全 文 ：辣木总 DNA最佳提取方法的建立
李海渤
(广东韶关学院英东生物工程学院 ,广东韶关 512005)
　　摘要:分别采用高盐低 pH法 、尿素法 、CTAB法 、SDS法 、PVP法和 CTAB-SDS结合法等 6种方法提取辣木
总 DNA,结果表明 SDS法为提取辣木总 DNA的最佳方法。
　　关键词:辣木;DNA提取;比较研究
　　中图分类号:Q503　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2008)02-0076-03
收稿日期:2007-09-14
基金项目:2004年香港铭源基金(编号:314-140449)。
作者简介:李海渤(1973—),男 ,河北唐山人 ,讲师 , 主要从事植物遗
传育种及分子生物学研究。 Tel:(0751)8659616。
　　辣木(MoringaoleiferaLam.)为辣木树科辣木
属植物 ,原产于印度北部和非洲 ,是多年生深根性常
绿乔木 。辣木是一种具有独特经济价值和营养保健
作用的热带植物 ,被西方科学家誉为 “奇迹之树” ,
欧美等先进国家已将辣木视为新时代的健康食物 。
目前对辣木的研究主要集中在组成成分 、种植技术 、
植物生理 、生产开发等方面 ,分子生物学方面的研究
尚未见报道。要开展其分子生物学方面的相关研
究 ,首先必须获取高质量的 DNA。目前提取及纯化
植物 DNA的方法已经比较成熟[ 1] ,但就某一具体植
物而言 , DNA提取方法不同 , DNA产量和质量也各
不相同 。本试验选取高盐低 pH法 、尿素法 、CTAB
法 、SDS法 、PVP法和 CTAB-SDS结合法等 6种方
法提取辣木总 DNA,以期找出适用于提取辣木总
DNA的最佳途径。
1　材料与方法
1.1　供试材料
辣木由广东韶关学院英东生物工程学院提供 。
选择辣木嫩叶片提取 DNA。
1.2　试剂
三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、Tris酚 、溴化乙锭
(EB)、RNaseA、琼脂糖 (Agarose)、λDNAMarker
(EcoI+HindⅢ)、单核苷酸(dNTPs)、TaqDNA聚合
酶等由北京鼎国生物技术有限责任公司提供。醋酸
钠 、β -巯基乙醇 、尿素 、SDS、PVP、CTAB、柠檬酸钠 、
KAC、NH4Ac、冰醋酸 、异丙醇 、无水乙醇 、三氯甲烷 、
异戊醇 、EDTA、氯化钠 、蔗糖 、溴酚蓝等为国产分析
纯试剂。
1.3　试剂配方
(1)高盐低 pH法提取缓冲液:100 mmol/L
NaAc, 50 mmol/LEDTA, 500 mmol/LNaCl, 2.5%
PVP, 10mmol/Lβ -巯基乙醇 ,调节 pH值至 5.5。
(2)尿素法提取缓冲液:8 mmol/L尿素 , 0.5 mol/L
NaCl, 50 mmol/LTris(pH值 8.0), 20 mmol/LED-
TA, 10 mmol/Lβ -巯基乙醇 , 2%PVP。 (3)CTAB
法提取缓冲液:50 mmol/LTris(pH值 8.0), 0.7
mol/LNaCl, 10 mmol/LEDTA(pH值 8.0), 20
mmol/Lβ -巯基乙醇 , 1% CTAB。(4)SDS法提取
缓冲液:500 mmol/LNaCl, 500 mmol/LTris(pH值
8.0), 50mmol/LEDTA(pH值 8.0), 10mmol/Lβ -
巯基乙醇 。 (5)PVP法提取缓冲液:250 mmol/L
NaCl, 25 mmol/LEDTA, 0.5% SDS, 20 mmol/LTris
(pH值 8.0)。 (6)CTAB-SDS结合法提取缓冲液:
100 mmol/LTris(pH值 8.0), 50 mmol/LEDTA(pH
值 8.0), 1.0 mol/LNaCl, 2%SDS, 2%PVP, 20
mmol/Lβ -巯基乙醇 。 (7)高盐 TE缓冲液:1.0
mol/LNaCl, 10 mmol/LTris(pH值 8.0), 1 mmol/L
EDTA(pH值 8.0)。 (8)TE缓冲液:10 mmol/LTris
(pH值 8.0), 1 mmol/LEDTA(pH值 8.0)。 (9)2
×CTAB提取液:100 mmol/LTris(pH值 8.0), 20
mmol/LEDTA(pH值 8.0), 1.4 mol/LNaCl, 2%
CTAB。 (10)高盐溶液:0.8 mol/L柠檬酸钠 , 1.2
mol/LNaCl。
1.4　仪器
DYCp-32型电泳槽 (北京市六一仪器厂);
DYY-7型转移电泳仪(北京市六一仪器厂);Tan-
—76— 江苏农业科学　2008年第 2期DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2008.02.003
nonUV-2000紫外分析仪;UV300紫外分光光度计;
AnkeTGL-6G型高速冷冻离心机;LDZX-40I型
立式自控电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械
厂);HH-S28S恒温水浴锅(金坛市大地自动化仪
器厂 ,金坛市环保仪器厂)。
1.5　方法
1.5.1　DNA提取方法
1.5.1.1　高盐低 pH法　参照参考文献 [ 2] 。取 2
g新鲜样品 ,加入液氮研磨成粉末 ,加入 3ml高盐低
pH法提取缓冲液 , 65 ℃水浴 1 h。 4 ℃、 10 000
r/min离心 10min,取上清液 。加入 2/3体积的 2.5
mol/LKAc, 4℃放置 15min。加入等体积的 Tris酚
∶氯仿 ∶异戊醇(体积比 25 ∶24 ∶1)轻轻混合 。 4
℃、13 000 r/min离心 15min,取上清液。加入等体
积氯仿 ∶异戊醇(体积比 24 ∶1)轻轻混合 。 4 ℃、
13 000 r/min离心 15 min,取上清液 。加等体积预
冷异丙醇 , 轻轻混合后于 -20 ℃放置 20 min。
13 000 r/min离心 15 min,去上清液 ,沉淀用无水乙
醇洗 2次 ,去乙醇后自然干燥。加入 1 ml高盐 TE
溶解 ,加 20μlRNaseA37 ℃水浴 30 min。加入 2×
预冷乙醇于 -20 ℃放置 30min, 4 ℃、13 000 r/min
离心 15 min,去上清液 ,将沉淀自然干燥后加入 500
μlTE, 4 ℃保存备用。
1.5.1.2　尿素法　参照 Tan等[ 3]的方法加以改进 。
取 2g新鲜样品 ,加入液氮研磨成粉末 ,加入 3ml尿
素法提取缓冲液 , 65 ℃水浴 1 h。加入 1/5体积的
7.5mol/LNH4Ac,冰浴 30 min。 4 ℃、10 000 r/min
离心 10 min,取上清液 。加入等体积的 Tris酚 ∶氯
仿 ∶异戊醇(体积比 25 ∶24 ∶1)轻轻混合 。 4 ℃、
13 000 r/min离心 15 min,取上清液 。加等体积氯
仿 ∶异戊醇(体积比 24 ∶1)轻轻混合。 4℃、13 000
r/min离心 15 min, 取上清液 。加等体积预冷异丙
醇 ,轻轻混匀后于 -20℃放置 1h。 13 000r/min离
心 15min,去上清液 ,沉淀用无水乙醇洗 2次 ,去乙
醇后自然干燥 。加入 1 mlTE溶解 , 加 20 μl
RNaseA37 ℃水浴 30 min。加入 2 ×预冷乙醇于
-20 ℃放置 30 min, 4 ℃、 13 000 r/min离心 15
min,去上清液 ,将沉淀自然干燥后加入 500 μlTE, 4
℃保存备用 。
1.5.1.3　CTAB法　由 Muray等 [ 4]的方法修改而
来 。取 2 g新鲜样品 ,加入液氮研磨成粉末 ,加入 3
mlCTAB法提取缓冲液 , 65 ℃水浴 1 h。 4 ℃、
10 000 r/min离心 10 min,取上清液 。加入等体积
的 Tris酚 ∶氯仿 ∶异戊醇(体积比 25∶24∶1)轻轻
混合 。 4 ℃、13 000 r/min离心 15 min,取上清液。
加入等体积氯仿 ∶异戊醇 (体积比 24 ∶1)轻轻混
合。 4℃、13 000 r/min离心 15 min,取上清液。加
入等体积预冷异丙醇 ,轻轻混合后于 -20 ℃放置 1
h。挑出 DNA后用无水乙醇洗 2次 ,去乙醇后自然
干燥 。加入 1mlTE溶解 ,加 20μlRNaseA37 ℃水
浴 30 min。加入 2 ×预冷乙醇 ,于 -20 ℃放置 30
min。去乙醇 ,将 DNA自然干燥后加入 500 μlTE, 4
℃保存备用。
1.5.1.4　SDS法　参照傅荣昭等[ 5]的方法稍加改
动。取 2 g新鲜样品 ,加入液氮研磨成粉末 ,加入 3
mlSDS法提取缓冲液和 1/5体积 10%SDS, 65 ℃水
浴 1 h。加入 1/10体积的 5 mol/LKAc, 冰浴 30
min。 4℃、10 000r/min离心 10 min,取上清液。加
入等体积的 Tris酚 ∶氯仿 ∶异戊醇(体积比 25 ∶24
∶1)轻轻混合 。 4 ℃、13 000 r/min离心 15 min,取
上清液。加入等体积氯仿 ∶异戊醇(体积比 24 ∶1)
轻轻混合 。 4 ℃、13 000 r/min离心 15 min,取上清
液。加入等体积预冷异丙醇 ,轻轻混合后于 -20 ℃
放置 1 h。 13 000 r/min离心 15 min,去上清液 ,沉
淀用 70%乙醇洗 2次 ,去乙醇后自然干燥。加入 1
mlTE溶解 ,加 20 μlRNaseA37 ℃水浴 30 min。加
入 2×预冷乙醇于 -20 ℃放置 30 min, 4 ℃、13 000
r/min离心 15min,去上清液 ,将沉淀自然干燥后加
入 500 μlTE, 4℃保存备用 。
1.5.1.5　PVP法　参照杜道林等 [ 6]的方法稍加改
动。取 2 g新鲜样品 ,加入液氮研磨成粉末 ,加入 3
mlPVP法提取缓冲液 ,混匀后置室温 1 h。加 PVP
至终浓度为 6%,混匀后加入 1 /2体积的 7.5 mol/L
NH4Ac,冰浴 30 min。 4 ℃、10 000 r/min离心 10
min,取上清液 。加入等体积的 Tris酚 ∶氯仿 ∶异戊
醇(体积比 25 ∶24 ∶1)轻轻混合。 4 ℃、 13 000
r/min离心 15 min,取上清液。加入等体积氯仿 ∶异
戊醇(体积比 24 ∶1)轻轻混合。 4 ℃、13 000 r/min
离心 15 min,取上清液。加入等体积预冷异丙醇 ,轻
轻混合后于 -20℃放置 30 min。 13 000r/min离心
15 min,去上清液 ,沉淀用 70%乙醇洗 2次 ,去乙醇
后自然干燥。加入 1 mlTE溶解 ,加 20 μlRNaseA
37 ℃水浴 30 min。加入 2×预冷乙醇于 -20 ℃放
置 30 min, 4 ℃、13 000 r/min离心 15 min,去上清
液 ,将沉淀自然干燥后加入 500 μlTE, 4 ℃保存
备用 。
—77—李海渤:辣木总 DNA最佳提取方法的建立
1.5.1.6　CTAB-SDS结合法　参照孙鑫等 [ 7]的方
法加以改动 。取 2 g新鲜样品 ,加入液氮研磨成粉
末 ,加入 3mlPVP-SDS结合法提取缓冲液 , 65 ℃
水浴 1 h。加入 1/3体积的 2.5mol/LKAc,冰浴 30
min。 4℃、10 000r/min离心 10min,取上清液 。加
入 1 /5体积的 2×CTAB提取液 ,充分混匀 , 65 ℃水
浴 20min。加入等体积的 Tris酚 ∶氯仿 ∶异戊醇
(体积比 25∶24∶1)轻轻混合 。 4 ℃、13 000 r/min
离心 15 min,取上清液 。加入等体积氯仿 ∶异戊醇
(体积比 24∶1)轻轻混合 。 4 ℃、13 000r/min离心
15 min,取上清液。加入 1ml预冷异丙醇 ,轻轻混合
后于 -20℃放置 1 h。 13 000 r/min离心 15 min,去
上清液 ,沉淀用 70%乙醇洗 2次 ,去乙醇后自然干
燥 。加入 1mlTE溶解 ,加 20μlRNaseA37 ℃水浴
30 min。加入 2×预冷乙醇于 -20 ℃放置 30 min, 4
℃、13 000 r/min离心 15 min,去上清 ,将沉淀自然
干燥后加入 500μlTE, 4 ℃保存备用。
1.5.2　DNA样品的紫外消光值检测　取上述方法
提取的各 DNA样品 60μl,用 TE稀释 50倍至 3ml,
分别测定其 230、260、280 nm下的光吸收值 ,根据
DNA浓度(μg/ml)=50×OD260 ×稀释倍数 ,确定所
测得的 DNA浓度 ,进而确定每克鲜样 DNA产率 。
纯 DNA样品 OD260 /OD280紫外消光值应为 1.8,
如果 OD260 /OD280值大于 1.9,表明有 RNA污染;小
于 1.6 , 表明 样 品中 存在 蛋 白质 或 酚污 染 。
OD260 /OD230值应大于 2.0 ,如果 OD260 /OD230值小于
2.0,表明溶液中有残存盐和小分子杂质 ,如核苷酸 、
氨基酸 、酚等。
1.5.3　琼脂糖凝胶电泳检测　分别取 20 μlDNA
样品 ,在 1%琼脂糖(含 0.5 μg/ml溴化乙锭)凝胶
中 ,以 1×TAE[由 50×TAE(242 gTris;57.1 ml冰
醋酸;100 ml0.5 mol/LEDTA, pH值 8.0;加双蒸水
至 1 L)稀释而成 ]为缓冲液 , 3 ～ 4 V/cm电压下电
泳 ,比较各种方法提取的 DNA质量。在 Tan-non-
UV-2000紫外分析仪上观察并拍照 。
2　结果与分析
2.1　紫外消光值检测
从各种方法提取的 DNA样品紫外消光值(表
1)可知 , 高盐低 pH法提取的 DNA产率最低 , 为
14.375μg/g;尿素法 、PVP法 DNA产率相当 ,分别
为 43.750、25.625 μg/g;CTBA-SDS结合法 DNA
产率为 171.875 μg/g;CTAB法 DNA产率为
248.125μg/g;最高的是 SDS提取法 , DNA产率为
359.375μg/g。从所得 DNA纯度来看 ,各种方法提
取的 DNAOD260 /OD280均接近 1.8,说明 RNA去除
比较彻底 。高盐低 pH法 、尿素法 、CTAB法 、PVP法
OD260 /OD230低于 2.0, 说明 DNA中含有小分子杂
质;而 SDS法和 CTBA-SDS结合法 OD260 /OD230均
大于 2.0,说明 DNA中小分子杂质很少 。
表 1　紫外分光光度法检测各方法提取的辣木总 DNA纯度结果
提取方法 OD230 OD260 OD280 OD260 /OD230 OD260 /OD280 DNA产率(μg/g)片段长度(bp)
高盐低 pH法 0.015 0.023 0.013 1.533 1.769 14.375 无
尿素法 0.036 0.070 0.040 1.944 1.750 43.750 19 227
CTAB法 0.224 0.397 0.232 1.772 1.711 248.125 19 227
SDS法 0.271 0.575 0.321 2.122 1.791 359.375 21 227
PVP法 0.023 0.041 0.022 1.783 1.864 25.625 17 227
　CTBA-SDS结合法 0.102 0.275 0.153 2.696 1.797 171.875 16 227
2.2　琼脂糖凝胶电泳检测
从 6种方法提取的 DNA琼脂糖电泳凝胶成像
照片(图 1)可见 ,高盐低 pH法提取的 DNA产量很
低 ,无明显特征带 ,符合紫外消光检测结果;尿素法 、
PVP法及 CTBA-SDS结合法有弥散 DNA,说明在
提取过程中发生了降解;CTAB法和 SDS法均有特
征带 ,但 CTAB法提取的 DNA片段小于 SDS法提取
的 DNA片段 ,且 SDS法所得 DNA片段比较均一 。
3　结论
获得高质量的 DNA样品是分子生物学研究的
关键性步骤 ,探索适合某种特定研究材料的 DNA提
取途径具有重要意义 。综合上述试验结果 ,高盐低
(下转第 79页)
—78— 江苏农业科学　2008年第 2期
兔抗灭多威多克隆抗体的制备
王玉坤 1 , 李锦程1, 2 , 曹远银 1
(1.沈阳农业大学植物免疫研究所 ,辽宁沈阳 110161;2.辽宁省质量技术监督局 ,辽宁沈阳 110161)
　　摘要:根据灭多威结构特征将其改造成的新半抗原 , 分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联
作为免疫原和包被原进行抗体制备及 ELISA试验 , 抗血清效价达 2.56×105。建立了间接竞争 ELISA方法并优化
了工作条件 ,方阵测定确定了包被抗原最佳浓度为 10μg/ml,抗血清最佳稀释度为 1 ∶51 200, 建立了 ELISA标准工
作曲线 , 表明在 50 ～ 5 000ng/ml浓度范围内抑制率与灭多威浓度的对数值呈线性关系 ,检测限为 100ng/ml。
　　关键词:灭多威;半抗原;ELISA;多克隆抗体
　　中图分类号:S859.84　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2008)02-0079-03
(上接第 78页)
pH法的 DNA得率很低 ,琼脂糖凝胶电泳检测也得
到同样结果;尿素法 、PVP法及 CTAB-SDS结合法
DNA得率较高 ,但电泳检测结果表明 3种方法均发
生了降解;CTAB法及 SDS法 DNA得率高 ,且质量
均好 ,但 CTAB法有些小分子物质没有去除干净 ,故
SDS法为辣木总 DNA提取的最佳途径 。
参考文献:
[ 1]张　宁 ,王凤山.DNA提取方法进展 [ J] .中国海洋药物 , 2004
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[ 2]邹喻苹 , 汪小全 , 雷一丁 , 等.几种濒危植物及其近缘类群总
DNA的提取与鉴定 [ J] .植物学报 , 1994, 36(7):528-533.
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国科学技术出版社 , 1994.
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[ 7]孙　鑫, 崔洪志 , 胡宝忠 , 等.SDS-CTAB结合法提取棉花总
DNA[ J].生物技术通报 , 2004(5):45-47.
　　灭多威为氨基甲酸酯类内吸性广谱杀虫剂 ,具
有强烈的触杀和胃毒作用 ,属高毒性 N一甲基氨基
甲酸酯类杀虫剂 [ 1] 。我国只允许灭多威在特定作
物上使用 ,国家标准规定甘蓝和柑橘中灭多威的最
高残留限量分别为 2mg/kg和 5mg/kg[ 2] 。
灭多威的检测方法有液相色谱 、气相色谱等 。
这些方法前处理过程复杂 ,检测时间长 ,费用高 ,操
作人员易接触有毒有机溶剂和化学试剂 。近年来 ,
具有简便 、快速 、灵敏等优点的酶免疫测定法(EIA)
受到广泛重视 ,更多更好的半抗原改造方法及抗体
特异性的提高使得利用免疫方法检测农药残留量成
收稿日期:2007-09-06
基金项目:“十一五 ”国家科技支撑计划(编号:2006BAK02A09)。
作者简介:王玉坤(1983—), 男 ,硕士 ,主要从事有害生物与环境安
全研究。 E-mail:wangyk291983@163.com。
通讯作者:曹远银(1955—),博士 ,研究员 ,主要从事植物免疫 、生物
安全和小麦病害研究。
为一种安全 、高效 、可靠的方法 ,国内外已成功应用
于多种农药及其代谢物的残留分析[ 3-4] 。本试验制
备了针对灭多威的多克隆抗体 ,建立了标准抑制曲
线 ,完成了实际应用的初步研究。
1　材料与方法
1.1　材料和仪器
1.1.1　供试药品和试验动物　灭多威原药(纯度
>98%,山东华阳公司),牛血清白蛋白(BSA)、卵清
蛋白(OVA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、水溶性碳
化二亚胺(EDC)、弗氏完全佐剂 、弗氏不完全佐剂 、
酶标二抗等(Sigma公司),酶联免疫吸附测定中所
用的试剂均为国产分析纯试剂 ,按照文献 [ 4]自配。
实验动物为健康雄性新西兰大白兔(中国医科大学
动物实验中心)。
1.1.2　试验仪器　台式高速冷冻离心机(日立)、
酶标仪 、紫外可见分光光度计(岛津)、二氧化碳培
—79—江苏农业科学　2008年第 2期