江苏省高校自然科
学重大基础研究(编号:07KJA18017) ;江苏省滩涂生物资源与环
境保护重点建设实验室开放课题(编号:JLCBE09008)。
作者简介:王加连(1965—) ，男，江苏盐城人，硕士，副教授，研究方向
为动物分子生物学、生态学。E － mail:jlw0901@ 163． com。
雁形目(Anseriformes)鸟类是湿地鸟类的重要组成部分，
是湿地环境质量变化的指示物种之一，具有重要的经济价值
和生态价值。一般认为该目现存物种约 43 属 150 种，除南极
大陆外，在世界范围内广泛分布［1］。该目是一个高度分化的
类群，基于形态学、解剖学和行为学等特征和分子生物学证
据，其分类情况及系统发育关系较为复杂而富有争议［1 － 5］。
随着分子生物学技术的发展，在 DNA水平探讨物种的分类及
其系统发育关系，已逐渐成为行之有效的手段之一，分子生物
学技术与传统分类方法的结合极大地推动了分类学的发展。
由于线粒体 Cyt b基因进化速度较快，序列长度高度保守，易
于同源比对，结构和功能在系统分析中易于应用等特点，已成
为系统发育研究的理想分子标记之一［6］。本研究利用生物
信息学方法，从 GenBank 获取雁形目部分鸟类 Cyt b 基因序
列，通过贝叶斯方法重建系统进化树，以期为解决雁形目系统
分类中的一些争议问题提供分子生物学证据。
1 材料与方法
1． 1 Cyt b基因的获得和数据处理
从美国国立生物技术信息中心(NCBI)的 GenBank
(http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov /)下载目标序列，共获得序
列长度大于 1 044 bp的 27 属 50 种雁形目鸟类 Cyt b 基因序
列，并从 GenBank中获取鸡形目红腹锦鸡和鹫珠鸡的 Cyt b
基因序列作为外群(表 1)。利用 ClustalX 1． 83 软件对上述
序列进行多重序列比对，辅以人工校对，得到长度 1 044 bp的
同源序列，用于系统发育分析。
—93—江苏农业科学 2012 年第 40 卷第 9 期