全 文 ：·专题报道·
【文章编号】　 0258-879X ( 2000) 03-0201-03
四倍体菘蓝毛状根的抗内毒素作用
李博华 ,　张汉明 ,　王　寅 ,　丁如贤 ,　许铁峰
【摘要】　目的:从菘蓝的同源四倍体植物诱导出毛状根 ,并探讨用毛状根代替自然根作为药用的可能性。方法: 利用发根农
杆菌 A4菌株感染四倍体菘蓝 ,采用细菌内毒素检查法考察诱导所得毛状根的抗内毒素作用。结果: A4菌株能诱导四倍体菘
蓝产生毛状根 ,毛状根具有较强的抗内毒素作用。结论:发根农杆菌诱导四倍体植物产生的毛状根有可能成为传统中药材的
一种代用品。
【关键词】　菘蓝 ,四倍体 ; 毛状根 ; 抗内毒素作用
【中图分类号】　 R 282. 710. 5　　　　【文献标识码】　 A
Antiendotoxic action of hairy roots of autotetraploid Isatis indigotica Fort.
LI Bo-Hua, ZHANG Han-M ing , W ANG Yin, D ING Ru-Xian, XU Tie-Feng ( Depar tment of Pha rmacognosy , Co lleg e of
Pha rmacy , Second M ilitar y Medical Univ ersity , Shanghai 200433, China)
【ABSTRACT】　 Objective: T o induce hairy r oo ts f rom auto tetr aploid Isatis indigotica Fo r t. and assess the probability of using
hair y ro ots as medicine instead o f no rma l r oo ts. Methods: Coty ledon lea f explants of auto tetraploid Isatis indigotica Fo rt. w ere
infected by Agrobacterium rhizogenes str ain A4. Antiendo tox ic action of hairy ro o ts and Banlangen ( Radix Isatidis ) was
investiga ted th rough pha rmaco lo gical experiment.Results: Hairy r oo ts o f auto tetr aploid Isatis indigotica For t. could be induced
by A grobacterium rhizogenes strain A4 and hairy ro o ts had significant antiendoto xic action. Conclusion: Agrobacterium
rhizogenes could induce hair y r oo ts f rom polyploid plants and hairy roots might be a su bst itute for Chines e tr anditional medicine.
【KEY WORDS】　 I satis indigotica Fo rt. , tetraploidy; hair y roo ts; antiendo toxic action
[ Acad J Sec M il M ed Univ , 2000, 21( 3): 201-203 ]
⒇
　 板蓝根是十字花科植物菘蓝 ( Isatis indigotica
For t. )的干燥根 ,它具有清热解毒、凉血利咽的功
效。现代医学对清热解毒作用的解释集中在以下两
点:一是抗内毒素作用 ,二是抗病原微生物作用。有
关板蓝根上述两个方面的研究都有报道。 用秋水仙
碱处理萌发的菘蓝种子或幼苗生长点 ,获得菘蓝四
倍体植物 ,经过数代选育 ,获得了性状稳定、繁殖力
正常、根与叶中活性均较大幅度提高的、生产性能良
好的品系 [1 ]。经国家科委批准 ,已列为国家科技成果
重点推广项目。毛状根由于其生长迅速 ,生理、生化
性状和遗传性状稳定 ,以及易于进行遗传操作等特
点 ,近年来已发展成为继细胞培养后的又一实用培
养系统 [2～ 6 ]。 我们在建立四倍体菘蓝毛状根培养系
统的基础上 ,对四倍体菘蓝毛状根与二倍体菘蓝和
四倍体菘蓝自然根的抗内毒素作用进行比较 ,以探
讨用毛状根作为板蓝根代用品的可能性。
1　材料和方法
1. 1　细菌菌株　发根农杆菌 A4菌株 ,感染前置于
Y EB固体培养基于 27℃活化 3次 ,然后转至 YEB
液体培养液中。于黑暗、 25℃ , 100 r /min振荡培养。
使用处于对数生长期的菌液转化植物。
1. 2　植物材料　四倍体菘蓝种子由本室乔传卓教
授提供。先将种子用清水冲洗干净后在 75%乙醇中
浸泡 3 min,再用 0. 1%升汞消毒 30 min,无菌水冲
洗 4次 ,置于 M S固体培养基于培养室萌发。
1. 3　主要试剂　鲎试剂 (福州东方鲎试剂厂 ,批号
971208) 0. 1 ml /支 ,活性 0. 5 EU /ml;细菌内毒素
工作标准品 (福州东方鲎试剂厂 ,批号 980105) 10
EU /支 ,以 0. 9%生理盐水溶解备用 ; 0. 9% 生理盐
水 (上海市长海医院 ,批号 980407)。
1. 4　药材　板蓝根 ( 2n): 产于河北安国 ,经本室乔
传卓教授鉴定为菘蓝的干燥根 ;板蓝根 ( 4n): 经数
·201·第 二 军 医 大 学 学 报Acad J Sec Mil Med Univ　 2000 Mar; 21( 3)
⒇ 【基金项目】　国家自然科学基金资助项目 ( 39870919)
【作者单位】　第二军医大学药学院生药学教研室 ,上海 200433
【作者简介】　李博华 ( 1973～ ) ,男 (汉族 ) ,博士生 ,现在第二军
医大学国际合作肿瘤研究所
代选育获得的菘蓝四倍体植物的干燥根。
1. 5　实验方法
1. 5. 1　毛状根的诱导与培养方法　将四倍体菘蓝
的子叶切成 0. 5 cm× 0. 5 cm的小块 ,浸入已达对数
生长期的发根农杆菌 A4菌液进行共培养。 10 min
后取出共培养的叶片用无菌滤纸吸干菌液 ,置于
MS固体培养基上培养 2 d,然后取出 ,用无菌水冲
洗 4次 ,置于含头孢噻肟钠 500 mg /L的 MS固体
培养基上 , 25℃、光照 12 h /d下培养 ,每隔 5 d转接
1次。 待毛状根长出后 ,分离毛状根 ,转移至含 500
mg /L头孢噻肟钠的 MS固体上除菌 ,转移 4～ 5次
直至无菌为止。然后将毛状根移至无激素的 M S固
体或液体培养基进行大量培养。
1. 5. 2　甘露碱检测方法　取毛状根 100 mg置于
1 m l Eppendorf管 ,加入 0. 1 mol /L HCl 100μl,捣
成匀浆 ,低温浸提 2 h, 1. 5× 104 r /min离心 5 min,
取上清液 10μl及甘露碱标准品分别点样于
Whatman 3 mm滤纸上进行高压纸电泳。电泳条件
和染色参照 Morgan等 [ 7]的方法进行。
1. 5. 3　药材提取液制备　将烘干后的毛状根或板
蓝根粉碎 ,过 60目筛。 各称取 10 g ,加 500 m l水煎
煮 30 min,过滤 ,重复 3次 ,合并滤液 ,水浴浓缩至
约 100 ml ,加乙醇至醇浓度为 80% ,冷藏 24 h后过
滤 ,回收乙醇至无醇味 ,以蒸馏水定容至 10 m l,调
节 pH为 7. 0～ 7. 5,压滤除菌及其他杂质颗粒 ,用安
瓿分装 ,封口 ,煮沸消毒 ,备用。
1. 5. 4　抗内毒素实验 [8 ]　分别取 0. 5 ml上述药材
提取液于 1, 2号试管内 ,在 2号试管加入 0. 5 ml生
理盐水 ,混匀 ,吸取 0. 5 ml于已加有 0. 5 m l生理盐
水的 3号管中 ,依次按同法稀释 ,得到稀释倍数分别
为 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64和 128的系列溶液 ,并使各管
的药液容量都为 0. 5 m l。分别加入预先配制的内毒
素液 0. 5 ml( 10 EU /ml) ,摇匀 , ( 55± 2)℃水浴保温
30 min。 分别取 0. 2 ml加于 0. 1 ml鲎试剂中 ,溶
解 ,封口 , ( 37± 1)℃水浴中温育 60 min。
加 0. 2 ml细菌内毒素检查用水于 0. 1 ml鲎试
剂中 ,作阴性对照 ;加 0. 1 m l细菌内毒素检查用水
和 0. 1 ml 10 EU /ml内毒素液到 0. 1 ml鲎试剂中 ,
作阳性对照。 其余同药材组处理。
2　结　果
2. 1　毛状根的诱导与培养　发根农杆菌 A4感染
四倍体菘蓝子叶 10 d后在叶片切口处出根。多数根
具典型毛状根特征 ,有许多白色根毛 ,分枝多且根尖
向上生长。毛状根在无激素的 M S固体或液体培养
基中快速生长并不断分枝。
2. 2　甘露碱检测　通过高压纸电泳 ,从菘蓝同源四
倍体的毛状根中检测到了原植物中没有的甘露碱 ,
表明发根农杆菌的 Ri T-DNA部分已在植物毛状根
中整合和表达。
2. 3　抗内毒素作用比较　从表 1可以看出 ,四倍体
菘蓝的毛状根具有明显的抗内毒素作用 ,其作用虽
比四倍体板蓝根稍弱 ,但与二倍体板蓝根相似。
表 1　四倍体菘蓝毛状根的抗内毒素作用
Tab 1　 Ant iendotoxic action of hairy roots of
autotetraploid Isatis indigotica Fort.
(n= 3)
Sample
Dilution mult iple
1 2 4 8 16 32 64 128
Negative cont rol - - - - - - - -
Posi tive cont rol + + + + + + + +
Diploid ( 2n) - - - - ± + + +
Tetraploid ( 4n) - - - - - ± + +
Hai ry roo ts - - - - ± + + +
　　 - : No gel formed; + : Gel formed; ± : Gel formed,　
bu t deformed or f low ed af ter overturn
3　讨　论
关于四倍体植物和菘蓝的农杆菌转化国内外均
未见报道。本研究证明了发根农杆菌同样能诱导四
倍体植物产生发状根。经诱导出的四倍体菘蓝毛状
根具有典型二倍体毛状根的特征 ,根毛多、无向地
性 ,且生长快速。
由于整合进植物核基因组中的 Ri T-DNA片段
上有甘露碱合成的酶基因 [9 ] ,因此 ,发状根能合成原
植物中所没有的甘露碱。 我们从菘蓝同源四倍体的
毛状根中检测到甘露碱 ,进一步证明 Ri T-DNA已
在毛状根中整合和表达。
植物根部合成的次生代谢物 (药物、色素、香料
等 )都可通过发状根培养的方法得到 ,如人参的发状
根在无外源激素的条件下 ,人参皂甙 ( Rb和 Rg )含
量可达干质量的 0. 95% ,远高于天然栽培根
( 0. 4% )
[ 10]
,完全有代替人参作为药用的可能性。因
为有近 1 /3的传统药材以根入药 ,该培养系统有可
能为中药材的工业化生产提供一条新的途径。
鲎试剂与内毒素之间的凝集反应具有高度的特
异性和灵敏性 ,通常 ,试样中微量内毒素 ( < 1
EU /ml)的存在就可激活鲎试剂中凝固酶 ,使凝固
·202· 第二军医大学学报　 2000年 3月 ,第 21卷
蛋白原转变为凝固蛋白产生凝集反应 [11 ]。板蓝根具
有明显的抗内毒素作用 ,在加入其水溶液后鲎试剂
与内毒素之间的凝集反应被抑制 [12 ]。从本研究结果
可看出 ,四倍体菘蓝的毛状根具有与正常根相类似
的抗内毒素作用。 为了进一步探讨毛状根作为根类
药材代用品的可能性 ,我们将对四倍体菘蓝毛状根
的抗病毒和抗菌等药理作用作深入研究。
【参 考 文 献】
[1 ]　乔传卓 ,吴美枢 ,戴富宝 ,等 . 菘蓝多倍体育种的研究 [ J] . 植物
学报 , 1989, 31( 9): 678-683.
[2 ]　 Parr AJ, Peerles s ACJ, Hamill JD, et al . Alkaloid production
by t ransform ed root cul tures of Li thospermum roseus [ J ]. Plan t
Cel l Rep, 1988, 7( 5): 309-312.
[3 ]　胡之璧 ,郑志仁 ,李幸平 ,等 . 膜夹黄芪毛状根培养系统的建立
和外界因子对其生长的影响 [ J] . 植物学报 , 1998, 40( 5): 448-
452.
[4 ]　 Toivonen L. Utili zation of h ai ry root cul tu res fo r production
of secondary metaboli t es [ J ]. Biotech nol Prog, 1993, 9( 1): 12-
20.
[5 ]　 Zhou Y, Hirotani M , Yosh ikaw a T, et al . Flavonoids and
ph enylethanoids f rom h ai ry root cul tu res of Scutella ria
baicalensis [ J ]. Phy toch emis t ry, 1997, 44( 1): 83-87.
[6 ]　常振战 , 果德安 ,沈　昕 ,等 . 掌叶大黄毛状根培养及培养物
中蒽醌类成分分析 [ J] . 药学学报 , 1998, 33(11): 869-872.
[7 ]　 Mo rgan AJ, Cox PN, Tu rner DA, et al . Transformation of
tomato using an Ri plasmid vector [ J] . Plant Sci, 1987, 49( 1):
37-49.
[8 ]　乔传卓 ,张汉明 ,陈万生 ,等 . 抗内毒素实验评价四倍体板蓝根
[ J ]. 第二军医大学学报 , 1995, 16( 4): 395-396.
[9 ]　 Peti t A, David C, Dahl GA, et al . Further ex tension of the
opine concept: plasmid in Ag robacrer ium tumefaciens
cooperate for opine deg radation [ J] . Mol Gen Genet , 1983, 190
( 2 ): 204-214.
[10 ] Yoshikaw a T, Fu ru ya T. Saponia prod uction by cul tu res of
Panax gins eng t rans form ed w ith A grobacterium rhizogenes [ J].
Plant Cell Rep, 1987, 6( 6): 449-453.
[11 ]刘云海 . 板蓝根注射液抗内毒素作用的实验研究 [ J] . 中草药 ,
1993, 24( 8): 413-414.
[12 ]刘云海 . 板蓝根抗内毒素作用研究 [ J ]. 中国药科大学学报 ,
1995, 26( 5): 297-299.
【收稿日期】　 1999-10-05　　 【修回日期】　 2000-01-08
【本文编辑】　姚春芳
·短篇报道·
【文章编号】　 0258-879X ( 2000) 03-0203-02
人脑星形细胞瘤 P53蛋白积聚及 bcl-2基因表达的研究
赵文元 1 ,　周晓平1 ,　许　涛 2 ,　刘建民 1 ,　王文仲 1
⒇
　 凋亡 ( a poptosis)是活组织中单个细胞的主动 “自杀”过
程 ,受多基因调节 ,其中 ,野生型 p53基因是重要的凋亡促进
基因 ,而突变型 p53基因和 bcl-2基因是重要的凋亡抑制基
因。 我们检测了 34例人脑星形细胞瘤组织中 P53蛋白积聚
和 bcl-2 m RNA表达情况 ,以探讨凋亡抑制对人脑星形细胞
瘤的意义。
1　材料和方法
1. 1　标本来源与分级　 34例标本均于我科星形细胞瘤患
者第一次手术时获得 ,液氮保存 ,病理学诊断依据 Kernohan
标准 ,其中星形细胞瘤Ⅰ 级 8例、Ⅱ级 12例、Ⅲ ～ Ⅳ级 14
例 ,另外 3例正常脑组织标本于急性颅脑外伤内减压时获
得。
1. 2　材料与试剂　 pbluebcl-2质粒由 bluescriptsk ( M13-)
改建 ,美国斯坦福大学 Klaus Bensch博士馈赠。限制性内切
酶 HindⅢ , T3 RNA聚合酶为 Promega公司产品。 地高辛
RN A合成 N TP, AKP-Anti-D IG-Ab Fab为 Boeh ringer公司
产品。抗 P53多克隆抗体 CM-1为 Dako公司提供。 PAG由
第二军医大学病理学教研室制备。
1. 3　免疫组化染色　冷冻标本自液氮取出 , 4%多聚甲醛固
定于恒冷箱冷冻切片 ,层厚 4μm, 20%蔗糖 PBS浸泡过夜。
染色步骤依石蜡切片 IGSS进行 , CM-1以 1∶ 1 000稀释。
1. 4　原位分子杂交　 ( 1)探针制备: 以限制性内切酶 Hind
Ⅲ切开质粒后 ,取线性质粒 DN A 50 ng /μl, T3 RNA聚合酶
2 U /μl, 1 mmo l /L NTP合成 cRNA ,加入 DNA酶去除模板
DNA后备用。 ( 2)标本预处理: 肿瘤标本自液氮取出 ,经 4%
多聚甲醛固定和 20%蔗糖 PBS浸泡后作冷冻切片 ,层厚 10
μm,切片以 0. 4% Triton X-100和蛋白酶 K处理。 ( 3)杂交
及显色 : 切片加探针含量 0. 5μg /ml杂交液 43℃杂交 16 h,
RNA酶去除多余探针后 ,加 AKP-Anti-D IG-Ab Fab室温 4
h , NBT和 BCIP室温显色 3 h,封片。
1. 5　结果判定　阳性染色细胞数小于 10%为阴性 ,大于
10%为阳性。
(下转第 206页 )
·203·第 3期 . 李博华 ,等 . 四倍体菘蓝毛状根的抗内毒素作用
⒇ 【作者单位】　 1. 第二军医大学长海医院神经外科 ,上海
200433; 2. 长海医院麻醉科
【作者简介】　赵文元 ( 1969～ ) ,男 (汉族 ) ,博士生 ,主治医师