全 文 ：江西农业学报 2011，23( 3) : 129 ～ 131
Acta Agriculturae Jiangxi
基于草甘膦筛选的菘蓝转化体系的建立
唐 俊1，2，张富生3，廖志华2*
收稿日期:2010 －12 －27
基金项目:国家自然科学基金( 30500303) 。
作者简介:唐俊( 1984─) ，男，江西南昌人，硕士，从事食品检测工作。* 通讯作者: 廖志华。
( 1．江西省南昌市食品质量卫生安全监督检验中心，江西 南昌 330012;
2．西南大学 生命科学学院、三峡库区生态环境教育部重点试验室，重庆 400715;
3．江西省农产品质量安全检测中心，江西 南昌 330046)
摘 要:介绍了以菘蓝草甘膦筛选的遗传转化体系，以携带植物表达载体 pASM12 的根癌农杆菌 LBA4404 对四倍体菘蓝
进行叶盘法转化，在选择培养基中加入 8 mg /L的草甘膦进行筛选，获得草甘膦抗性的再生植株，对再生植株进行 PCR检测和
草甘膦抗性试验，结果表明: PCR检测表明子叶的转化频率达 30%，下胚轴的转化频率达 40% ;对 PCR阳性植株的草甘膦抗
性试验表明，多数植株在不同程度上表现出对草甘膦的抗性。
关键词:菘蓝;根癌农杆菌;遗传转化;草甘膦
中图分类号: Q789 文献标识码: A 文章编号: 1001 －8581( 2011) 03 －0129 －03
Establishment of Transformation System of Isatis indigotica by
Using Glyphosate as Selectable Marker
TANG Jun1，2，ZHANG Fu － sheng3，LIAO Zhi － hua2*
( 1． Nanchang Testing Center of Agricultural Products Quality and Safety in Jiangxi Province，Nanchang 330012，China; 2． Key
Laboratory of Eco － environment in Three Gorges Reservoir Region，Ministry of Education，School of Life Sciences，Southwest Univer-
sity，Chongqing 400715，China; 3． Jiangxi Provincial Testing Center of Agricultural Products Quality and Safety，Nanchang 330046，
China)
Abstract: The transformation system of Isatis indigotica by using Glyphosate as the selectable marker was established in this stud-
y． Tetraploid Isatis indigotica was transformed via Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 carrying the plasmid pASM12． The trans-
genic explants were directly selected on the media containing 8 mg /L Glyphosate，and the transgenic Glyphosate － resistant plantlets
were confirmed by genomic PCR techniques and Glyphosate resistance test． PCR analysis showed the transformation frequency of the
cotyledons of Isatis indigotica was 30%，and that of hypocotyles was 40% ． The results of Glyphosate resistance test indicated that most
of the transgenic plantlets could resist to Glyphosate at different levels．
Key words: Isatis indigotica; Agrobacterium tumefaciens; Genetic transformation; Glyphosate
菘蓝( Isatis indigotica Fort． ) 为十字花科大青叶属，
是板蓝根、大青叶药材及其制剂的主要来源，具有清热解
毒、凉血消斑的功效，临床上用量极大，在我国各地种植
广泛［1］。人工同源四倍体菘蓝的体外抗内毒素、抗病毒
作用显著强于二倍体亲本，是高产、优质的新品种，具有
很好的开发和利用价值［2］。然而传统的遗传育种方法
周期长且存在诸多局限性，而应用基因工程技术培育优
良品质的菘蓝新品系，既是发展药用植物的新思路，也是
使蓬勃发展的生物技术付诸实际应用的直接手段。
目前，遗传转化的筛选标记主要是一些抗生素抗性
基因，利用这些筛选标记成本高，且在转化试验完成后抗
生素抗性基因成为了无用的基因甚至是有害的基因，因
此开发高效、安全的转化方法和筛选标记，用于菘蓝的转
基因操作是一项具有实际意义和应用前景的研究。
草甘膦是一种高效、低毒的内吸性广谱除草剂。草
甘膦的作用机理是竞争性抑制莽草酸途径中的 5 －烯醇
丙酮酸莽草酸 － 3 －磷酸合酶( 5 － enolpyruvyl － shiki －
mate －3 － phosphate synthase，EPSPS) ，阻断植物体内的
芳香族氨基酸的合成［3］，从而使植物致死。本试验利用
基因优化技术( Gene Shuffling) 获得的高效抗草甘膦突
变基因 aroA －M12［4］作为筛选标记，建立了菘蓝草甘膦
筛选的遗传转化体系，同时获得了抗草甘膦的转基因
菘蓝。
1 材料与方法
1． 1 植物材料和工程菌 本试验所用四倍体菘蓝种子
由第二军医大学张磊博士惠赠;所用工程菌为根癌农杆
菌为 LBA4404;携带高效抗草甘膦突变基因 aroA － M12
的植物表达载体 pASM12( 图 1) ，由中山大学王和勇博士
惠赠。该表达载体中 aroA －M12是通过基因优化技术获
得的高效抗草甘膦突变基因，ASP是一段 240 bp 的拟南
芥 EPSPS叶绿体转运肽编码序列［5］。
1． 2 无菌外植体的获得 取四倍体菘蓝种子在 75%乙
醇中浸泡 45 s，无菌水冲洗数次，0． 1%HgCl2 溶液浸泡 8
min，再用无菌水冲洗 3 ～ 5 次对种子表面消毒。将消毒
处理后的种子在无菌操作条件下播种到 MS空白培养基
上，置于 3000 lx下每天光照 12 h，在 25 ℃条件下发芽。
大约 2周后，种子发芽长出实生苗。将实生苗的子叶切
成 1 cm ×1 cm的叶盘，下胚轴剪成 1 cm长的小段作为
外植体供转化之用［6］。
图 1 植物表达载体 pASM12示意图
1． 3 工程菌的活化 取 －70 ℃甘油保藏的菌种 100 μL
接种于 5 mL培养基( YEB + Rif 40 mg /L + Kan 50 mg /L
+ Str 20 mg /L) 中培养至 A600 nm =1． 0左右;再从中吸取 1
mL菌液加至 50 mL培养基中，培养至 A600 nm = 0． 3 时，加
入乙酰丁香酮 ( Acetosyringone，AS ) 至终浓度为 100
μmol /L;继续培养至菌液 A600 nm = 0． 6。常温离心收集菌
体，等体积 MS液体培养基重悬菌体并加入 AS至终浓度
为 100 μmol /L，即可用于转化。
1． 4 叶盘法转化 外植体首先置于预培养培养基 M1
( MS + BA 2 mg /L + NAA 0． 5 mg /L) 在 3000 lx下每天光
照 12 h，在 25 ℃条件下预培养 2 d。用无菌钢针在外植
体上扎出少许伤口，在活化的工程菌中浸染 8 min，无菌
滤纸吸去外植体上的菌液;置于共培养培养基 M2 ( MS +
AS 100 μmol /L) 中，在 25 ℃的暗箱中共培养 2 d;共培养
后，用无菌水冲洗 3 次，再用无菌滤纸吸干，接种于筛选
培养基 M3［MS + BA 2 mg /L + NAA 0． 5 mg /L +羧苄青
霉素( Carbenicillin，Cb) 300 mg /L +草甘膦 8 mg /L］，在
3000 lx下每天光照 12 h，在 25 ℃下培养。每 3周继代 1
次，以未转化的外植体作为对照。待转化苗长至高约 2
cm时从外植体上分离，转到空白 MS培养基上生根。
1． 5 转基因植株的 PCR检测 采用 SDS 小量 DNA抽
提法［7］从叶片中提取总 DNA。取 50 ng总 DNA，以 aroA
－ M12 特异性引物 P1 : － 5 CATGCCATGGAATCCCT-
GACGTTCAA3 － ; P2 : － 5 CGCGGATCCTTAGCAGGC-
TACTCATTC3 －。在 50 μL 的反应体系中，分别按 94
℃、5 min，94 ℃、45 s，54 ℃、45 s，72 ℃、90 s，循环 30次;
72 ℃、10 min的程序下进行 PCR扩增，以质粒 DNA作阳
性对照，非转化植株 DNA作阴性对照，1%琼脂糖凝胶电
泳检测 PCR产物。
1． 6 转基因菘蓝的草甘膦耐受试验 将 PCR检测为阳
性的转基因植株洗净培养基后移栽到装有灭菌泥土的花
盆中，保鲜袋套袋后置于阴凉处，1 周后摘去保鲜袋。移
栽成活后，选取各转基因株系展开 7 d 以上的叶从叶柄
基部切下，将叶柄浸泡于不同浓度的草甘膦水溶液中，草
甘膦的浓度设置为 0、10、20、30、40、50、60、70、80 mg /L，
并以非转基因植株的叶作为对照。置于光照 3000 lx 下
每天光照 12 h，在温度为 25 ℃的培养箱中培养，2 周后
观察叶片的受损程度。
2 结果与分析
2． 1 转化体的筛选与再生 在筛选培养基 M3 上对共
培养后的菘蓝外植体进行筛选，草甘膦的浓度要足以抑
制非转化细胞的生长，但不能影响转化细胞的生长和分
化。本试验选择了非转化的菘蓝外植体( 30 个 /处理) ，
在含有不同浓度草甘膦的分化培养基 M4 ( MS + BA 2
mg /L + NAA 0． 5 mg /L) 上培养，优选能抑制非转化细胞
生长的最佳草甘膦浓度。试验结果发现:在草甘膦浓度
达到 8 mg /L时，外植体生长停止，不能分化再生，由此可
知，此浓度为最佳草甘膦筛选压。在筛选培养基 M3 上，
非转化外植体和转化外植体的生长结果见图 2。
A:未转化外植体，B:转化外植体
图 2 外植体在筛选培养基上的生长情况
2． 2 PCR检测结果 对转化植株的 PCR检测结果见图
3，aroA －M12基因扩增的片段应为 1284 bp。PCR 检测
结果表明:质粒 DNA作阳性对照能得到预期的条带，阴
性对照则没有任何条带。在检测的 60株转化株中，来自
下胚轴的转化株有 12株呈阳性，来自子叶的转化株有 9
株呈阳性，这说明以下胚轴作为转化受体的转化效率高
于子叶，下胚轴的转化率达 40%，而子叶的转化率只
有 30%。
1: Takara DL2000; 2:阳性对照; 3:阴性对照; 4 ～9:各转基因植株
图 3 转基因植株的 PCR检测结果
2． 3 转基因菘蓝的草甘膦耐受性 为了检测转基因菘
蓝的抗草甘膦能力，证明草甘膦筛选体系的高效性，取各
独立转基因株系的叶片进行草甘膦耐受性试验。结果表
明:对照组在草甘膦浓度达 20 mg /L时开始枯黄，转基因
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组则能耐受 40 mg /L的草甘膦浓度，个别的耐受浓度达
80 mg /L，大多数转基因株系能耐受的草甘膦浓度达 60
mg /L。
3 小结与讨论
本试验探索了新型的菘蓝农杆菌转化筛选方法，并
且建立了一套完整的转化筛选体系。通过预试验和多组
对比试验研究发现:下胚轴的转化率比子叶高 10%，因
而更适宜作为遗传转化的受体;预培养时间过长，外植体
出现变大且转化效率下降，时间过短则没有达到预培养
的效果。通过 1、2、3 d的共培养时间梯度表明:共培养 2
d为最佳培养时间，共培养时间过长则后期无法除菌，最
终导致外植体变黄和腐烂。
植物基因工程在农作物的育种改良中已经得到了
广泛的应用，科学工作者培育出许多品质优良的转基因
作物并得以推广。然而在药用植物的育种过程中，基因
工程的应用却相对滞后，因此发展药用植物的基因工程
是一个培育优良品质药用植物的新方向。农杆菌介导的
转化是植物基因工程的一个重要方法。
目前农杆菌介导的转化研究中主要是使用抗生素
抗性基因作为筛选标记，这种方法一直备受质疑，人们担
心携带这类基因的转基因作物可能将其抗性基因转移到
环境或肠道微生物中，进而导致抗生素耐受性的广泛传
播。要将基因工程应用于药用植物育种，研究高效、安全
的筛选方法同样是一个需要解决的问题。草甘膦是一种
广谱除草剂，它能在土壤中迅速降解、对人畜无毒，是一
种理想的筛选剂。以抗草甘膦基因作为选择标记，将草
甘膦作为筛选剂应用于基因工程，可以摆脱抗生素筛选
的诸多弊端，为植物基因工程提供一种安全、经济的筛选
方法。笔者建立了菘蓝的草甘膦筛选体系，为菘蓝的基
因工程育种打下了坚实的基础。
参考文献:
［1］中国医学科学院药物研究所．中药志( 2 版) ［M］． 北京: 人民
卫生出版社，1993．
［2］王寅，乔传卓，刘盛．四倍体菘蓝体外抗内毒素，抗病毒作用评
价［J］．中国中药杂志，2000，25( 6) : 327 ～329．
［3］Mousdale D M，Coggins J R． Purification and properties of 5 －
enolpyruvylshikimate 3 － phosphate synthase from seedlings of Pi-
sum sativum L［J］． Planta，1984，160( 1) : 78 ～83．
［4］He M，Yang Z Y，Nie Y F，et al． A new type of class I bacterial 5
－ enopyruvylshikimate －3 － phosphate synthase mutants with en-
hanced tolerance to glyphosate［J］． Biochim Biophys Acta，2001，
1568( 1) : 1 ～6．
［5］王和勇．草甘膦降解酶基因为标记基因的植物转化技术平台
的创建［D］．广州:中山大学，2004．
［6］张磊，许铁峰，谭秋敏，等．四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅰ:根癌
农杆菌介导的转基因菘蓝［J］． 中草药，2003，34 ( 3 ) : 258
～261．
［7］Edwards K，Johmstone C，Thompson C． A simple and rapid method
for the preparation of plant genomic DNA for PCR analyses［J］．
Nucl Acids Res，1991，19( 6) :
櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗櫗
1349．
(上接第 128页)
胞被破坏后，酶和苷才能相遇，进而把苷水解。如幼高
粱中蜀黍苷分布于表皮细胞的胞液中，而 β －葡萄糖苷
酶则集中于叶肉细胞，只有当组织被粉碎后该苷才能被
水解［13］。因此，作者认为黄蜀葵花采收后，由于细胞被
破坏，金丝桃苷与 β －半乳糖苷酶相遇，继而被水解，如
果不及时干燥，金丝桃苷含量便会迅速下降。从实验中
我们也发现，β － Gal在55 ℃时活性最高，60 ℃时热稳定
性较好，因此，在干燥过程中应迅速升高温度至 70 ℃，但
不能超过此温度，温度过高，药材虽然干燥速度快，但容
易烘焦、变色，影响药材外观质量。
参考文献:
［1］国家卫生部药典委员会．中华人民共和国药典( 一部) ［M］．北
京:中国医药科技出版社，2010: 287．
［2］范丽，董六一，江勤，等．黄蜀葵花总黄酮抗炎解热作用［J］．安
徽医科大学学报，2003，38( 1) : 25 ～27．
［3］王先荣，王兆全，李颖．黄蜀葵的化学成分研究［J］．植物学报，
1981，23( 3) : 222 ～227．
［4］范丽，董六一，陈志武，等．黄蜀葵花总黄酮镇痛作用研究［J］．
中药药理与临床，2003，19( 1) : 12 ～14．
［5］陈志武，郭岩．黄蜀葵总黄酮对全脑缺血损伤的保护作用［J］．
中国药理学通报，2002，18( 6) : 692 ～694．
［6］尹莲芳，刘璐．中药黄蜀葵花对肾病大鼠尿中透明质酸的影响
［J］．新中医，2000，32( 9) : 32 ～33．
［7］刘志辉，冯淑琴，李国荣．不同采收时间及干燥方法对黄蜀葵
花总黄酮含量的影响［J］．南京中医药大学学报，1999，15( 3) :
157 ～158．
［8］施特尔马赫．酶的测定方法［M］．北京:轻工业出版社，1992:
148 ～150．
［9］张丹．人参皂苷 β －葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学特性
［J］．应用与环境生物学报，2003，9( 3) : 259 ～262．
［10］BradfordMM． A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein
－ dye binding［J］． Anal Biochem，1976，72: 248．
［11］Ranwala AP，Suematsu C，Masuda H． The role of β － galactosi-
dase in the modification of cell wall components during musk-
melon fruit ripening［J］． Plant Physiol，1992，100: 1318 ～1325．
［12］秦燕，宁正祥，胡新宇．固定化 β －半乳糖苷酶催化生成低聚
半乳糖［J］．食品与发酵工业，2001，27( 11) : 12 ～16．
［13］吴立军，吴继洲．天然药物化学［M］．北京: 人民卫生出版社，
2007: 83 ～84．
1313 期 唐俊等:基于草甘膦筛选的菘蓝转化体系的建立