全 文 ：·专题报道·
【文章编号】　 0258-879X ( 2000) 03-0209-04
菘蓝不同栽培居群的等位酶分析
王　寅 1 ,　乔传卓1 ,　王中仁 2 ,　侯　鑫 2 ,　刘　盛 1
【摘要】　目的:对菘蓝 Isatis indigotica Fo rt.不同栽培居群进行等位酶分析研究。方法:在全国各地采集菘蓝 13个二倍体栽
培居群的种子 ,异地栽培于上海市崇明岛同一块试验田。 以水平切片淀粉凝胶电泳方法 ,对菘蓝等位酶多态性进行研究 ,分析
了 8个酶系统的 15个等位酶位点。 结果: 等位酶多态位点百分数 P为 13. 3% ～ 33. 3% ,每个位点的等位基因平均数 A为
1. 1～ 1. 5,预期杂合度 He为 0. 027～ 0. 109,菘蓝二倍体居群间基因分化比率为 8. 2%。结论:菘蓝不同栽培居群的等位酶谱
有明显差别 ,表明菘蓝种内存在遗传变异。
【关键词】　菘蓝 ;栽培居群 ;等位酶分析
【中图分类号】　 R 282. 71　　　　【文献标识码】　 A
Allozyme analysis in different cultivated populations of Isatis indigotica Fort.
WAN G Yin1 , Q IAO Ch uan-Zh uo1 , W ANG Zhong-Ren2 , HOU Xin2 , L IU Sheng1 ( 1. Depa rtment o f Pha rmacognosy , Colleg e of
Pha rmacy , Second Milita ry Medica l Univ er sity , Shanghai 200433, China; 2. Labo ra tor y o f Sy stema tic and Evo lutionar y
Bo tany , Institute o f Bo tany , Academia Sinica)
【ABSTRACT】　 Object ive: T o ana ly ze allo zyme in differ ent cultiv a ted populations o f Isatis indigotica Fo rt. Methods: The
seeds o f 13 cultiv a ted populations of diploid Isatis indigotica Fo r t. collec ted from the who le countr y w ere cultiv ated in Chong
M ing Island, Shanghai. Allo zyme polymo rphism in Isatis indigotica Fo r t. w as investig ated with the h orizontal sliceable
starch gel electr ophor esis. Eight enzymes and 15 loci w ere assessed. Results: The propo rtion of polymo rphic lo ci (P ) ranged
fr om 13. 3% to 33. 3% . The mean number o f alleles per lo cus ( A ) r anged fr om 1. 1 to 1. 5. The expected heter ozygosity
( He) ranged fr om 0. 027 to 0. 109. The ratio o f g ene differentia tion among popula tions o f diploid Isatis indigotica For t. was
8. 2% . Conclusion: The allo zymic spectrum in different cultiva ted populations o f Isatis indigotica Fo r t. a re diffe rent, which
show s tha t ther e ex ists the genetic va ria tion o f Isatis indigotica Fo r t.
【KEY WORDS】　 I satis indigotica Fo rt. ; cultiva ted popula tion; allo zyme ana ly sis
[ Acad J Sec M il M ed Univ , 2000, 21( 3): 209-212 ]
⒇
　 十字花科植物菘蓝 Isat is indigot ica Fo rt.为常
用中药材大青叶、板蓝根的主要来源 ,是我国南北各
地大宗栽培的重要药用植物 ,历版中国药典均有收
载。研究表明不同栽培居群的菘蓝在药材性状、理化
特征、有效成分含量和药理效用等方面存在显著差
异 [1, 2 ]。生态环境的差异以及物种遗传变异是导致药
材品质差异的主要影响因素 [3, 4 ]。
等位基因酶 ( allo zyme,简称等位酶 ) ,是同一基
因位点的不同等位基因所编码的一种酶的不同形
式 ,作为结构基因编码的产物 ,其变化能很好地代表
DNA分子水平上的变化 ,表明等位基因变化的存
在。等位酶的遗传和表达遵循孟德尔定律 ,酶位点的
不同等位基因都是等显表达的 ,从酶谱上可以直接
分析识别出编码它们的等位基因 ,且能统计出等位
基因频率和基因型频率 ;作为一种稳定的基因组标
志比形态特征更直接地反映了遗传信息 ,通过众多
位点的抽样分析可以推断或代表整个基因组的遗传
学情况。 等位酶分析方法目前是了解天然居群的遗
传结构、基因丰富程度以及栽培作物种质资源遗传
多样性的重要手段 [5 ]。
我们将各地不同栽培居群菘蓝移栽于上海市崇
明岛同一块试验田内 ,采用水平切片淀粉凝胶电泳
方法对异地栽培的不同居群菘蓝进行等位酶分析 ,
考察菘蓝种内居群间的遗传结构差异 ,旨在为深入
研究种质遗传资源因素对菘蓝药材优良品种形成的
作用及调控机制提供依据。
·209·第 二 军 医 大 学 学 报Acad J Sec Mil Med Univ　 2000 Mar; 21( 3)
⒇ 【基金项目】　国家自然科学基金资助项目 ( 39670878)
【作者单位】　 1. 第二军医大学药学院生药学教研室 ,上海
200433; 2. 中国科学院植物研究所系统与进化开放实验室
【作者简介】　王　寅 ( 1974～ ) ,男 (汉族 ) ,博士生
1　材料和方法
1. 1　药材和仪器　在全国各地采集不同栽培居群
的菘蓝种子 ,异地栽培于上海市崇明岛同一块试验
田 ,经鉴定为 Isat is indigotica For t. ,编号见表 1。通
过细胞学观察 ,确证均为二倍体植株 ,染色体数目
2 n= 14
[6 ]。 实验所用试剂均为 Sigma公司产品。
“ SG-ZW”型水平切片电泳仪 (北京六一仪器厂 ) ,玻
璃门冰箱 (青岛海尔公司 ) , - 80℃低温冰箱 (美国
Frig or公司 )。
表 1　菘蓝不同栽培居群的遗传变异指标
Tab 1　 Genetic variability in 13 populations of Isatis indigot ica Fort.
Population A P Ho He
1　 Fuyang , Anhui　　　　　 1. 4 (0. 2) 26. 7 0. 067( 0. 031) 0. 078( 0. 039)
2　 Sixian, Anhui 1. 4 (0. 2) 13. 3 0. 030( 0. 020) 0. 040( 0. 023)
3　 Bozh ou, Anhui 1. 2 (0. 1) 13. 3 0. 028( 0. 019) 0. 031( 0. 022)
4　 Yuzhou, Henan 1. 3 (0. 2) 26. 7 0. 053( 0. 026) 0. 073( 0. 045)
5　 Chifeng , Neimonggol 1. 4 (0. 2) 20. 0 0. 047( 0. 027) 0. 079( 0. 042)
6　 Taigu, Shanxi 1. 1 (0. 1) 13. 3 0. 015( 0. 015) 0. 027( 0. 018)
7　 Sheyang , Jiangshu 1. 2 (0. 1) 20. 0 0. 040( 0. 022) 0. 037( 0. 020)
8　 Shengyang, Liaoning 1. 3 (0. 2) 26. 7 0. 030( 0. 014) 0. 035( 0. 017)
9　 Lingquan, Anhui 1. 3 (0. 2) 13. 3 0. 063( 0. 038) 0. 068( 0. 040)
10　 Anguo, Hebei 1. 4 (0. 2) 26. 7 0. 047( 0. 021) 0. 059( 0. 026)
11　Xing tai, Hebei 1. 3 (0. 2) 26. 7 0. 037( 0. 017) 0. 056( 0. 027)
12　Xianyang, Shanxi 1. 5 (0. 2) 33. 3 0. 070( 0. 033) 0. 109( 0. 043)
13　 Taixing, Jiangsh u 1. 4 (0. 2) 26. 7 0. 070( 0. 039) 0. 059( 0. 031)
　　 Standard deviat ion in parentheses
1. 2　方法　按照文献 [5]的配方配制复杂提取缓冲
液 ,电泳、凝胶缓冲液。将移栽的菘蓝以居群为单位 ,
各随机取样 20株 ,连根新鲜保存 ,取各株的新鲜幼
嫩绿叶 1～ 2 cm2 ,加 3～ 5滴复杂磷酸盐缓冲液研磨
均匀 ,用新华 1号滤纸剪成 2. 5 cm× 6. 5 cm的沁
子 ,蘸取提取液 ,于 - 80℃冰箱保存备用。
称取水解淀粉 31. 5 g ,加 1 000 ml蒸馏水 ,搅
匀 ,煮沸 ,抽气 ,注入模盘内 ,待冷却后 ,表面加盖玻
璃板 ,室温下冷凝过夜 ,使凝胶浓度为 12. 5% 。
每次电泳前在冷冻保存的沁子上加 1滴 2%的
2-巯基乙醇 ,使其解冻后上样。在 4℃冰箱中 ,使用
“ SG-ZW”型 250 ml水平切片电泳槽进行电泳 ,控
制电流为 30～ 35 m A。以溴酚蓝钠盐为凝胶前锋线
标记 ,跑出 10～ 15 cm,即可停止电泳 ,将凝胶切片
染色。 共测定了 8个酶系统 (表 2) ,其中 AAT和
LAP酶采用液染法 , PGD, PGI, PGM , IDH, HEX和
MDH酶采用胶染法。
　　对酶谱进行记录时 ,若有多个位点 ,从阳极到阴
表 2　检测的酶系统和电泳、凝胶缓冲系统
Tab 2　 Enzyme assayed and buf fers systems used
Enzym e sys tems Abb r. E C No. Buf fers s ystems
Phosphoglucomutase PGM EC 5. 4. 2. 2 Sodium borate /Tri s-Ci tric acid ( pH 8. 6)
Phosphoglucoisomeras e PGI EC 5. 3. 1. 9 Sodium borate /Tri s-Ci tric acid ( pH 8. 6)
Phosphogluconate d ehyd rogenase PGD EC 1. 1. 1. 44 Li th ium borate /Tri s-Ci tric acid ( pH 8. 0)
Hexokinase HEX EC 2. 7. 1. 1 Sodium borate /Tri s-Ci tric acid ( pH 8. 6)
Isoci t ric deh yd rogenase IDH EC 1. 1. 1. 42 Li th ium borate /Tri s-Ci tric acid ( pH 8. 0)
Malate deh ydrogenas e MDH EC 1. 1. 1. 37 Li th ium borate /Tri s-Ci tric acid ( pH 8. 0)
Leucine aminopep tidase LAP EC 3. 4. 11. 1 Morpholine-Ci tric acid
Aspartate aminot rans ferase AAT EC 2. 6. 1. 1 Morpholine-Ci tric acid
·210· 第二军医大学学报　 2000年 3月 ,第 21卷
极 ,依次用 1, 2,……表示各个位点 ,对每个位点的
不同等位基因 ,从阳极到阴极 ,依次用 a, b, c,……
表示。 在跑每一块胶时 ,控制电泳条件 ,温度和电泳
时间基本相同 ,使不同胶上的酶谱具有可比性 ,最后
对不同基因型的材料 ,再选出具代表性的放在同一
块胶上电泳 ,以确定等位基因的数目。
根据各个居群等位基因的组成和频率 ,计算下
列遗传变异度量指标: 多态位点百分数 P (采用具两
个以上等位基因 ,且最常见等位基因频率等于或小
于 0. 99的标准 ) ; 每个位点的等位基因平均
数 ( A ) ;平均预期杂合度 He,平均观察杂合度 Ho,
统计量 F ,包括亚群体的固定指数 F IS ,总群体的固
定指数 FI T ,亚群体间的基因分化比率 FS T (相当于
基因分化系数 GS T ) ;以 p-distance公式计算遗传距
离D。 　　　
2　结　果
实验获取了 8个酶系统共 15个等位基因位点
的资料 ,其中 6个为多态位点 ,编码多态位点的等位
基因和居群中的各种基因型模式见图 1。
图 1　等位酶谱带的多态位点、等位基因 (X)及居群中的各种基因型 (XX)模式
Fig 1　 Allozyme bands and the relevant polymorphic loci and alleles and the genotypes f rom populations samples
　　菘蓝种内不同栽培居群的多态位点百分数 P
为 13. 3% ～ 33. 3% ,每个位点的等位基因平均数 A
为 1. 1～ 1. 5,平均观察杂合度 Ho为 0. 015～
0. 070,平均预期杂合度 He为 0. 027～ 0. 109。 He
又叫基因多样性指数 ,可反映群体等位基因的丰富
程度 ,表明如果随机交配 ,存在 2. 7% ～ 10. 9%的杂
合体 (表 1)。
基因分化系数 (表 3)可以衡量群体的分化程
度。亚群体基因分化比率的平均值为 0. 082,表明二
倍体菘蓝群体间存在 8. 2%的变异 ,居群间的分化
程度较低。 Pgi-2,Lap-1两位点的 FI S , F I T值为负 ,
表明位点杂合度过量及整个种内此位点杂合度大于
期望值。菘蓝不同栽培居群的等位酶多态性反映了
其种内遗传多样性及遗传结构的变异。遗传距离计
算表明内蒙古赤峰居群和江苏射阳居群之间的遗传
距离最大 ,为 0. 012,而地理位置相近的菘蓝栽培居
群 ,如河北邢台与河北安国 ,内蒙古赤峰与辽宁沈
阳 ,安徽泗县与安徽临泉 ,安徽阜阳与河南禹州 ,遗
传距离较小。表明菘蓝种内的遗传变异在地理分布
上有一定的趋向性。
表 3　菘蓝不同栽培居群多态位点的 F统计量
Tab 3　F-statistics of the polymorphic loci in diff erent
cultivated populations of Isat is indigotica Fort.
Locus FIS FI T F ST
Pg i-2 - 0. 062 - 0. 009 0. 050
P gm-2 0. 579 0. 626 0. 111
Pgd-1 0. 377 0. 431 0. 086
Pgd-2 0. 140 0. 212 0. 084
Lap-1 - 0. 095 - 0. 055 0. 036
Mdh-1 0. 029 0. 121 0. 094
Mean 0. 189 0. 256 0. 082
·211·第 3期 . 王　寅 ,等 . 菘蓝不同栽培居群的等位酶分析
3　讨　论
居群生物学研究认为物种是由一个或若干个多
少间断的居群所组成的 ,居群则是由共享一个基因
库 (g ene poo l)的许多个体所组成的 ,这些个体在遗
传上存在着差异 ,构成种的各个居群的遗传组成在
空间和时间上并不是绝对均匀、随机分布的 ,而常常
是非随机分布、存在着变化的。物种及其多样性的居
群内存在个体变异和居群变异。 一个物种具有广泛
的分布区时 ,它的各个不同地区的居群往往具有不
同的基因型 ,或称地方特化基因型 ( lo cal speciali zed
geno type) ,这些基因型是由于不同的生态或地理的
条件长期作用塑造而成的 [7 ]。
菘蓝原产我国 ,是临床常用的清热解毒中药 ,对
其药材道地性研究深受关注。经文献查考及产地原
植物调查未发现存在野生居群 ,因栽培历史长久 ,地
理间隔大 ,彼此间交配机会少 ,形成了一些地方繁育
居群 ,在进化中遗传发生漂变 ,表现在形态上则为茎
生叶的基部有箭形和圆形的不同 ,果实的大小和形
状不一致 [6 ]。
对异地栽培菘蓝药材的研究结果表明 ,在相同
生态环境中生长的不同居群菘蓝在化学成分、药理
作用等方面依然存在显著差别 ;同一个居群菘蓝的
品质在移栽前后没有明显变化。等位酶分析结果又
证实了菘蓝种内不同栽培居群在遗传结构上确实存
在差异。 这表明物种遗传因素较生态环境因素在菘
蓝药材品质形成中起更大作用 ,菘蓝种内遗传变异
是导致不同来源药材质量有差别的主要原因之一。
【参 考 文 献】
[1 ]　刘　盛 ,乔传卓 . 不同栽培居群板蓝根性状及显微特征的变异
研究 [ J] . 中草药 , 1999, 30( 5): 368-371.
[ 2]　王　寅 ,尹　茶 ,乔传卓 ,等 .不同栽培居群菘蓝叶中 5种有机
酸成分的含量差异 [ J] .第二军医大学学报 , 1999, 20( 6): 374-
376.
[3 ]　肖小河 ,夏文娟 ,陈善墉 .中国道地药材研究概论 [ J ].中国中药
杂志 , 1995, 20( 6): 323-326.
[4 ]　黄璐琦 ,张瑞贤 .“道地药材”的生物学探讨 [ J ].中国中药杂志 ,
1997, 22( 9): 563-566.
[ 5 ]　王中仁 主编 . 植物等位酶分析 [M ].北京:科学出版社 , 1996.
1-6.
[ 6 ]　乔传卓 ,崔　熙 .菘蓝和欧洲菘蓝的鉴别研究 [ J] .植物分类学
报 , 1984, 22( 3): 237-242.
[ 7 ]　陈家宽 .居群生物学与进化生物学 .见:陈家宽 ,杨　继 主编 .
植物进化生物学 [M ] . 武汉:武汉大学出版社 , 1994. 9-13.
【收稿日期】　 1999-10-15　　 【修回日期】　 2000-01-29
【本文编辑】　姚春芳
·个案报告·
【文章编号】　 0258-879X ( 2000) 03-0212-01
难取性小儿支气管异物一例报告
林顺涨 ,　孙爱华 ,　郎军添
1　临床资料　患儿 ,女 , 11岁。 32 d前 ,玩耍时误将一塑料
管状哨子吸入 ,当时剧烈咳嗽 ,口唇紫绀 ,此后症状缓解 ,但
伴有阵发性咳嗽、呼吸急促。曾于外院诊断为支气管异物 ,先
后在 3家医院行支气管镜下异物取出术 ,均未成功。于 1999
年 4月 11日来我院急诊 ,入院时检查: 精神稍差 ,伴有阵发
性咳嗽 ,呼吸稍急促 ,发热 ;左肺呼吸音明显减弱 ,并可闻及
湿 音。X线胸片报告:左肺纹理增粗。给予青霉素等抗炎治
疗。次日在全麻下行支气管镜下异物取出术 ,术中持续给氧。
术中放入内径 5 mm的支气管镜 ,见左支气管内有较多的脓
血样分泌物 ,给予彻底吸除后 ,见左支气管内有肉芽样物 ,经
用 1∶ 1 000肾上腺素棉球多次收缩后 ,方可见一管状塑料异
物 ,因异物嵌顿于支气管内 ,多次试取均未成功。最后用异物
钳通过管状异物 ,到达其远端后反张异物钳 ,终于成功取出
一长约 2 cm,直径约 0. 9 cm的塑料管状哨子 ,术后病情恢
复好 ,第 2天出院。
2　讨　论　　小儿支气管异物种类较多 ,其中管状异物手
术难度相对较大 ,尤其是异物滞留时间长 ,又经过多次手术 ,
伴有并发症的异物。对于这些患儿 ,若无阻塞性呼吸困难 ,先
住院给予消炎治疗 ,待并发症好转后再手术取出 ;手术应在
全麻下进行 ,同时持续给氧。 术中若见异物嵌顿于支气管内
或异物周围有肉芽生长 ,可先用肾上腺素小棉球收缩后再试
取。 若为管状塑料异物 ,则用反张式异物钳为宜。
【关键词】　异物 ,支气管 ;小儿
【中图分类号】　 R 725. 6　　　　　【文献标识码】　 B
【收稿日期】　 1999-10-27　　 【修回日期】　 2000-01-11
【本文编辑】　邓晓群
【作者单位】　第二军医大学长征医院耳鼻咽喉科 ,上海 200003
【作者简介】　林顺涨 ( 1962～ ) ,男 (汉族 ) ,博士 ,主治医师
·212· 第二军医大学学报　 2000年 3月 ,第 21卷