全 文 ：收稿日期:2006-07-25
克服菘蓝自交不亲和性的化学试剂筛选研究
高延辉1 ,高　博2 ,王云贺3 ,孙红梅3 ,任跃英3＊
(1.吉林农业大学研究生部 , 长春 130118;2.吉林省植物检疫站;3.吉林农业大学中药材学院)
摘　要:菘蓝具有较强的自交不亲和性 ,为了探索不亲和性的克服方法 ,用多种药剂进行花期处理后人
工授粉观察结实情况。结果表明 3%NaCl+0.2%硼砂混合溶液 , 3%、5%、7%丙酮和 5%KH2PO4 溶液
对克服菘蓝自交不亲和性的都有明显效果。而用其它一些药剂如 1%的硫酸铵溶液 、0.1%的 6-BA 溶
液和不同浓度 GA3 处理虽然也有一定效果 ,但效果不明显而且对植株生长发育有一些不利影响。
关键词:菘蓝;自交不亲和;克服方法
Screening of the Chemicals to Resolve the Problem
of Self Pollination Failure of Isatis indigotica
Gao Yan hui1 ,Gao Bo2 ,Wang Yunhe3 ,Sun Hongmei3 ,Ren Yueying3
(1.Department of Postgraduate faculty , JiLin Agricultural University , 130118 , China;2.Plant quarantine
station of JiLin Province;3.Department of Tradditionnal Chinese Medicinal , JiLin Agricultural University)
Abstract:Indigotica of Cruciferae have the nature of self-incompatibility obviously.In order to probed into
the method of conquering self-incompatibility of indigotica , the situations of producing seeds is to ob-
served after dealed with many chemicals in f lowering season.It w as indicated that the compatible index
can be improved when materials are respectively dealed with 3%NaCl liquor mixed with 0.2%borax liq-
uor , 3%, 5%, 7%acet one liquo r and 5%KH2PO4 in flowering season.The compatible index also can be
increased a lit tle af ter using 1%(NH4)2SO4 , 0.1%6-BA and GA3 of dif ferent consis tency , but it s effect
is not obvious , even has an di sadvantageous influence on it s growing development.
Key word:Isatis indigotica ;compatible index;conquering method
　　菘蓝(Isatis indigotica Fort .)是十字花科菘蓝属
植物 ,俗名板蓝根 、大蓝根 、大青根 ,有清热解毒 、凉血
消肿等功效。主治流行性感冒 ,流行性腮腺炎 ,流行性
乙脑炎 ,流行性脑脊髓膜炎 ,急性传染性肝炎 ,咽喉肿
痛等症。其叶供药用 ,中药名大青叶 ,具有根的相同功
效[ 1 , 2] 。菘蓝由于其功效显著 、低毒性 ,已经越来越受
到人们的重视 ,市场需求量也逐年上升。为此 ,除了通
过改进栽培技术提高单位面积产量 ,新品种培育是其
更有效途径。但经过研究发现菘蓝具有较强的自交不
亲和性 ,优良品系内自交繁育面临困境。其花序为复
总状花序 ,单个花序上小花数目多且微小 ,传统的蕾期
授粉方法费时费力。虽然对于克服十字花科植物像甘
蓝 、大白菜的自交不亲和性的报道很多 ,但在菘蓝研究
上至今未见报道。因此 ,进行了不同化学试剂处理克
服菘蓝自交不亲和性的研究 ,以期筛选出克服菘蓝自
交不亲和性较为有效的化学药剂及其施用的最佳浓
度 ,为品种保存及育种工作提供依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　材料来源
所用植物材料为吉林农业大学药用植物园内栽培
的菘蓝。 2006年 4 月中旬播种于吉林农业大学试验
田 ,第二年用于克服自交不亲和性鉴定试验。该区域
日照充足 ,降雨量丰富 ,土壤肥沃 ,空气清新 ,无外来污
染和生物入侵。
1.1.2　试验药品
NaCl和硼砂:3%NaCl+0.2%硼砂 , 5%NaCl +
0.3%硼砂 , 8%NaCl+1%硼砂;
丙酮:3%、5%、7%的丙酮溶液;
植物激素:GA3 属于赤霉素类 , 6-BA 属于细胞分
裂素类分别用 100×10-6 、200×10-6 、400×10-6 、1000
×10-6的 GA 3 和 0.1%的 6-BA 溶液处理;
单盐:1%、3%、5%的硫酸铵和 5%的磷酸二氢钾
溶液处理;
氨基酸:0.1%的丝氨酸和 0.1%的植物凝集素处
理。
12
第1期(总第 92) 中 国 林 副 特 产 N o.1(GSNO.92)
2008年 2月 Fo rest By-Product and Speciali ty in China Feb.2008
DOI :10.13268/j.cnki.fbsic.2008.01.010
1.2　方法
1.2.1　材料的前处理
于开花前一周对待测供试植株顶端若干花序进行
套袋(15cm×20cm 硫酸纸袋),随机选取生长状况基本
一致的健壮植株 100 株 ,挂牌标记。其中每 10个单株
分别编号为 A1 ～ A10 , B1 ～ B10 , C1 ～ C10 , D1 ～ D10 , E1
～ E10 ,F1 ～ F10 ,G1 ～ G10 ,H1 ～ H10 , I1 ～ I10 , J1 ～ J10 。于
开花前一周左右对全体供试植株顶端若干花序套袋 ,
待有半数以上小花开放时摘袋 ,选择 3 ～ 4 个处于同一
生长期的花序 ,每个花序上留 40朵处于同一生长期的
小花 ,其余的人工去除 ,用作母本。剩下的花序用来收
集父本花粉 ,待授粉结束后将父本花序全部摘除 ,并进
行套袋。
1.2.2　试验方法
1.2.2.1　不同化学试剂处理。若发现田间大部分花
进入开花期 ,摘下母本的纸袋 ,于上午 9 ～ 10时或下午
3 ～ 5时用不同药剂分别进行喷施。然后 30min 后立
即用上述套袋备用父本的花粉人工授粉 ,隔 1d 授粉 1
次 ,共授粉 2次 ,授粉后应立即套袋 ,以防止昆虫和风
力传粉。对照组花期不做任何药剂处理 ,而只用同一
株的套袋父本花粉人工授粉。授粉结束后母本继续套
袋 ,将其植株和花序按照处理详细编号挂牌。父本袋
摘除正常发育或为了减少干扰也可不摘除。
1.2.2.2　花粉生活力测定。对上述植株用于授粉的
花粉采用 0.5%的亚甲基蓝 、0.5%的 TTC染色法 、I2-
KI染色法对花粉生活力进行检测[ 3] ,统计生活力。
1.2.2.3　花粉萌发率的检测。用 MS 培养基以及适
量加入硼酸和蔗糖的改良型 MS 培养基 25℃恒温培
养 ,光学显微镜下观察萌发情况并统计萌发率。对比
两种培养基上花粉的萌发情况。
1.2.2.4　柱头可授性测定。参照 Dafni的方法 ,用联
苯胺-过氧化氢法进行测定[ 4] 。于盛花期 ,随机标记发
育阶段基本一致的花 ,在开花后 1.0h 取 30 朵花的柱
头浸入含有联苯胺-过氧化氢的反应液(1%联苯胺 ∶
3%过氧化氢∶水= 4∶11∶22 ,体积比)中 ,随后制片
置 Olympus CX31RBSFA 型光学显微镜下观察其柱头
的可授性。若柱头具可授性则其周围的反应液呈现蓝
色并有大量气泡出现。
1.2.2.5 　药剂处理后柱头观测。柱头喷施药液
15min后 ,对其进行自花授粉套袋 , 1h 后光学显微镜观
察柱头变化 ,以蕾期人工去雄套袋并且现已开花的柱
头上喷施蒸馏水为对照。
1.2.3　结果统计
果实成熟后 ,采收成熟的果实 ,室内考种并单株留
种 ,精确统计各种处理的结籽数 ,果实膨大并含有种子
的果实为结籽指标 ,并计算不同药剂不同浓度处理花
期授粉的亲和指数 ,结果进行分析讨论。(亲和指数 =
结籽数/自交花数)
2　结果分析
2.1　不同药剂处理对自交亲和指数的影响
表 1　不同药剂处理对自交亲和指数的影响
药剂种类 药剂浓度 授粉花数 结籽数 亲和指数
NaCl+硼砂 3%+0.2% 100 91 0.91
5%+0.3% 100 0 0
8%+1% 100 0 0
丙酮溶液 3% 100 73 0.73
5% 100 82 0.82
7% 100 92 0.92
GA 3 100×10-6 100 6 0.06
200×10-6 100 8 0.08
400×10-6 100 26 0.26
1000×10-6 100 34 0.34
硫酸铵 1% 100 39 0.39
3% 100 7 0.07
5% 100 0 0
丝氨酸 0.1% 100 15 0.15
植物凝集素 0.1% 100 3 0.03
6-BA 0.1% 100 46 0.46
蜂蜜水 5% 100 6 0.06
K H2 PO 4 5% 100 69 0.69
CK 花期人工自交授粉 100 12 0.12
　　从表 1 可见 ,从对照组看菘蓝花期人工自交授粉
亲和指数只有 0.12 ,同时我们用亲和指数法测定菘蓝
自交不亲和特性研究显示 ,菘蓝花期人工授粉自交亲
和指数为 0.11 ,充分证明菘蓝为强的自交不亲和植
物。
用低浓度 NaCl+硼砂溶液处理 ,其亲和指数达到
0.91 ,效果十分显著 ,但高浓度的 NaCl+硼砂溶液处
理后整个花序脱水死亡。
丙酮处理的效果也十分理想 ,随着溶液浓度的增
高效果也变得更好 , 3%丙酮处理后亲和指数达 0.73;
5%达 0.82;7%的高达 0.92 ,并且处理后得到的种子
和种荚及生理状况都正常。
不同种激素对亲和性的影响是有很大差异的 ,
0.1%的 6-BA 溶液处理效果明显好于不同浓度的赤霉
素。用这两种激素处理后 ,菘蓝的生长发生了一定变
化 ,种荚的生长速度明显快于种子的生长速度 ,而且种
荚明显大于正常种荚。虽然导致这种现象的原因尚不
清楚 ,但有报道说 ,施用较高浓度的激素于不同植物均
可增加其 IAA 含量 ,而 IAA 含量的含量剧增能够促进
子房的快速发育 ,还能促进一些植物单性结实[ 5] 。使
用 GA 3 处理很多植物 ,也能增加其 IAA 含量 ,原因是
GA3 促进了 IAA 的合成并抑制了结合态 IAA 的形
成[ 5] 。
低浓度硫酸铵溶液对克服菘蓝自交不亲和性有一
13
2008年 高延辉等:克服菘蓝自交不亲和性的化学试剂筛选研究 第 1期
定促进作用 ,但对花粉 、柱头和植株的伤害是不容忽视
的 ,稍稍提高溶液浓度就会使花序枯萎死亡 , 3%的浓
度就足以杀死 90%以上的小花 ,即便有些植株能够结
实 ,其种荚也呈黄绿色 ,种子生活力也大大降低。
0.1%植物凝集素和 0.1%丝氨酸溶液几乎没有
任何作用 ,处理后结的果实比自交不亲和果实还要小
五分之一 ,况且药品价格昂贵 ,对实际生产没有任何意
义。
蜂蜜水处理的试材亲和指数要比花期人工自交授
粉还低 ,原因可能是蜂蜜在柱头上干化后进一步阻碍
了花粉的萌发合花粉管的生长。
5%KH2PO4 溶液效果也相当不错 ,达到了 0.69 ,
而且处理后的果实个体还略大于正常果实 ,种子大小
与正常杂交种子无异 ,因此可操作性很强。
2.2　花粉生活力测定
结果表明 ,使用亚甲基蓝测定的生活力为 99%,
TTC染色法测定的生活力为 97%, I2-KI染色法生活
力为 99%。亚甲基蓝是根据花粉粒的胞质存在与否
判断其生活力 ,此法迅速简便 ,与离体萌发测定和种子
形成测定有相关性 ,也能使衰老和死亡的花粉着色 ,花
粉的生活力估计偏高 ,有胞质的花粉粒并不一定具有
受精能力 ,未成熟和败育花粉也可正常着色。 TTC 即
2 ,3 , 5 氯代三苯基四氮唑 ,是一种氧化还原染料 ,其基
本原理是:花粉中呼吸酶的活跃情况能较正确地反映
其生活力的强弱 ,同时氧化还原染料能在呼吸酶的作
用下着色 ,因此可根据着色情况来判断花粉的生活力。
而 I2-KI染色法是根据大部分正常花粉呈圆球形且积
累淀粉较多 ,通常 I2-KI可以将其染成蓝色 ,发育不良
的花粉常呈畸形 ,往往不含淀粉或积累淀粉较少 ,用
I2-KI染色 ,不呈蓝色 ,而呈黄褐色。应用 I2-K 法对菘
蓝花粉进行染色 ,效果并不明显 ,有活力的花粉外壁呈
蓝色 ,没有活力的呈黄褐色 ,显微镜下不易分辨。但
是 ,应用这三种方法同时测定花粉的生活力 ,结果更加
可靠 。
2.3　花粉萌发率测定
2.0h后 MS 培养基以及添加硼酸和蔗糖的改良
MS 培养基中都有个别花粉萌发 , 几乎没有差异。
6.0h后发现 ,改良的MS 培养基萌发率达到 88%,而对
照组只有 73%,并且改良 MS 培养基中花粉生长状况
要好于对照组 ,花粉管长度比对照组的花粉管稍长。
普通光学显微镜下 ,花粉管比较模糊 ,可以加一滴棉蓝
-乳酸-酚染色液 ,静置 5 ～ 10min。然后用滤纸吸去
多余的染料 ,加 40%甘油封片即可观察。此法染色效
果非常好 ,花粉管被染成蓝色 ,便于观察。
2.4　柱头可授性测定
参照 Dafni 的方法 ,用联苯胺-过氧化氢法进行测
定[ 4] 。于盛花期 ,随机标记发育阶段基本一致的花 ,在
开花后 1.0h 取 30 朵花的柱头浸入含有联苯胺-过氧
化氢的反应液 ,随后制片置 Olympus CX31RBSFA 型
光学显微镜下观察其柱头的可授性。柱头周围的反应
液呈现蓝色并有大量气泡出现 ,表明柱头具可授性。
2.5　药剂处理后柱头观测
Olympus CX31RBSFA 型光学显微镜下观察柱头
变化 ,发现:喷施蒸馏水的对照组 ,授粉 1.0h 后 ,花粉
未见萌发(如图 a),棉兰-乳酸-酚染色后 ,柱头出现明
显的胼胝栓;NaCl +硼砂处理后的柱头乳突细胞没
有出现胼胝反映 ,乳突细胞略成失水状 ,授粉 1.0h 后
的花粉已经约有半数萌发并且花粉管粗壮(如图 b);
丙酮处理后柱头上个别乳突细胞出现轻微胼胝反应 ,
花粉管较细弱 ,但花粉管还是能够生长并穿入柱头(如
图 c);KH2PO4 和硫酸铵处理后 ,乳突细胞壁严重失水
萎缩(如图 d),没有胼胝反应 , 2.0h后才发现有个别花
粉萌发;其方法他处理效果不明显 ,乳突细胞几乎没有
变化。人工异花授粉后 ,也是接近 1h 后花粉才有个别
萌发 ,并且柱头上不发生胼胝反应 ,而此 NaCl+硼砂
处理后的柱头上的花粉发育最接近于天然异交状况。
14
2008年 中　国　林　副　特　产 第 1期
图 d　硫酸铵处理
3　讨论
3.1　有研究表明 ,硼酸对花粉萌发和花粉管生长有明
显促进作用 ,特别是温度较高时 ,促进作用更为显
著[ 5] 。经处理后 ,种荚和种子发育速度与正常植株杂
交种荚和种子基本没有差异。同科同属植物通常就有
相同或相似的生理习性 ,它们的各种生物调节机制也
存在很多相似之处。尤其是十字花科植物 ,它们都表
现出一定的自交不亲和性 ,像大白菜 、甘蓝 、烟草等等。
其中芸苔属植物的自交不亲和性内在机制已有一定基
础 ,如 S 复等位基因的相互作用 , S位点糖蛋白 , S 多基
因家族 , S住点受体激酶 ,蛋白质可逆磷酸化等[ 6 ～ 10] 。
但菘蓝是否也与它们有相同机制还不为人们所知 ,因
此各种药液处理后作用原理有待进一步研究。
3.2　培养基中的花粉能够快速萌发 ,而没有经过药液
处理的菘蓝自花花粉落在柱头上是不能萌发的 ,原因
可能是花粉和柱头接合处产生的胼胝质阻断了花粉水
分和营养物质的供给 ,被筛选出来的有效药液恰恰阻
止了胼胝质的大量形成 ,使自交花粉能像异交花粉一
样得到足够的养分和水分 ,进而萌发生长。
3.3　在本次试验中 ,试验结果会受到授粉技术 、温度 、
湿度 、光照等外在因素影响 ,授粉时要求在花期采取一
些隔离措施 ,如用密网阻隔飞行昆虫 ,用化学药剂阻隔
爬行类昆虫 ,套袋隔离和增大株距等措施。如果上述
隔离措施隔离效果不好 ,则会影响到实验结果的准确
性。
3.4　结籽情况还受花枝部位 、花龄 、花粉活力 、植株营
养状况 、遗传因素等内在因素影响。上述试验方法经
证实确有实效 ,但是以上处理是否会影响到后代的遗
传变异还有待考证。
3.5　我们可以参照的克服自交不亲和性的方法还有
很多 ,像高温处理 、授粉后提高空气湿度 、电阻授粉、提
高授粉后的 CO2浓度 、喷洒化学药剂 、钢丝刷授粉 、刀
片削去柱头或用砂纸摩擦柱头以及用亲和花粉制剂诱
导 、剥蕾授粉等理化和机械方法等[ 11 ～ 14] ,因此需要科
研工作者付诸更多实践。事实上 ,人为因素对试验结
果的影响是不容忽视的 ,在今后的试验中应该尽可能
多的做一些横向和纵向的对比试验 ,尽可能把误差降
到最小 ,为农业科技做出应有的贡献。
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作者简介:高延辉(1982-), 男 ,吉林省长春市人 , 在读
硕士研究生 ,吉林农业大学研究生会副主席 , 主要研究方向:
药用植物栽培育种。 E-mail:gaoyanhui123456@163.com
＊通讯作者:任跃英 , 教授 , 博士生导师 , 吉林农业大学
中药材学院 , E-mail:renyuey ing@yahoo.com.cn
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2008年 高延辉等:克服菘蓝自交不亲和性的化学试剂筛选研究 第 1期