全 文 ：第 31 卷第 4 期
2 0 0 8年 7 月
河 北 农 业 大 学 学 报
J O UN A L R F A GO I C R ULT A L U RN I UE R VI ST YOF H E B E I
Vo l
.
3 1 N o
.
4
J
u !
.
2 0 0 8
文章编号 : 1 00 0一 1 5 7 3 (2 0 0 8) 04 一 6 4 0 0一 4 0
根腐菌毒素对落蓝试管苗有丝分裂行为的影响
陈玉芹 ’ , 聂姬锋 2 , 客绍英` , 陈桂平
( 1
. 唐山师范学院 , 河北 唐山 0 6 3 0 0 0 ; 2 . 唐山职业技术学 院 , 河北 唐山 0 6 3 0 0 0 )
摘要 : 以窄叶祛蓝试管苗无性系为材料 , 采用常规压 片技术及核 型分析 , 研究了根腐菌毒素对细胞有丝分裂的
影响 。 结果表 明 : 在组织培养获得的植株中出现 了四倍体细胞 , 在根腐毒素胁迫 的无性 植株中 , 除 四倍体植 株
外 , 还有三体 、 四体等非整倍体细胞 。 此外 , 毒素胁迫还 引起染色体断折 、染色体桥等结构变异 , 对细胞分裂 亦有
一定的抑制作用 。
关 键 词 : 秘 蓝 ; 根腐菌毒素 ; 体细胞无性系 ; 核型分析
中图分类号 : 5 5 6 7 . 2 3 ` 9 文献标识码 : A
E f fe c t o f t o x i n i n r o o t r o t d i s e a s e P a t h o g e n o n
m i t o t i c sI a t i s i n d igo t i
e a P l a n t l e t s
e 日三N 丫u 一q in l , N IE J i一 f e n g Z , K三 s h a o 一 y in g , , e 日三N G u i一 p in g l
( 1
.
T a n g s h
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,
T a n g s h
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,
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2
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a n P or fes i
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,
T a n g s h a n 06 300 0
,
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)
A b s t r a e t : T h e e f f e e t o f t o x i n i n r o t r o t d i s e a s e p a t h o g e n o n m i t o s is i n I s a t i s i n d i别 t i e a p la n t l e t s
w a s s t u d ie d b y t h e r o u t in e e h r o m o os m
e s 一 s q u a s h i n g t e e h n o lo g y a n d k a r y o t y p e a n a l y s is m e t h o d
.
T h e
r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r e a r e t e t r a P lo i d e e ll i n t h e t is s u e e u lt u r e p l a n t s
,
i n t h e p la n t s s t r e s s e d b y t o x
-
in t h e r e a r e t r i s o m ie a n d t e t r a so m i e s b e s i d e s t e t r a p lo i d e e l l
.
F u r t h e r
, s t r e s s b y t o x i n a r i s e e h r o m o
-
so m e s s t r u e t u r e v a r i a n e e s u e h a s e h r o m o so m e s b r e a k i n g a n d e h r o m o s o m e s b r i d g e e t a l
, a t t h e s a m e
t im e t h e
r e 15 so m e in h i b i t i o n o n e e l l d iv i s io n
.
K e y w o r d s : I s a t i s i n d i即 z ic a ; t o x i n o f r o t r o t d i s e a s e p a t h o g e n ; s o m a t i e s e lo n e s : k a r y o t y p e a n a l y s is
秘蓝 ( I s a t i s i n己i即 t i c a )别名大靛 , 为十字 花科
落蓝属 2 年生草本植物 , 以根 、 叶供药用 。 其根药材
商品名称为 “ 板蓝根 ” , 叶为 “ 大青叶 ” , 具清热解毒 、
凉血止血 、 消斑的功效川 。 国内外对落蓝品种资源
进行 了较为完整的形态学和生物学特性等方面的研
究 ,并在落蓝二倍体植株染 色体核型分析方面取得
了一定成果 〔2 一 ’ 〕 。 而秘蓝 的主要病害— 根腐病是制约秘蓝产量的主要因素 ,也是迄今秘蓝在栽培过
程中尚未解决的难题之一 。 利用根腐菌毒胁迫离体
选择秘蓝抗根腐病新类型 , 为藕蓝抗根腐病育种提
供 了新途径 。
1 材料与方法
1
.
1 材料
供试材料 为秘蓝体细胞无性系植株 , 由唐山师
范学院中草药重点实验室项 目组提供 。
1
.
2 方法
采用 M ot i c B 型数码显微摄影仪进行显微摄影 。
1
.
2
.
1 体细胞无性 系的获得及试验材料的 选取
选取饱满 的种 子 , 清 水 冲洗 后 , 用 7 0 % 乙 醇浸 泡
收稿 日期 : 2 00 7 一 0 9 一 1 2
基金项 目 : 唐山市科技局资助项 目 ( 0 6 2 3 4 5 0 1A 一 9)
作者简介 : 陈玉芹 ( 19 53 一 ) , 女 , 河北 唐山人 , 教授 , 主要从事药用植物 的遗传育种研究
第 4 期 陈玉芹等 : 根腐菌毒素对荻蓝试管苗有丝分裂行为的影响
l m in
,
0
.
1% 升汞消毒 s m in ,无菌水冲洗 3 一 5 次 ,
置于加人 3 % 蔗糖和 0 . 8 % 琼脂 的 M S 培养基 中 ,
p H 5
.
8
, 培养 温度 2 3 一 2 5℃ , 光 照 强度 1 5 0 0 一
2 0O0 lx
,光照时间 10 hZd ,种子萌发后 ,选取生长良
好的幼苗转人 1/ 2 M S 培养基中继代 , 采用丛生芽增
殖途径进行继代 , 每 lZ d 继代 1 次 , 共继代 4 次 ,再
转人壮苗培养基 , 20 d 后 ,分 为 2 组 ,一组转人生根
培养基作为对照组材料 , 一组转人加人根腐病病菌
毒素 ( 10 , 抱子 /m L 毒素 )的生根培养基 中生长 , 待
根尖长至 1 . 0 一 1 . 5 。 m 时 ,分别切取根尖备用 。
1
.
2
.
2 根尖的 处理与制 片 分别选取试验组和对
照组中生长健壮 的组 培苗根 尖 , 置 于冰箱 中 固定
2 0 h
。常规压 片法制 片 , 用孚尔根染 色方法进行染
色 [’] 。 镜检观察时 , 选择 染色体分散好 的 2 0 张片
子 ,随机统计 5 个视野中的染色体 。
1
.
2
.
3 染色体参数的计算方 法 核型分析按李悬
学 ! ’ ]报道的标准 ,染 色体分类根据 L ve an A 〔 6〕等命
名法 ,染色体相对长度指数按李悬学和郭幸荣 〔7 〕的
方法 ,通常采用 Lve an 闹 的公式计算 : 染色体相对长
度 = (染色体长度 /染色体组总长度 ) x 10 0 % ,染色
体相对长度系数 ( I . R . L ) , 即 : I . R . L 二 染色体长度 /
全体染色体 的平均长度 ; 核型分类按 tS e b in s[ “ 〕的
标准 。
2 结果与分析
2
.
1
.
1 窄叶荻蓝二倍体细胞核型分析 图 1 一 a 是
正常二倍体秘蓝体细胞染色体的照片 , 染色体数 目
为 Z n 二 14 ; 图 1 一 b 是按染色体相对长度和着丝点
位置从大到小排出的蓓蓝二倍体细胞核型图 , 其 中
第 5 对染色体为具随体染色体 。
图 1 窄叶落蓝二倍体细胞染色体及细胞核型图
F ig
.
l T h e P ie t u er o f e h r o 川n卿m ed e e l ls an d k a r y o t y ep
in t h e n a or w l
e a f I
s a it s i月 d止go t ica d iP o id e e l ls
对核型图 (图 1 一 b) 和核型参数 (表 1) 分析表
明 : 二倍体窄叶秘蓝的核型公式为 : Z n = 14 二 10 m 十
Zm ( s A T ) + Z s m
, 染色体组总长度为 2 7 . 9 8 拜m , 平
均长度为 2 . 0 林m ,其中 8 条染色体为中短染色体 ,
6 条为 中长染色体 ; 相对长度 变化 范围为 12 . 20 一
1 6
.
6 7
,最 长染 色体与最 短 染 色 体相 对 长 度 比为
1
.
39 ;平均长短臂 比为 1 . 4 ;无臂 比 > 2 的染色体 ;
核型分类为 I A ;第 5 对染色体为具随体染色体 。
表 1 窄叶箱蓝二倍体染色体长度 、臂比和类型
T a b le 1 C h r o m os om
e l e n g t h
、
ar m
r a t i o an d e las i if ca t i
o n i n t h e s o m a t i e e lo n es o f n ar or w le a f sI
a t is in d igo t i ca
染色体编号 染色体长度 (长臂 十 短臂 ) /拌m 相对长度 /%
C hor m os m
e N o
.
C hor m os m
e le n g t h R e la t iv e le n g t h
相对长度
系数 l . R . L
臂比
A r n l ar t io
类型
T y p es
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月咔QZ7气é42内、à3门j.…` .二jl,1. ..曰J00` .1户只ù了ù、é,二nù00户O了八ē拭.….1`卫人lǎ102 . 3 7 = 1
.
52 + 0
.
8 5
2
.
1 7 = 1
.
3 1 + 0
.
8 6
2
.
0 3 = 1
.
2 1 + 0
.
8 1
1
.
98 = 1
.
0 9 + 0
.
89
1
.
9 6 = 1
.
12 + 0
.
8 4
1
.
7 7 = 1
.
0 3 + 0
.
7 4
1
.
7 1 = 0
.
9 7 + 0
.
7 4
1 6
.
67
1 5
.
5 4
1 4
.
5 0
1 4
.
15
1 4
.
0 2
1 2
.
6 7
1 2
.
2 0
,且门乙八j泥峙
一勺了07
注 : . 为具随体染色体 , 随体 的长度不计算在内 ,下 同
2
.
1
.
2 无性 系植株细胞核 型分析 随着继代时间
的增加 ,窄叶秘蓝丛生芽增殖继代后染色体数 目发
生了整倍体变异 , 产生了 四倍体细胞 (图 2 一 a ) , 但
未发现具随体染色体 ; 图 2 一 b 是按染色体的相对长
度和着丝点 的位置从大到小排出的 四倍体细胞核
型图 。
图 2 窄叶藕蓝体细胞无性系染色体及
无性 系核型图 《Z n = 4 x 二 2 8)
F ig
.
2 T he P i e t
u er o f e h or m胎om e an d k a口 o ty eP in t h e
s o m a t ie e lo n e s o r n a or w l
e a r saz it
s i n d j即 t ie (Z n 二 4 x = 2 8 )
河 北 农 业 大 学 学 报 第 1 3卷
表 2窄叶藕蓝体细胞无性系染色体长度 、臂比和类型
Ta b le 2T eh c h
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染色体编号 染色体长度 (长臂 + 短臂 ) /拜m 相对长度 / %
C h
rom o s
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.
C hr o m o o sm e le n g th R e la tiv e le n g th
相对长度
系数 I . R . L
臂比
A
r m r a tio
类型
T y P e s
m M
ú、ùO声,了11. .4月」7月J`1..1工fà ,二Q
t…7ùOùIà4内、ù,一“j.1ōJl.` 111 2 . 1 9 = 1 . 2 9 + 0
.
90
2 2
.
0 1 = 1
.
2 1 + 0
.
90
3 1
.
8 7 = 1
.
0 3 + 0
.
84
4 1
.
7 4 = 0
.
9 7 + 0
.
7 7
5 1
.
6 6 = 0
.
9 0 + 0
.
76
6 1
.
5 0 = 0
.
7 5 + 0
.
7 5
7 1
.
3 5 = 0
.
7 5 + 0
.
6 0
1
.
2 4 1
.
4 4
1
.
15 1
.
28
1
.
0 6 1
.
22
0
.
99 1
.
26
0
.
9 5 1
.
1 7
0
.
8 5 1
.
0 0
0
.
7 7 1
.
2 5
对核型图和核型参数 (表 2) 分析表 明 : 无性系
窄叶落蓝四倍体细胞的核型公式为 : Z n = 4 x 二 28 =
24 m 十 4 m
,染色体组总长度为 24 . 6 4 拌m , 平均长度
为 1 . 7 6 拌m ,其中 16 条染色体为中短染色体 , 12 条
为 中长 染 色 体 ; 相 对 长 度 变 化 范 围 为 10 . 93 一
17
.
7 5
,最 长染 色体 与 最 短 染色 体相 对长 度 比为
1
.
6 2 ;平均臂 比为 1 . 2 ;3 无臂 比 > 2 的染色体 ; 核型
分类为 I A 。
2
.
1
.
3 无性 系植株 (加根腐病病菌毒素 ) 细胞核型
分析 图 3 一 a 是根腐病菌处理的秘蓝体细胞无性
系染色体照片 。 由于根腐病毒素的胁迫 , 染色体数
目发生了变异 ,出现 了三体 、 四体和点状染色体 ; 图
3 一 b 是按染色体 的相对长度和着丝点 的位置从大
到小排出的落蓝加根腐病病菌后的染色体核型图 。
点状染色体
图 3 窄叶箱蓝体细胞无性 系《加根腐病病菌毒紊 )染色体及无性系核型 图
F ig
.
3 T h e p i e t u比 o f e h
omr ~
e an d k a口 o ty eP in th e ~
a t i c c l加es o f n ar o w
l e a f saI
t is in d ig
o t i ca 《in t e r fus i雌 to x i n o f or t r o t d ise ase p a th呢 e n }
对核型和核型参数 (表 3) 分析表明 : 细胞 中染
色体数 目为 2 , 染色体组总长度为 34 . 75 拼m ,平均
长度为 1 . 58 拼m , 其中 1条为短染色体 , 12 条为中短
染色体 , 9 条为中长染色体 ; 相对长度变化范 围为
2
.
2 6 一 1 1 . 7 4 ,最长染色体与最短染色体相对长度比
为 2 . ;6 平均长短臂 比为 1 . 3 ;9 臂 比值大于 2 . 0 的
染色体所 占比例 为 0 . 045 , 按 S t eb b in s 核 型对称程
度分类属于 I B 型 ,第 8 对染色体为具随体染色体 。
对加有根腐病病菌 的体细胞无性系的核型分
析 ,选用的是无性系中植株健壮 ,根尖生长情况 良好
的株系 , 经大量制片后 , 选择 30 个细胞进行 了细致
观察 ,最后选择了 5 个染色体数 目最为清楚 ,分散 良
好的中期细胞进行 了核型分析 , 其核型分析并不能
完全代表整个窄叶秘蓝无性系 (加根腐病病菌 )的核
型 , 只说明了窄叶秘蓝感染根腐病后植株的染 色体
发生变异情况 。
表 3 窄叶藕蓝体细胞无性系 《加根腐病
病菌毒素 )染色体长度 、 臂比和类型
T a b一e 3 T h e e h or m伽 m e le gn th/ amr r a t io a n d c las i f i ca t i o n
i n t he so m
a t ie c lo n es o f n a r r o w le a f 血 a t is in d igo t i ca
( i
n t e r fu s i n g t o x in o f or
t or t d ise ase p
a t h昭e n 】
染色体编号
C h
r o n l o so m e N o
.
染色体长度
(长臂 + 短臂 ) /拜m
Ch or mo so m
e le n g t h
臂比
A r n
l r a t i o
类型
T y P e s
2
.
0 4 二 1
.
2 1 + 0
.
8 3
1
.
8 8 = 1
.
09 + 0
.
7 9
1
.
6 7 = 1
.
0 3 + 0
.
7 0
1
.
6 7 = 0
.
8 9 + 0
.
7 8
1
.
5 8 = 0
.
9 1 + 0
.
60
1
.
5 5 = 0
.
8 6 + 0
,
6 9
1
.
4 7 二 0
.
86 + 0
.
6 1
1
.
4 0 = 0
.
9 1 + 0
.
4 9
1
.
2 6 = 0
.
7 5 + 0
.
5 1
0
.
7 8
1
.
4 5
1
.
3 7
1
.
4 8
1
.
1 2
1
.
6 4
1
.
2 6
1
.
4 2
1
.
8 6
1 4 6
n 1
1 1 1
】1 1
1 1 1
:
m弧T
第 4期 陈玉芹等 : 根腐菌毒素对藕蓝试管苗有丝分裂行为的影响
2
.
2 体细胞无性 系根腐病菌毒素胁迫后及培养基
种类对染色体倍性的影响
表 4可以看出 , 体细胞无性系和加根腐病病菌
毒素的体细胞无性系植株的染色体平均臂比值较正
常二倍体的有所降低 , 而最长和最短染色体的 比值
有增加 的趋势 ,加根腐病病菌毒素的体细胞无性 系
的染色体平均相对长度较未加的和正常二倍体的明
显缩短 ;三者核型类 型分别为 “ 1A’ ,核型 、 “ 1A’ ,核 型
和 “ 1B’ ,核型 。
表 4 二倍体 、 体细胞无性系 、 体细胞无性系
(加根腐病病菌奋紊 )的核型 比较
T a b l e 4 T h e com P
a r iOS n o f k a r y o t y pe am
o
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ce l lsl so m a t i
e e lon es a n d s o m a t ie c lo nes
t代 a t de w i th r 0 0 t 比 t ot x in
核型类型 平均臂 比值 最长染色体长度 / 平均相对长度
K i n d s o f A v e r昭 e 最短染色体长度 aA v e雌 e
akr ort
y p e amr ar
t i o L o吃 es t/ s ho r t e s t r e la t ive l e n g t h
为激素浓度越高 , 正常细胞数 目越少 , 变异频率越
高 〔” J 。 一般来讲 , 组培的增殖率越高 , 植物激素在
植物体内的积累量也相对较多 , 产生无性系变异 的
机率也就越大 。 所 以 , 植物组织培养中的体细胞无
性系变异是组培过程中不同因素综合作用的结果 。
本试验中 ,正常二倍体落蓝经组织培养后 ,再生植株
中同样存在一定的变异 ,随着继代培养时间的增加 ,
染色体数 目的变异幅度也从 Z n 二 14 增加 到 Z n =
13 一 2 8 。 根腐菌毒素对落蓝试管苗生长及有丝分裂
行为有一定的影响 , 对细胞分裂有延迟或抑制的作
用 。
本研究所得结果验证 了前人认为组织培养可以
诱导和提高体细胞无性系变异 的观点 , 通过对抗根
腐病植株的选择 , 为利用组织培养进行药用植物落
蓝的种质资源创新提供了理论依据 。
1
.
4 4
1
.
2 3
1
.
3 9
14
.
2 5
14
.
2 9
10
.
0 0
n,乙曰丹j6
分析结果表明 , 未加病菌毒素的体细胞无性系
落蓝植株和加根腐病病菌毒素的体细胞无性系落蓝
植株中 ,都有一定 比例的细胞发生了染色体数 目的
变异 , 出现了四倍体细胞及三体 、 四体等非整倍体细
胞 , 由于试验材料均为正常的二倍体 ,说明变异来 自
组织诱导和继代培养阶段 。 特别是加根腐病病菌毒
素的体细胞无性系落蓝植株 中 , 这可能是 由于根腐
菌毒素对细胞的伤害 、 胁迫 ,从而导致 D N A 复制和
染色体分裂错误 9[] 。 除染色体数 目变异外还有染色
体断折 、染色体桥等结构变异 。
3 结论与讨论
培养的细胞及再生植株中 , 可观察到多种染色
体结构的变化 。 如染色体桥 、 随体缺失 、 染色体粘连
和交叉等 。 向凤宁 〔’ 0 〕等在玉米组织培养过程 中发
现 ,随着培养时间的延长 ,愈伤组织中出现多种染色
体结构变异 ,分析认为这种变异源于培养时的理化
条件 ,并且这些结构变异有可能导致非整倍体细胞
的形成 。 本试验中所见到的染色体结构变异 , 如随
体缺失 、点状染色体等 ,可能也是这种原因所致 , 也
可能是在压片时操作不 当所致 , 要明确落蓝体细胞
无性系中染色体结构 的变异规律 , 尚需进一步深人
研究 。 植物组织培养过程中 , 激素继代培养时间是
组织培养 中引起染色体变异 的重要原因 , 张谦等认
参考文献 :
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AB
盛.且,二`
(编挥 : 宗淑萍 )