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辣木快速繁殖体系



全 文 :第33卷第3期
2015年6月
上 海 交 通 大 学 学 报 (农 业 科 学 版)
JOURNAL OF SHANGHAI JIAOTONG UNIVERSITY(AGRICULTURAL SCIENCE)
Vol.33No.3
 Jun.2015
文章编号:1671-9964(2015)03-0065-06  DOI:10.3969/J.ISSN.1671-9964.2015.03.010
收稿日期:2014-07-29
基金项目:上海市研究生教育创新计划项目(园艺学)
作者简介:杨俊俊(1990-),女,硕士生,研究方向:植物生物技术,E-mail:xiaosha8545268@163.com;
潘俊松(1971-)为本文通讯作者,男,博士,副教授,研究方向:黄瓜遗传育种,E-mail:jspan71@sjtu.edu.cn
辣木快速繁殖体系
杨俊俊,曲美玲,李 月,潘俊松,何欢乐,蔡 润
(上海交通大学 农业与生物学院,上海200240)
摘 要:研究通过对辣木种子消毒方法、增殖阶段6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)浓度、生根阶段吲哚丁
酸(IBA)浓度、移栽炼苗时间进行筛选,确定辣木种子适宜的消毒方法为75%的酒精浸泡30s后
用1% NaClO消毒15min;增殖培养基为 MS+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂
(pH5.8);生根培养基为1/2MS+0.4mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂(pH5.8);移栽时
炼苗6d较适宜。由此建立了辣木快速繁殖体系,为规模化生产辣木提供参考。
关键词:辣木;快速繁殖;离体培养
中图分类号:Q943.1    文献标识码:A
Rapid Propagation System of Moringa oleifera Lam.
YANG Jun-jun,QU Mei-ling,LI Yue,PAN Jun-song,HE Huan-le,CAI Run
(School of Agriculture and Biology,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200240,China)
Abstract:Disinfection strategies and culture media were investigated to develop a convenient system for
Moringa oleifera Lam.propagation.The results showed that soaking the fresh sheled moringa seeds with
75%alcohol for 30s,then 1% NaClO for 15min can achieve the best disinfection effect.The appropriate
proliferation medium was MS+1.0mg/L 6-BA (6-Benzylaminopurine)+30g/L sucrose+7.0g/L
agar(pH5.8).The proper rooting medium was 1/2MS+0.4mg/L IBA(Indole-3-Butytric acid)+30g/
L sucrose+agar 7.0g/L(pH5.8).The suitable acclimatization time was 6days.The study established
the moringa rapid propagation system,and provided technical reference for the large-scale production of
moringa.
Key words:moringa;rapid propagation;tissue culture
    辣 木 科 (Moringaceae)只 有 一 个 辣 木 属
(Moringa),共有14个种,在我国进行食用及开发
利用的有印度传统辣木(Moringa oleifera Lam.)、
印度改良种辣木(M.oleifera Lam.PKM 1和PKM
2)和非洲辣木(M.stenopetala Lam.)[1]。辣木家族
中最负盛名,研究最多的为辣木 (M.oleifera
Lam.)[2],多年生热带落叶乔木,原产非洲东北部和
印度北部的喜马拉雅山麓以及红海沿岸等自然条件
恶劣的地方。辣木是一种既具有生态价值又具有经
济价值的多用途树种[3],含有丰富的氨基酸、维生
素、矿物质元素和活性酶类物质,抗逆性强,且全株
可利用,具有食用、营养保健、工业、药用等多种用
途,是一种用途广、经济价值高的多功能经济树种,
因此被誉为“奇迹树”[4-5]。
上 海 交 通 大 学 学 报 (农 业 科 学 版) 第33卷
因辣木用途广泛,我国云南、海南、四川、福建等
地都进行了引种栽培。我国引种栽培的辣木目前主
要依靠种子进行繁殖。辣木种子适宜随采随播,发
芽率随储存时间的延长而降低[6]。我国辣木资源有
限,辣木种子价格非常昂贵,而利用组织培养建立辣
木快速繁殖体系可以在短期内得到大量优质辣木种
苗,有利于我国辣木生产的快速发展。国内关于以
种子为外植体进行辣木离体培养的研究并不多,且
种子消毒方法使用的化学药品多具有较强的危害
性,进行辣木增殖和生根的培养基配方添加激素较
多。本试验旨在通过简单快捷的方法建立辣木快速
繁殖体系,对辣木的种子消毒方法、芽的诱导增殖、
根的诱导培养和移栽炼苗时间进行了探讨,以期筛
选出最佳的辣木快速繁殖培养程序,为辣木工厂化
大规模生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料辣木(M.oleifera Lam.)由海南立诺
农业生物技术有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 种子消毒与初始培养
挑选保存良好的饱满辣木种子,去除纸质白翼。
将辣木种子用75%酒精浸泡30s,无菌水冲洗3
次,1%的次氯酸钠(NaClO)溶液分别浸泡10、15、
20min,无菌水冲洗5次,用滤纸吸干后将其接种于
1/2MS培养基(本文所用培养基均含蔗糖30g/L,
琼脂7.0g/L,pH5.8),25±2℃,16h/8h(光/暗)
条件下培养。每个处理10粒种子,6次重复。接种
后20d统计种子的污染率、死亡率、发芽率。从中
挑选出最适消毒方法,消毒后分别浸种10、20、30
min,统计其发芽率及最短发芽时间。
1.2.2 诱导及增殖培养
在 MS培养基中添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA),
其终浓度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0mg/L。种子
发芽后,切去无菌苗的顶芽和根,将带有下胚轴的子
叶节段放置于 MS培养基上,待其长出不定芽约2
cm时,从基部切下芽条,接种于含不同6-BA浓度
的培养基中,每处理10个外植体,3次重复,每2周
切下约2cm的芽条继代1次,观察记录再生芽情
况,并计算芽增殖倍数(增殖倍数=分化芽数/接种
芽数),选出最佳诱导及增殖培养基。
1.2.3 生根培养
以 1/2MS 为 基 础 培 养 基,添 加 吲 哚 丁 酸
(IBA),使其终溶度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0
mg/L。将增殖4代得到的约3~4cm的健壮小苗
从基部切下分别接种于含不同IBA浓度的培养基
中,每处理6个外植体,3次重复。观察记录20d内
生根情况,选出最佳生根培养基。
1.2.4 移栽试验
生根培养15d后,辣木幼苗已长出大量健壮的
根,此时将三角瓶的封口膜除去,在25±2℃,16h/
8h(光/暗)的条件下炼苗,分别于0、3、6、9d后将
植株从瓶中取出,清洗植株根部培养基,并移栽至穴
盘已灭菌的有机基质(N+P2O5+K2O2%,有机
质40%)中,置于25±2℃,16h/8h(光/暗)培养
箱中,盖上透明的保湿罩子,留小孔与外界进行气体
交换。随移栽天数增加不断扩大小孔面积,1周之
后取下罩子。20d后统计移栽成活率。
1.2.5 数据处理
试验数据用Excel进行初步处理,之后用DPS
数据处理软件进行方差分析、LSD多重比较。
2 结果与分析
2.1 消毒方法及浸种时间对种子污染和发芽的
影响
辣木种子接种后,无污染的种子一般4d后种
胚开始膨大,5~6d长出胚根,10d左右长出1cm
的小苗,约15d出芽整齐,长成6cm高的小苗。接
种后15d还未发芽的种子以后基本不会再发芽。
由表1可以看出,NaClO处理10min与15、20
min达显著差异水平,但后两者之间无显著性差异,
NaClO处理15与20min发芽率分别可达81.7%、
80.0%。故辣木种子用1% NaClO处理15或20
min均可达到较好的消毒效果。在此消毒方式的基
础上确定浸种时间,由表2可以看出,浸种时间各处
理间均无显著性差异,但浸种时间为10min时发芽
率最高,达83.3%,随着浸种时间的延长,发芽率不
仅没有增加,反而有所降低,经观察发现浸种时间过
长导致种子表皮破损,可能是该原因导致发芽率
降低。
综上,辣木接种时可采用75%酒精浸泡30s+
1% NaClO浸泡15min+无菌水浸种10min的
方式。
66
第3期 杨俊俊,等:辣木快速繁殖体系
表1 NaClO处理时间对辣木种子消毒效果的影响
Tab.1 Effects of NaClO treatment time on disinfection
NaClO处
理时间/min
NaClO
treatment
种子
总数
Number of
seeds
污染数
Number of
poluted seeds
死亡数
Number of
dead seeds
发芽数
Number of
germinated
污染率/%
Polution
rate
死亡率/%
Death rate
发芽率/%
Germination
rate
10  60  22  4  34  36.7  6.7  56.7b
15  60  8  3  49  13.3  5.0  81.7a
20  60  7  5  48  11.7  8.3  80.0a
  注:同列中不同字母表示差异显著(P<0.05),下同。
Note:Different alphabet in the same column indicates the difference is significant(P<0.05).The folowing table is the same.
表2 浸种时间对辣木种子发芽的影响
Tab.2 Effects of soaking time on Moringagermination
浸种时间/min
Soaking time
种子数
Number of seeds
最短出苗时间/d
Time of germination
发芽数
Number of germination
发芽率/%
Germination rate
0  60  11  49  81.7a
10  60  9  50  83.3a
20  60  8  47  78.3a
30  60  9  45  75.0a
2.2 芽的诱导增殖研究
通过观察发现,辣木在 MS+6-BA(浓度分别为
0、0.5、1.0、1.5、2.0mg/L)的培养基中均可生长,
当6-BA浓度达到2.0mg/L时,从外观上看丛芽数
目众多,其数目无法统计,节间极短。另外由于切割
时对辣木茎段造成创伤,一般3d后茎段基部开始
膨大,产生愈伤组织,不同浓度6-BA的培养基中茎
段出现愈伤组织的时间比较接近。
由表3可以看出,6-BA 浓度为0、0.5、1.0
mg/L时各水平间达差异显著水平,6-BA 1.0与1.5
mg/L之间无显著差异。辣木在 MS+1.0mg/L 6-
BA的培养基中增殖倍数较高,且茎段基部仅有少
量愈伤组织产生,适宜作为辣木增殖培养基。此外,
通过多次继代发现,6-BA浓度为0、0.5、1.0mg/L
可继代10次以上,继代苗依然健壮,而6-BA浓度
为1.5、2.0mg/L时,增殖至第5代时出现植株黄
化,增殖至第6代时,植株出现黄化,并逐渐死亡
现象。
表3 6-BA浓度对辣木芽诱导的影响
Tab.3 Effects of 6-BA concentration on buds induction
6-BA浓度/(mg·L-1)
Concentration of 6-BA
芽生长情况
Growth of buds
平均增殖倍数/%
Proliferation ratio
0 芽伸长明显,芽数量增加不明显,节间较长,茎段基部有微量愈伤组织 1.8c
0.5 芽伸长明显,芽数量生长亦明显,节间较长,茎段基部有少量愈伤组织产生 3.9b
1.0 芽伸长不明显,芽数量增加明显,节间不长,茎段基部有少量愈伤组织产生 6.5a
1.5 芽伸长不明显,芽数量增加明显,节间较短,茎段基部愈伤组织量较多 6.0a
2.0 芽伸长不明显,芽数量增加明显,节间极短,茎段基部形成大量愈伤组织 —
  注:“—”代表丛芽数目众多,无法统计数据。
Note:“—”refers to the number of buds cannot be counted.
2.3 诱导生根
试验结果(表4、图1)表明,辣木幼苗较易生根,
在1/2MS培养基中添加不同浓度的IBA均可生
根。随着IBA浓度的增大,幼苗根系逐渐粗壮,生
根量逐渐增多,但辣木根系与茎间的愈伤组织也随
着增加,过大面积的愈伤组织在后续清洗根系时容
易导致根系脱落,不利于移栽。
因此在选择辣木适宜生根培养基时,不仅要考虑
生根率和单株生根量,还要考虑根系与茎间的愈伤组
情况,以及辣木整株的生长状况。通过观察发现,在
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上 海 交 通 大 学 学 报 (农 业 科 学 版) 第33卷
IBA浓度为0.4mg/L时,辣木生根质量较高,不仅每
株苗上生根数量较多,根系粗壮,辣木根系与茎间的
愈伤组织也不多,且植株生长良好。故选择1/2MS
+0.4mg/L IBA为辣木适宜生根培养基。
表4 IBA浓度对辣木生根的影响
Tab.4 Effects of IBA concentration on Moringa rooting
I-BA浓度/
(mg·L-1)
Concentration
of I-BA
最短生
根时间/d
Time of rooting
生根率/%
Rooting
rate
平均根数
Average root number
per explant
根系生长情况
Growth
of root
0  6  100  2.2d 根系细弱,基部生有少量愈伤组织
0.2  6  100  3.5c 根系较细弱,基部生有少量愈伤组织
0.4  5  100  6.0b 根系较粗壮,基部生有少量愈伤组织
0.6  5  100  6.2b 根系较粗壮,基部生有大量愈伤组织
0.8  5  100  8.0a 根系粗壮,基部生有大量愈伤组织
1.0  5  100  7.0ab 根系较粗壮,基部生有大量愈伤组织
图1 IBA浓度对辣木生根的影响
注:图1中各处理以1/2MS为基础培养基,添加不同溶度的IBA,A~F分别表示IBA浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/L。
Fig.1 Effect of different concentration of IBA on moringa rooting
Note:Each treatment in fig.1added different concentration of IBA on the basis of 1/2MS,A-F is referred to IBA 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0
mg/L.
2.4 最适炼苗时间的筛选
通过观察发现,当炼苗天数为6d时移栽成活
率最高,为86.7%,与其他炼苗天数间达差异显著
水平。当炼苗天数为0d时,移栽成活率最低,为
3.3%,可见不经过炼苗不能直接进行移栽。当炼苗
天数为3d时移栽成活率为56.7%,死亡植株大多
表现为枯黄、失水严重。当炼苗天数为9d时移栽
成活率为20.0%,植株大多因污染而死亡,植株表
面被菌丝覆盖。
表5 辣木最适炼苗时间试验
Tab.5 The influence of seedling hardening-off days on
the survival rate of moringa
炼苗时间/d
Days of seedling
hardening-off
移栽数
Number of
explants
成活数
Survival
number
成活率/%
Survival
rate
0  30  1  3.3c
3  30  17  56.7b
6  30  26  86.7a
9  30  6  20.0c
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第3期 杨俊俊,等:辣木快速繁殖体系
3 讨论
3.1 辣木种子消毒
在进行植物组织培养时,外植体的消毒是必不
可少的关键性步骤之一。罗云霞对辣木种子采用
0.1%升汞消毒25~40min,发芽率达70.3%~
78.3%[7];赵翠翠用NaClO对辣木种子消毒时污染
率达100%,用0.1%升汞消毒处理10min得到无
菌苗,污染率为19.58%,萌发率为77.92%[8]。升
汞消毒固然可以得到辣木无菌苗,但升汞为剧毒化
学试剂,操作中存在安全隐患,并且升汞的毒性也会
对辣木造成一定的伤害。本试验采用 NaClO消毒
达到了比较满意的效果,而在操作过程中又大大降
低了安全隐患。
本试验在后续观察中发现保存2年的种子发芽
率仅为20.0%,且污染率高于保存1年的种子,张
婧在进行辣木快速繁殖时发现类似现象[9],故在进
行辣木种子消毒处理时应采用保存1年以下的
种子。
3.2 芽诱导与增殖
罗云霞在辣木增殖培养基中添加了0.6mg/L
6-BA+0.1mg/L NAA,增殖倍数可达5.8[5]。本
研究采用的辣木增殖培养基仅添加了6-BA,不仅减
少了激素种类,增殖倍数也有所提高。本试验发现
组培苗培养时间过长会出现幼苗黄化、叶片脱落现
象,推测其原因可能是辣木组培苗消耗营养较快,继
代周期以2周1次为宜。
在不同6-BA浓度培养基中,辣木外植体随6-
BA浓度增加,其节间长度逐渐缩短,促进腋芽萌
发,但抑制了苗的伸长生长。这与向素琼[10]和武新
琴[11]的研究结果相符。在生产实践中进行增殖时
可采用 MS+1.0mg/L 6-BA的培养基,以较高的
增殖能力得到较多的组培苗,先在继代5~6次后转
入 MS培养基或 MS+0.5mg/L 6-BA的培养基中
培养两周,促进伸长,之后转入生根培养基进行生根
培养。
3.3 生根与炼苗移栽
辣木生根一般采用IBA、NAA 及IAA。朱伟
银采用1/2MS+0.1mg/L NAA+0.2mg/L IBA
生根率达61.25%[12]。罗云霞指出 NAA 浓度为
0.05mg/L时生根率为80%,随 NAA浓度升高生
根率降低,IBA浓度为0.1mg/L时生根率达98%,
须根4~5根[13]。赵翠翠采用1/2MS+0.1mg/L
NAA生根率达53.03%,平均根数达6.7根。采用
MS+0.5mg/L IAA时生根率达78.06%,平均根
数为3.24根[8]。本试验IBA浓度为0.4mg/L时
生根率达100%,平均根数可达6根。可见仅用
IBA即可达到生根效果。
罗云霞提出炼苗要使组培苗根部变成黄褐色之
后再进行移栽[13]。本试验中炼苗6d后移栽成活率
最高,此时组培苗出现将要污染的迹象而又未大面
积污染。
3.4 辣木快速繁殖程序
综合本试验结果,总结辣木适宜的快速繁殖程
序为:保存1年以下的辣木种子75%酒精处理30s
后采用1% NaClO 15min进行消毒,浸种10min
后接种于1/2MS培养基;利用种子发芽得到的无
菌苗,切下子叶节放置在 MS培养基上,待6~7d
长出大量不定芽后,切下单芽,接种于增殖培养基
(MS+1.0mg/L 6-BA)中进行增殖;当带芽茎段长
至2~3cm时,将其切下接种于生根培养基(MS+
0.4mg/L IBA)中,14d左右辣木幼苗长出大量健
壮的根,此时将培养瓶的封口膜除去,在25±2℃,
16h/8h(光/暗)的条件下炼苗6d,清洗植株根系,
移栽至灭过菌的基质中,盖上透明的保湿罩子,留小
孔与外界进行气体交换;随移栽天数增加不断扩大
小孔面积,1周之后取下罩子。
本研究建立了辣木快速繁殖体系,平均增殖倍
数可达6左右,平均35d可得到生根组培苗,且方
法简便,种子处理采用消毒剂危害性小,增殖和生根
添加激素种类较少,生产实践中便于规范性操作,为
辣木规模化生产应用提供参考。
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2007.
(上接第64页)
不同成熟度的配子体材料等因素对繁殖效果的
影响。
本文采用棕榈垫作为立体绿化的载体。此外,
有专利表明旧衣服和纸浆经过处理后也可以用来栽
培苔藓,并且可以生产出苔藓群落用于结构物表面
绿化[14]。因此,在今后的试验中,可以考虑不同来
源的栽培支持物,比较它们的效果,结合成本等因
素,为大规模绿化模块的生产提供可操作性的方案。
藓类植物在绿化载体上的繁殖和生长适应性评
估上,本文提出了一个综合评估指数,能够较好地将
各指标综合在一起,对研究的藓类植物的适用性进
行了排序。从现有的10个指标来分析,东亚砂藓和
细叶莲叶藓有较好的生长表现。在同等条件下栽培
16种顶蒴藓类,仅有以上5种藓类有较好的生长状
况,分析其所属科得到,东亚砂藓是紫萼藓科,细叶
莲叶藓和双色真藓都是真藓科,剑叶扭口藓和缺齿
小石藓是丛藓科。因此,在今后立体绿化藓类植物
种类筛选中,注意从紫萼藓科、真藓科和丛藓科的种
类中进行筛选。
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