全 文 ：第 1 期
收稿日期：2015-3-25
基金项目：青海省科技厅科技发展基础研究项目（2013-Z-757）
作者简介：李海丽（1967-），女，陕西西安人，教授，主要从事藏药药理学研究，（电话）13119710300（电子信箱）1164948799@qq.com。
第 55卷第 1期
2016年 1月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 55 No.1
Jan.，2016
ol． 55 o.1
Jan.，2016
高原环境因其海拔原因具有气压低、 氧气稀
薄、空气干燥、气候寒冷、紫外线照射强烈等一系列
恶劣条件， 并随着海拔的升高这些条件进一步恶
化，为高原地区人们的生活、工作及身体健康造成
负面影响。 目前，国内外学者普遍认为，长期暴露在
缺氧环境中会对人的认知功能产生一些影响，如感
知觉、记忆力、思维力和注意力的下降等，并且对情
绪情感和心理运动能力都有负面反应［1］。 苞叶雪莲
（Saussurea obvallata）是菊科风毛菊属的植物。 分布
在印度、锡金、尼泊尔、克什米尔以及中国大陆的云
南、甘肃、四川、西藏、青海等地，生长于海拔 3 200～
4 700 m的地区，在藏药中用于治疗癫狂、中风、脑溢
血和偏瘫等神经性疾病 ［2］，现在学者认为苞叶雪莲
水提物对小鼠的免疫系统和生殖系统及整体水平
具有辐射防护作用 ［3－5］。 本试验通过确定连二硫酸
钠（Na2S2O4）对 EA．hy926 细胞造成缺氧损伤的最佳
苞叶雪莲粗提物对 EA．hy926细胞缺氧损伤的
保护作用
李海丽 1，卢永昌 2，钱 帅 1，朱奎德 1
（1．青海民族大学化学与生命科学学院，西宁 810007；2．青海省植物化学资源重点实验室，西宁 810007）
摘要：通过确定 Na2S2O4对 EA．hy926 细胞造成缺氧损伤的最佳浓度和时间点建立缺氧损伤模型，以只加
Na2S2O4为对照组，添加不同浓度的苞叶雪莲（Saussurea obvallata）粗提物，从细胞形态和细胞生存率两个
方面检测其抗缺氧作用，分析苞叶雪莲粗提物对 Na2S2O4造成 EA．hy926 细胞缺氧损伤的保护作用。 结果
表明， 苞叶雪莲粗提物从 1．25 mg ／mL浓度开始呈剂量依赖性的增加了缺氧模型组中 EA.hy926 细胞的相
对存活率，在 10 mg ／ mL 浓度下与 Na2S2O4 模型组相比，极显著增加了细胞存活率，是缺氧模型组的 6．3
倍，表明苞叶雪莲具有很强的抗缺氧损伤能力。
关键词： 苞叶雪莲（Saussurea obvallata）；EA．hy926 细胞；缺氧损伤
中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2016）01－0167－03
DOI：10．14088 ／ j．cnki．issn0439－8114．2016．01．044
Saussurea obvallata Crude Protective Effects of Hypoxia on EA．hy926 Injury
LI Hai－li1，LU Yong－chang2，QIAN Shuai1，ZHU Kui－de1
（1．College of Chemistry and Life Science， Qinghai Nationalities University，Xining 810007，China；
2．Key Laboratory of Qinghai Phytochemistry Resources，Xining 810007，China）
Abstract： The experimental model of hypoxia injury was established by determining the optimal concentration and time point
that sodium dithionite （Na2S2O4） causing EA.hy926 cell hypoxia demaged． Treating the one only adding sodium dithionite
（Na2S2O4） as the control group，add different concentrations of Saussurea obvallata crude to explore whether Saussurea obvallata
crude has protection effect from EA.hy926 cell hypoxia injury caused by sodium dithionite （Na2S2O4）． Two parameters were
used to determine the degree of EA.hy926 cell hypoxia injury，one was cell morphology and another one was cell survival
rate． The results showed that：Saussurea obvallata crude increased in a dose－dependent EA.hy926 cell survival rate in the hy-
poxia injury model from the concentration of 1．25 mg ／ mL． And there was a significant increase in EA.hy926 cell survival rate
compared with sodium dithionite （Na2S2O4） hypoxia model group， which was even more than 6.3 times than hypoxia model
group. It suggests that Saussurea obvallata has a significant anti-oxidant capability.
Key words： Saussurea obvallata； EA.hy926 cell； hypoxia injury
湖 北 农 业 科 学 2016 年
浓度和时间点建立缺氧损伤模型， 以只加 Na2S2O4
为对照组，添加不同浓度的苞叶雪莲粗提物，从细
胞形态和细胞生存率两个方面检测其抗缺氧作用，
探讨苞叶雪莲粗提物是否具有对 Na2S2O4 造成 EA．
hy926 细胞缺氧损伤的保护作用， 为进一步细分该
药中抗缺氧具体成分奠定基础和参考依据。
1 材料与方法
1．1 细胞株
EA．hy926细胞株购于中国科学院上海细胞库。
1．2 药材与试剂
苞叶雪莲粗提物：苞叶雪莲于 2013 年 8 月采
自青海省贵德县，经青海省食品药品检验所藏药室
骆桂法研究员鉴定，为菊科风毛菊属苞叶雪莲全草。
将采集的苞叶雪莲研磨成粗粉经 90％乙醇热回流
提取，提取液浓缩至流浸膏（相当于 10 g ／ mL生药），
使用时用生理盐水稀释；连二亚硫酸钠（Na2S2O4）、
三氯乙酸（TCA），国药集团化学试剂有限公司；培养
基（DMEM）、96 孔板、培养瓶，Corning 公司；胎牛血
清 （FBS）、胰蛋白酶 ［0．25％ Trypsin－EDTA （1×）］，
Gibco 公司；二甲基亚砜、磺酰罗丹明 B（SRB），Sig-
ma公司。
1．3 试验方法
1．3．1 细胞的培养 复苏 EA．hy926细胞，置于 37℃，
5％ CO2 湿度饱和的培养箱中， 用含有 100 U ／ mL
青霉素和 100 μg ／ mL链霉素的 DMEM培养基培养，
0．25％含 EDTA 的胰蛋白酶消化， 在细胞处于对数
生长期时进行试验。
1．3．2 缺氧模型的建立 将 EA．hy926 细胞 10 000～
20 000 ／孔接种于 96 孔板中，检测 Na2S2O4造成细胞
缺氧状态的最佳浓度，Na2S2O4可以很快清除缓冲液
里的氧，使溶液氧含量为零。 Na2S2O4用生理盐水配
制成 100 mmol ／ L 母液，参考文献［6－9］以终浓度 8
mmol ／ L为首浓度，2 倍稀释，共做 7个浓度，作用 24
h。 IncuCyte镜下观察细胞形态，用 SRB法计算不同
浓度的 Na2S2O4 对 EA．hy926 细胞的抑制率及半数
抑制浓度 IC50。 首先，弃去培养基，每孔加 100μL浓
度为 30％的预冷 TCA，置于 4 ℃ 1 h 固定细胞，用去
离子水洗涤 5 次后，晾干，之后每孔加入 100 μL 浓
度为 0．04 mg ／ mL 磺酰罗丹明 B（SRB，1％冰醋酸配
制）染色 15 min，染色结束后用1％冰醋酸洗涤 5
次，去除未与细胞结合的 SRB，晾干，最后每孔用 10
mmol ／ L 的 Tris－base 溶液 150 μL 溶解染料，置于摇
床上至染料完全溶解均匀后，用酶标仪在 560 nm波
长下读取 OD560nm，抑制率＝（对照组 OD560 nm －给药组
OD560nm） ／对照组 OD560 nm×100％。IC50通过四参数曲线
拟合法计算。 通过以上结果选定最佳破坏剂量和时
间，拍照记录，选定模型浓度，用以进行后续试验。
1．3．3 细胞分组及检测 检测苞叶雪莲粗提物对缺
氧状态下细胞的保护作用，将 EA．hy926细胞 10 000～
20 000 ／孔接种于 96 孔板中，细胞分为三组，阴性对
照组、缺氧模型组和加药组。 加药组加入苞叶雪莲
粗提物，以 10 mg ／ mL 为首浓度，2 倍稀释，共 8 个浓
度，粗提物用二甲基亚砜（DMSO）溶解后用生理盐
水稀释成试验所需浓度，加药后确保 DMSO终浓度＜
0．1％，加入 96 孔板中预孵育 2 h 后，加入 8 mmol ／ L
的 Na2S2O4建立细胞缺氧模型，作用 24 h。 IncuCyte
镜下观察细胞形态学变化并拍照记录。 达到最佳
破坏时间后用 SRB 法检测细胞的相对存活率，相对
存活率＝给药组或缺氧模型组 OD560 nm ／阴性对照组
OD560 nm×100％。
1．4 数据分析
试验数据以均数±标准差（x±s）表示，采用 SPSS
19．0 统计软件分析结果，组间差异采用两样本均数
比较 t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2．1 Na2S2O4对 EA．hy926细胞存活的抑制结果
在 EA．hy926 细胞中加入不同浓度 Na2S2O4 作
用 24 h 后，高浓度组细胞形态发生了明显的变化，
细胞停止增殖、细胞膜皱缩、细胞形态不规则、部分
细胞悬浮未贴壁、黑色代谢产物增加等（图 1）。与对
照组相比， 细胞的生存能力剂量依赖性的减弱，说
明 Na2S2O4 对 EA．hy926 细胞的增殖具有抑制作用，
图 1 Na2S2O4作用 24 h EA．hy926 细胞的
形态学变化
空白对照组
2 mol/L Na2S2O4 1 mol/L Na2S2O4
8 mol/L Na2S2O4 4 mol/L Na2S2O4
168
第 1 期
用 SRB法检测抑制率可以看出，当Na2S2O4浓度降到
2 mmol ／ L 以下时，对细胞无明显的抑制作用（表 1，
图 1）。根据不同浓度抑制率做四参数曲线拟合计算
出 Na2S2O4 的 IC50 为 3．021， 表 明 在 3 mmol ／ L
Na2S2O4下抑制了 50％细胞的生存能力，因此在实际
过程中选用大于 IC50的浓度 8 mmol ／ L 进行后续试
验，抑制率为 88．81％，可以更大程度地体现出苞叶
雪莲粗提物的保护作用。
2．2 苞叶雪莲粗提物对 Na2S2O4 造成细胞缺氧的
保护作用
在 EA．hy926 细胞上用 8 mmol ／ L Na2S2O4 造成
缺氧模型之后， 加入不同浓度的苞叶雪莲粗提物，
从细胞存活率和细胞形态两个方面观察其保护作
用。 苞叶雪莲粗提物 10.00 mg ／ mL浓度下可极显著
增加缺氧细胞的存活率（P＜0．01），与对照组相比的
相对存活率是缺氧模型组的 6．3 倍， 说明在该浓度
下缺氧导致的细胞凋亡和增殖抑制这些负面作用
被苞叶雪莲粗提物大部分中和，与缺氧模型组相比
具有极显著差异（表 2）。 5．00、2．50 mg ／ mL 苞叶雪莲
粗提物可以保护细胞，与缺氧模型组相比，相对存
活率增加，差异达到显著水平（P＜0．05）；当苞叶雪莲
粗提物浓度下降到 1．25 mg ／ mL以下时，保护作用不
明显。
从细胞形态学变化上观察，苞叶雪莲粗提物可
剂量依赖性地保护细胞 ，免于缺氧造成的细胞凋
亡、萎缩、增殖抑制，其中 10.00 mg ／ mL 浓度下保护
作用最为明显，细胞形态基本完整，悬浮较少，细胞
代谢产物相对减少，细胞融合率显著增加。 降低浓
度后苞叶雪莲粗提物仍可以保护细胞形态完整，这
种保护作用在 0．08 mg ／ mL 浓度下仍可从拍照图片
中观察出（图 2）。
3 小结
苞叶雪莲粗提物从 1．25 mg ／ mL 浓度开始呈剂
量依赖性地增加了缺氧模型组中 EA．hy926 细胞的
相对存活率，在 10.00 mg ／ mL浓度下与 Na2S2O4模型
组相比，极显著增加了细胞相对存活率，是缺氧模
型组的 6 倍以上，表明苞叶雪莲具有很强的抗缺氧
损伤能力。 这一结果在动物试验中已经初步得到了
表 2 苞叶雪莲粗提物对 Na2S2O4钠造成细胞缺氧的保
护作用
苞叶雪莲粗提物//mg/mL
阴性对照
缺氧模型
10.00
5.00
2.50
1.25
0.63
0.32
0.16
0.08
OD560 nm
0.698±0.141
0.364±0.125
0.350±0.145
0.214±0.088
0.117±0.039
0.113±0.023
0.103±0.020
0.091±0.019
0.110±0.020
1.116±0.051
相对存活率//%
100.00
9.90**
62.49##
32.59#
31.37#
19.19
10.49
10.11
9.27
8.11
注：** 表示与阴性对照组相比差异极显著（P＜0.01）；# 表示与缺
氧模型组相比差异显著（P＜0.05），## 表示与缺氧模型组相比差异极
显著（P＜0.01），（x±s，n=8）。
表 1 Na2S2O4对 EA.hy926 细胞存活的抑制作用
Na2S2O4 //mmol/L
对照组
8.00
4.00
2.00
1.00
OD560 nm
0.750±0.047
0.081±0.009
0.234±0.054
0.601±0.114
0.750±0.049
抑制率//%
0.00
88.81**
67.56**
16.79
0.00
注：“**”表示与空白组相比差异极显著（P＜0.01）（x±s，n=7）。
图 2 不同浓度苞叶雪莲粗提物对 EA．hy926 细胞保护的
形态学变化
空白对照组 缺氧模型组
10.00 mg/mL 苞叶雪莲 5.00 mg/mL 苞叶雪莲
2.50 mg/mL 苞叶雪莲 1.25 mg/mL 苞叶雪莲
0.63 mg/mL 苞叶雪莲 0.32 mg/mL 苞叶雪莲
0.16 mg/mL 苞叶雪莲 0.08 mg/mL 苞叶雪莲
（下转第 175页）
李海丽等：苞叶雪莲粗提物对 EA．hy926 细胞缺氧损伤的保护作用 169
第 1 期
验证，其主要作用成分值得进一步分化探讨，力求
得到抗缺氧有效的单一组分，在临床应用中明确其
成分，确定使用剂量和安全性。
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（上接第 169页）
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定化细菌的重复使用。
3．2 共固定化亚硝化－反硝化细菌培养方式的改进
由于大量的钠离子和硫酸铵会溶解海藻酸钙
外膜［14］，因此在模拟污水培养基中以氯化铵替代硫
酸铵，但由于后期加入柠檬酸钠作为碳源，钠离子
仍会对海藻酸钙外膜产生一定溶解效应，尤其在考
察重复使用次数时，发现重复使用后共固定化小球
破裂数量较多，今后可加入稳定性更好的其他载体，
如聚乙烯醇进行固定。 亚硝化细菌较反硝化细菌生
长速度慢，因此亚硝化细菌接种比例较多，有利于
缩短前期亚硝化反应时间，防止反硝化细菌由于缺
少碳源而影响其生长。 由于筛选出的反硝化细菌属
于好氧型，因此在培养后期采用增加摇床转速使共
固定化小球易于分散，有利于保证氧气的传递。 亚
硝化细菌和反硝化细菌的菌种比例、共固定化细胞
的扩大培养对脱氮效果的影响还需进一步研究。
致谢：感谢徐州工程学院食品（生物）工程学院肖杰、朱雯雯两
名同学对本试验作出的贡献。
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