全 文 ：[3 ]　 Yao SN, W ils on JM , Nabel EG, et al . Expression of human
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th erapy for h em ophi lia B[ J] . Proc Nat l Acad Sci USA, 1991,
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[4 ]　Wang JM, Zh eng H, Yuich i S, et al. Cons truction of human
factor Ⅸ ex pres sion vectors in ret rovi ral vector f rames op ti-
mized fo r m uscle cel ls [ J ]. Human Gene Th erapy, 1996, 7
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[5 ]　 Ku rachi S, Ht tomi Y, Furukaw a M, et al . Role of int ron I in
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[6 ]　 Yao SN, Smitsh KJ, Kurachi K. Primary myoblast-mediated
gene t rans fer: persis tent ex pres sion of human factorⅨ in mice
[ J ]. Gene Th er, 1994, 1( 2): 99-107.
【收稿日期】　 1999-09-11　　 【修回日期】　 1999-12-02
【本文编辑】　张寓景
·经验交流·
【文章编号】　 0258-879X ( 2000) 01-0033-02
菘蓝组织培养物中靛蓝、靛玉红含量的变化
傅　翔 2 ,张汉明 1 ,丁如贤 1
⒇
　 十字花科植物菘蓝 ( Isatis indigotica Fo r t. )是我国南北
各地广为栽培的一种药用植物 ,是常用中药板蓝根和大青叶
的主要来源。 板蓝根和大青叶两者都有清热解毒、凉血消斑
的功效 ,已知靛蓝和靛玉红是其中的重要活性成分。 对菘蓝
组织培养快速繁殖的研究已有报道 [1, 2 ]。 本研究用高效液相
色谱法 ( HPLC)测定了菘蓝在组织培养过程中靛蓝、靛玉红
含量的变化 ,并讨论芽器官分化、试管增殖次数、光暗培养条
件对靛蓝、靛玉红含量的影响。
1　材料和方法
1. 1　样品的获得　 ( 1)由无菌条件下萌发的菘蓝四倍体实
生苗叶为外植体 ,诱导愈伤及继代培养基 ( M S+ 2. 4- D
0. 5 mg /L+ BA 1. 0 mg /L ) ,每 20 d继代 1次 ; 愈伤组织继
代 3次后转入芽诱导分化培养基 ( M S+ BA 2 mg / L+ N AA
1 mg /L ) ,直至诱导出芽。 在整个脱分化和再分化过程中每
10 d随机取 1批培养物待测。将四倍体菘蓝叶分化的芽切
割后反复转接至芽诱导分化培养基 ( BA 2 mg /L+ N AA
0. 2 mg /L ) ,按照芽分化芽的方式 ,腋芽不断形成又不断萌
发形成丛生苗。每 10 d将芽簇分割转接 1次 ,每转接 1次随
机切下 1批分化的试管苗叶待测。 ( 3)以四倍体菘蓝实生苗
子叶为外植体 ,以 M S+ BA 2 mg / L+ N AA 0. 2 mg / L和
M S+ BA 3 mg /L+ NAA 0. 2 mg /L为芽诱导分化培养基 ,
分光 ( 2 000 lx , 12 h /d)暗两种环境下生长 , 4周后得到光暗
条件下菘蓝子叶的分化苗 ,取两种分化苗叶待测。 每一实验
过程均重复 3次 ,结果取 3次平均值。
1. 2　样品的处理　取各种样品 , 60℃干燥 24 h ,研细过 60
目筛 ,置于 500 ml圆底烧瓶中 ,加入 250 ml氯仿 , 80℃提取
8 h。回收氯仿至小体积 ,转入 10 ml容量瓶 ,氯仿加至刻度 ,
置冰箱中保存。靛蓝、靛玉红对照品分别加氯仿溶解成
0. 1 mg /ml的溶液。
1. 3　仪器及色谱分析条件　岛津 LC-9A高效液相仪 ,岛津
C-R4A色谱数据处理机 , 岛津 SPD-6AV紫外可见检测器。
甲醇和氯仿为分析纯 ,水为两次重蒸馏的去离子水。 色谱柱
为 Shim-Pack CLC-ODS不锈钢柱 150 mm× 6. 0 mm ,填料
粒径 5μm, 室温 ,检测波长为 292 nm,流动相为甲醇∶水=
80∶ 20,测定方法为外标法。
2　结果和讨论
2. 1　芽器官分化对靛蓝、靛玉红含量的影响　菘蓝叶脱分
化成愈伤组织和再分化成芽过程中靛蓝和靛玉红含量测定
结果见表 1。从表 1中可见 ,在此过程中靛蓝、靛玉红都有一
个含量逐渐降低 ,直至检测不出 ,然后又逐渐升高的过程 ,刚
好与叶的脱分化形成愈伤组织、并再分化成芽的过程相一
致 ,表明菘蓝中靛蓝、靛玉红前体的产生可能与芽的分化有
联系。
表 1　菘蓝叶组织培养过程中靛蓝、靛玉红含量变化
培养的时间 含量 ( wB /μg· mg
- 1)
靛蓝 靛玉红
0 2. 45 1. 67
10 2. 23 1. 71
20a 0. 14 0. 74
30 0. 32 0. 28
40a 0. 15 …
50 … …
60a … …
70 … …
80 … …
90b … …
100 … …
110 0. 24 0. 19
120 0. 37 0. 24
130 0. 32 0. 91
140 1. 54 1. 06
　　 a: 每 20 d次代培养 1次 ; b: 第 90天时转至差向培养介质中
(下转第 37页 )
·33·第 1期 . 王雪松 ,等 . 重组人Ⅸ 因子逆转录病毒载体在肌细胞中的表达
⒇ 【作者单位】　 1. 第二军医大学药学院生药学教研室 ,上海
200433; 2. 南京军区福州总医院药剂科 ,福州 350025
【作者简介】　傅　翔 ( 1972～ ) ,男 (汉族 ) ,硕士 ,药师
图 5　 huPTMAαRNA二级结构分析
Fig 5　 Analysis of huPTMAαRNA secondary structure
A: Th e huPTM AαRN A secondary s t ructure f rom GenBank; B: The h uPTMAαRNA secondary st ructure f rom ou r laboratory
【参 考 文献】
[1 ]　 Esch en feldt W H, Berg er SL. Th e human p ro thym osinαgene
is polymorphic and induced upon grow th stimulat ion: evidence
using a cloned cDN A[ J ]. Proc Natl Acad Sci U SA, 1986, 83
( 24): 9403-9407.
[2 ]　 Watts JD, Cary PD, Sau tiere P, et al . Th ymosins: both nuclear
and cytoplasmic proteins [ J ]. Eur J Bioch em , 1990, 192 ( 3 ):
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[3 ]　 Evs tafieva AG, Chich kov a NV , Mak arova TN, et a l. Ov er-
prod uct ion in Escherichia coli , pu ri fication and propert ies of
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[4 ]　 Guo BY, Zhang SY, M ukaida N, et al . CCR5 gene exp ression
in fulminant h epati ti s and DTH in mice [J ]. Wo rld J Gas troen-
terol , 1998, 4( 1): 14-17.
[5 ]　郭葆玉主编 . 细胞分子生物学实验操作指南 [M ] . 上海:第二
军医大学出版社 , 1998. 74-80.
[6 ]　 Wetzel R, Heyneker HL, Goeddel DV , et al . Prod uction of
biologically activ e Nα-desacetyl th y m osin a1 in Escherich ia col i
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ch emis t ry, 1980, 19( 26): 6096-6104.
【收稿日期】　 1999-08-17　　 【修回日期】　 1999-12-27
【本文编辑】　姚春芳
(上接第 33页 )
2. 2　试管增殖次数对靛蓝、靛玉红含量的影响　结果显示 ,
分化苗不断由芽生芽的方式继代时 ,靛蓝、靛玉红的含量整体
继续保持稳定。分化苗转接 1, 3, 5, 9次后 ,叶中靛蓝的含量分
别为 2. 55, 2. 62, 2. 46, 2. 54 μg /mg;靛玉红含量分别为
1. 64, 1. 59, 1. 54, 1. 48μg /mg。 从一个方面体现由芽繁殖芽
的方式能保持植物遗传性状的稳定 ,这是由于分生组织的特
殊结构的稳定性所保证的 ,用作快速繁殖的手段 ,不会导致品
种的退化。这在金线莲 [3 ] ,石蒜 [4] ,地黄 ,半夏 [5 ]等多种药用植
物的无性快速繁殖实验中也可看到。
2. 3　光暗培养条件对靛蓝、靛玉红含量的影响　光亮培养条
件下所得菘蓝分化苗叶中靛蓝、靛玉红的含量分别为 2. 72,
1. 64μg /mg ,黑暗培养条件下所得菘蓝分化苗叶中靛蓝、靛
玉红含量分别为 0. 67, 0. 48μg /mg。可见在两种培养条件下 ,
分化苗叶中靛蓝、靛玉红的含量存在着非常显著的差异 ,黑暗
条件下靛蓝、靛玉红含量极低。此外 ,光暗条件下的两种菘蓝
分化苗在形态、颜色上均有较大差别。对此 ,我们将另文报道。
光对培养植物或组织器官生长、发育、代谢有重要作用 ,光强
度、光谱成分和每天曝光时间长短均与此紧密相关。曾有文献
报道不同色光对石刁柏试管苗的物质积累及佛甲草离体茎段
形态发生及生长发育有显著影响。 本研究结果与上述报道有
相似之处 ,提示不同色光可能因调控不同吸收系统 ,改变培养
物内源激素水平及调控不同物质的吸收和排泄来调节培养物
的生长及次生产物代谢 ,但光在调控关键生化机制中的作用
和对特殊结构发育的影响仍有待深入研究。
【关键词】　菘蓝 ;靛蓝 ;靛玉红
【中图分类号】　 R 282. 71　　　　【文献标识码】　 B
【参 考 文 献】
[1 ]　苟克俭 .菘蓝子房离体培养成苗 [ J] .中草药 , 1992, 23( 8): 436.
[ 2 ]　傅　翔 ,张汉明 ,丁如贤 ,等 . 激素对菘蓝器官分化的影响 [ J ].
中草药 , 1997, 28( 10): 618-620.
[3 ]　王建勤 ,林兰英 ,陈　钢 . 组培金线莲与野生金线莲酯酶同工酶
比较研究 [ J ]. 福建中医药 , 1995, 26( 1): 41-42.
[4 ]　高增平 ,江佩芬 ,何　斌 . 野生石蒜与其组织培养品的化学成分
对比研究 [ J ]. 北京中医药大学学报 , 1995, ( 3) 60-61.
[ 5 ]　西冈五夫 . 药用植物的离体快速繁殖 [ J ]. 组织培养 , 1985, 11
( 9): 16-19.
【收稿日期】　 1999-08-01　　 【修回日期】　 1999-12-19
【本文编辑】　姚春芳
·37·第 1期 . 郭葆玉 ,等 . 克隆人胸腺素α原 ( HuPTM Aα) cDN A及 RNA二级结构分析和带 Xa因子的融合表达