全 文 ：第28卷　第 6期 西 南 师 范 大 学 学 报(自然科学版) 2003年 12月
Vol.28　No.6 Journal of Southwest China Normal University (Natural Science) Dec. 2003
文章编号:1000 5471(2003)06 0987 04
4种抗生素对菘蓝外植体生长的影响①
曾建军1 , 2 , 　孙　敏1 , 　肖　璇1 , 　江　波1
1.西南师范大学 生命科学学院 , 重庆 400715;2.井冈山师范学院 生命科学系 , 江西 吉安 343009
摘要:对抗生素卡拉霉素和潮霉素进行菘蓝外植体抗性浓度筛选 , 结果表明不同外植体具有不同抗性.子叶芽分
化阶段 , 卡拉霉素和潮霉素筛选浓度范围分别为 10～ 50 mg/L和 5 ～ 30 mg/ L;下胚轴芽分化阶段的筛选浓度分别为
15 ～ 50 mg/ L和 10～ 30 mg/ L;分化苗生根时筛选浓度分别为 30 mg/ L和 20 mg/L.芽分化阶段宜使用头孢霉素为抗
菌剂 , 但分化苗生根时宜选用羧苄青霉素.
关　键　词:菘蓝;卡拉霉素;潮霉素;头孢霉素;羧苄青霉素;抗性浓度
中图分类号:Q94 文献标识码:A
十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort)的根为板蓝根 , 叶为大青叶 , 两者均有清热解毒 、凉血消斑 、抗
菌消炎等功效.临床上用途较广 , 常与其它中药组成复方广泛用于治疗多种疾病如流感 、腮腺炎 、乙脑 、肝
炎 , 是公认的有较好抗病毒效果的少数中药之一.大青叶的有效成分靛玉红还对治疗慢性粒细胞白血病有
较好作用 , 是一种有重要开发前景的药用植物[ 1] .目的基因与载体组合导入植物 DNA中创造新的植物类
型 , 作为一种有效的基因转化手段 , 为作物育种开辟了新的途径.然而菘蓝转基因工作起步较晚 , 仅见利
用发根农杆菌转化植物产生毛状根建立离体培养系统的报道[ 2] .本文通过研究卡拉霉素(Km)、潮霉素
(Hm)、头孢霉素(Cef)和羧苄青霉素(Cb)4种抗生素对菘蓝外植体生长的影响 , 确定了抗生素最佳筛选浓度
和最佳除菌剂 , 旨在为菘蓝遗传转化体系的建立和转基因工作奠定基础.
1　材料和方法
1.1　植物材料
四倍体菘蓝(由复旦大学陈敏博士惠赠).
1.2　培养基[ 3]
芽诱导培养基:子叶:①MS+2mg/L 6-BA+1 mg/L NAA;②MS+2mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA.下胚轴:
①MS+2mg/L KT+0.2 mg/L NAA;②MS+2 mg/L KT+0.1 mg/L NAA.生根培养基:MS+1mg/L NAA.
用于抗生素实验实验时 , 在相应的培养基中加入不同种类和浓度的抗生素.在不含抗生素的培养基
上 , 子叶和下胚轴芽诱导频率为 90%, 分化苗生根率为 100%.
1.3　筛选剂抗性浓度筛选
1.3.1　芽分化的影响
种子清水冲洗后 , 用浓度 70%乙醇浸泡 30 s , 0.1%升汞消毒 10 min , 无菌水冲洗3 ～ 5次置于 MS培养
基27 ℃黑暗条件萌发 , 3 d后转入光照培养室 .幼苗生长条件为 25 ℃、每天16 h光照 , 照度1 800 lx.1周
后切取子叶(0.5 cm×0.5 cm)及下胚轴中上部 0.7 cm长的小段作为外植体.每个处理 5瓶 , 每瓶 6个外植
体 , 重复 3次.将子叶和下胚轴分别置于含Km和 Hm浓度为 0 ,5 ,10 ,15 , 20 , 30 ,50 mg/L 的培养基上 , 从对
照组萌动开始 , 每隔 5 d记录芽分化与生长情况.
① 收稿日期:2003 06 03
作者简介:曾建军(1973-), 女 , 江西井冈山人 , 硕士 , 主要从事药用植物方面的研究.
通讯作者:孙　敏 , 教授.
DOI :10.13718/j.cnki.xsxb.2003.06.036
1.3.2　生　　根
将芽诱导培养基上分化的 2 cm高的小苗分别移至含Km和Hm 浓度为0 ,10 ,20 ,30 ,50 mg/L的生根培养
基上 , 每个处理接种 20株 , 30 d后观察记录生根情况.
1.4　外植体生长
把子叶 、下胚轴 、分化小苗分别接种到附加Cef和 Cb(500 mg/L)的芽诱导和生根培养基上 , 每个处理
接种 20个外植体.从对照组萌动开始观察 、记录生长情况.
2　结　　果
2.1　Km与 Hm对子叶芽分化的影响
2.1.1　Km 对子叶芽分化的影响
接种后 30 d内不同浓度 Km 对子叶分化芽及苗生长影响见表 1 , 对芽分化率的影响见图 1.从图 1可
见 , Km 10mg/L时已明显影响子叶芽分化 , 当浓度到15 mg/L时严重抑制芽的分化 , 30mg/L 时已完全不能
分化出芽 , 外植体逐渐死亡.
2.1.2　Hm对子叶芽分化的影响
Hm 对芽分化的影响趋势与Km 一致 , 结果见图1和表2.结果表明 , Hm 5mg/L对子叶芽的分化有较大
影响 , 10 mg/L明显抑制芽的分化 , 20 mg/L时子叶已完全不能分化.
表 1　Km不同浓度对子叶芽分化的影响
Table 1　Effect of Kanamycin on Shoot Regeneration from Catyledon
时间
/ d
处　　　　　　理
对　　照 5 mg/ L 10mg/L 15 mg/ L 20 mg/L 30 mg/ L
8 覆满小绿点 分化出绿点 分化出绿点 边缘多褐化 , 少数分化绿点 少数黄绿点 褐　化
13 浓绿小苗高 0.5 cm 绿色瘤状物 绿白相间芽 无明显变化 白色芽点
18 绿苗高 0.5～ 1 cm 1/ 3芽漂白 , 黄绿小苗 绿白相间芽 少数白点 少数白点
30 苗高 1～ 2 cm 绿白相间芽 , 高 1 cm黄绿苗 多为白芽少黄绿芽 少数白点 少数白点
图 1　Km 和Hm对子叶芽分化率的影响(30 d)
Fig.1　Effect of Km and Hm on
Cotyledon Shoot Frequency
图2　Km和 Hm对下胚轴芽分化率的影响(30 d)
Fig.2　Effect of Km and Hm on
Hypocotyl Shoot Frequency
2.2　Km和 Hm对下胚轴芽分化的影响
2.2.1　Km 对下胚轴芽分化的影响
不同浓度Km对下胚轴芽的分化率和生长的影响分别见图 2及表 3.由图 2和表 3可见 , 随 Km 浓度的
增高下胚轴芽分化率逐渐降低 , 15 mg/L 严重影响芽的分化 , 30 mg/L已无分化.
2.2.2　Hm对下胚轴芽分化的影响
不同浓度Hm 对下胚轴芽的分化和生长的影响分别见图 2及表 4.由图 2和表 4可见 , 10 mg/L 时对芽
的分化有较大的影响 , Hm 20 mg/L已完全抑制下胚轴芽的分化.
2.3　Cef和 Cb对子叶和下胚轴苗分化和生长的影响
Cef和 Cb对子叶和下胚轴苗分化和生长的影响见表 5.从表 5可见 , 对子叶分化苗而言 , Cef促进分化
苗的生长 , 而 Cb却抑制分化苗的分化和生长;对下胚轴来说 , Cef虽对苗高无明显影响但分化的苗数不如
对照多;Cb不利分化苗的生长.
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表 2　Hm不同浓度对子叶芽分化的影响
Table 2　Effect of Hygrimycin on Shoot Regeneration from Cotyledon
时　间
/ d
处　　　　　　理
对　　照 5 mg/L 10 mg/ L 15 mg/ L 20 mg/L
8 覆满小绿点 分化出绿点 分化出黄绿点 少数黄绿点 全褐化
13 高 0.5 cm 左右浓绿小苗 绿白相间芽丛 黄 绿 点 白色芽点
18 绿苗高 0.5 ～ 1 cm 分化黄绿小苗 芽点多被漂白 白色芽点
30 绿苗高 1 ～ 2 cm 高 1 cm 黄绿芽 多为白化芽 , 极少黄绿点
表 3　Km浓度对下胚轴芽分化的影响
Table 3　Effect of Kanamycin on Shoot Regeneration from Hypocotyl
时间
/d
处　　　　　　理
对　　照 5 mg/ L 10 mg/L 15 mg/ L 20 mg/L 30 mg/ L
6 分化出绿点 分化出绿点 两端有小绿点 半数褐化少数白色小点 半数褐化少数 褐化末端膨大
11 绿苗高 0.5 ～ 1 cm 绿苗高 0.2 ～ 0.5 cm 绿苗高<0.5 cm 严重褐化少数末端膨大 少数白色小点
16
分化丛生苗平均
高 1 cm
两端分化多株苗 , 均
高 0.5 cm 出现白化苗 苗高0.5 cm 褐　　化
褐化加重少数
白点
30
茂盛浓绿丛生苗
均高 2 cm 浓绿小苗 , 极少白化苗 绿白相间苗 无 变 化
表 4　Hm对下胚轴芽的分化和生长的影
Table 4　Effect of Hygrimycin on Shoot Regeneration and Growth from Cotyledon
时间
/ d
处　　　　　　理
对　　照 5 mg/L　　 10 mg/ L　　 15 mg/L　　 20 mg/L
6 分化绿点 分化出绿点 两端黄绿点 少数黄绿点 全褐化
11 高 0.5 ～ 1 cm 绿苗 小苗叶黄 部分弱小苗出现白化苗 大多褐化白色芽点
16 分化丛生苗均高 1 cm 黄绿色苗出现白化苗 半数白化苗
30 茂盛浓绿丛生苗均高2 cm 黄绿色苗少数白化苗 黄白相间苗
表 5　Cef和 Cb对子叶和下胚轴分化苗株高的影响
Table 5　Effect of Cef and Cb on Height of Regeneration Seedling from Cotyledon and Hypocotyol cm
时间
/ d
处　　　　　　　　理
对　　　照
子　叶 下胚轴
Cef(500 mg/L)
子　叶 下胚轴
Cb(500 mg/ L)
子　叶 下胚轴
10 0.2 ～ 0.5 0.5～ 1 0.2～ 0.5 0.5 ～ 1 绿色芽瘤无分化 0.5
20 0.5 ～ 1 1.5 >1 <1.5 0.5 1
30 1 ～ 2 2 >2 2 1(分化数少于对照) 1.5
2.4　分化苗生根的影响
2.4.1　Km 和Hm对分化苗生根的影响
在0 ,10 ,20 ,30 ,50 mg/L 不同 Km浓度下苗高分别为 6 cm ,4 ～ 5 cm ,3 ～ 4 cm(部分枯萎卷缩), 2 cm(枯萎
卷缩), 小于 2 cm(枯黄卷缩 , 基部漂白).根据浓度升高越来越细 , 侧根越来越少 , 到 30 mg/L时已不再有
不定根发生.在 0 ,10 ,20 ,30 ,50 mg/L不同 Hm浓度培养基上苗高分别为 6 cm ,3 ～ 4 cm ,2 cm(半数枯萎), 小
于2 cm(枯萎), 小于 2 cm(枯萎), 到 20 mg/L时不再有不定根发生.
2.4.2　Cef及 Cb对分化苗生根的影响
在含 Cef及 Cb的生根培养基上均能正常诱导生根 , 但在较含 Cb 的培养基上根更粗壮 , 分枝更多.因
此宜选用 Cb作为分化苗阶段的抗菌剂.
3　讨　　论
选择合适的筛选剂及抗菌素种类和浓度是利用农杆菌介导转化法进行植物转基因研究获得较高再生频率
的一个重要前提.植物材料的不同 , 不同的筛选剂及抗菌素对其生长和作用的浓度不同.从本实验结果可以看
989第 6期　　　　　　　　 　曾建军 , 等:4种抗生素对菘蓝外植体生长的影响
出Km 30 mg/L时完全可以抑制菘蓝子叶和下胚轴芽的分化.然而 , 我们在以农杆菌介导转化菘蓝子叶和下胚
轴在含Km 30mg/L的培养基上连续培养30 d后 , 发现培养初期已被漂白的芽到后期在周围重新分化出绿色芽
点并长成正常苗 , 但重新转接到 30 mg/L的Km培养基中多数枯萎 、漂白.原因可能一是外植体只能吸收其周
围的物质[ 4] , 当培养时间过长外植体周围抗生素被吸收利用浓度下降 , 筛选作用逐渐丧失;二是在预培养 2 d
后生长活跃部分已开始萌动 , 而它们对抗生素的反应更迟钝.因此在农杆菌介导的遗传转化时宜及时更换培
养基以及适当提高筛选浓度以防未转化芽逃逸选择.实验证明 Km 50 mg/L 和Hm 30 mg/L 对菘蓝子叶和下胚
轴为有效筛选浓度 , 在转化实验中从影响浓度开始逐步筛选可提高转化率[ 5] .
在农杆菌介导的植物转基因研究中 , 常用适宜浓度的头孢霉素和羧苄青霉素抑制农杆菌的生长及繁殖以
达到除菌目的.徐淑平等[ 6]报道头孢霉素对青菜下胚轴和子叶的芽的分化有强烈的抑制作用 , 羧苄青霉素则
促进.我们在四倍体菘蓝的下胚轴和子叶诱导不定芽培养中发现头孢霉素(500 mg/L)在一定程度上促进子叶
芽分化 , 对下胚轴芽分化影响不大 , 而羧苄青霉素明显抑制子叶和下胚轴芽分化 , 但诱导生根时羧苄青霉素优
于头孢霉素.因而在转化不同阶段宜使用不同的抗菌素.我们在菘蓝子叶和下胚轴组织培养时发现 , 当NAA
浓度相对过高外植体易生根.子叶培养时NAA降至0.2 mg/L , 下胚轴培养时NAA降至 0.1 mg/L 既可获得高
再生率又可防止不定根发生 , 这与傅翔等[ 3]结果一致.
4　结　　论
同一作物不同外植体抗性浓度不同 , 同一外植体不同抗生素抗性浓度不同.子叶芽分化 , 下胚轴芽分化
及分化苗生根时Hm的筛选浓度分别是 30 mg/L ,30 mg/L ,20 mg/L;Km的筛选浓度分别为 50 mg/L ,50 mg/L ,
30 mg/L.芽分化阶段应使用 Cef作为抗菌剂 , 但分化苗生根时宜选用Cb.
参考文献:
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18(2):97-99.
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2002 , 28(4):253-260.
The Effects of Four Antibiotics On the
Explants Growth of Isatis indigotica Fort
ZENG Jian-jun1 , 2 , 　SUN　Min2 , 　XIAO　Xuan2 , 　Jiang　Bo2
1.School of Life Science , Southwest China Normal University , Chongqing 400715 , China;
2.Department of Biology , Jing Gang Moutain Normal College , Jian Jiangxi 343009 , China
Abstract:Through screening concentration of kanamycin and hygrimycin from culturing explants of Isatis indigotica Fort ,
the result showed that resistance concentration is different from different explant.In the stage of shoot regeneration from
cotyledon , kanamycin is 10-50 mg/L , hygrimycin is 5-30 mg/L.In the stage of shoot regeneration from hypocotyls ,
kanamycin is 15-50 mg/L , hygrimycin is 10-30mg/L.When plantlet grow in root medium , kanamycin is 30 mg/L ,
hygrimycin is 20 mg/L.In different stages of shoot or root regeneration , the best antibacterial agent is cefotaxime an or
carbenicillin respectively.
Key words:Isatis indigotica Fort;kanamycin;hygrimycin;cefotaxime;carbenicillin;resistance concentration
责任编辑　胡　杨　　　　
990 西南师范大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　第 28卷