全 文 ：[ 收稿日期] 2008-01-05
[ 基金项目] 山东省中医管理局资助;山东省中医药科技项目
(编号:2003-60)
[ 作者简介] 曹芳(1974-), 女 ,山东新泰人 ,医学硕士 ,主治医
师 ,主要从事肿瘤疾病的基础及临床研究。
·实验研究·
漏芦抽提剂对人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADR的耐药逆转作用研究
曹　芳 ,李秀荣
(山东中医药大学附属医院 ,山东 济南 250011)
　　[ 摘要] 目的:研究漏芦抽提剂逆转肿瘤耐药的作用。方法:用漏芦抽提剂及其含药血清处理人乳腺癌耐药细胞株(MCF-
7/ ADR), 以 MT T 法测定漏芦抽提剂及其含药血清对 MCF-7/ ADR细胞系的耐药逆转作用。结果:漏芦抽提剂对 MCF-7/
ADR细胞系具有很强的细胞毒作用 , 与 ADM 合用培养 96 h 细胞死亡率平均为 ADM 组的 1.63 倍 , 与耐药逆转剂维拉帕米
(VRP)相比(ADM +VRP组为 ADM 的 1.78 倍), 无显著性差异(P >0.05)。漏芦抽提剂含药血清(大剂量)和 ADM 合用
时 ,培养 96 h 细胞死亡率平均为 ADM 的 1.70倍 , 这一结果与耐药逆转剂维拉帕米作用结果相似。结论:漏芦抽提剂在逆转
肿瘤多药耐药方面可能具有良好的应用前景。
[ 关键词] 漏芦抽提剂;乳腺癌耐药细胞株;多药耐药性
[ 中图分类号] R285.5　　　[ 文献标识码] A　　　[ 文章编号] 0257-358X(2009)06-0415-03
　　针对肿瘤患者正虚邪实的病机特点 ,我科采用具
有扶正攻毒功效的中药漏芦为主组方治疗乳腺癌等
实体瘤取得了显著疗效。为深入研究和探讨漏芦的
抑瘤和减毒增效内在机制 , 本研究进行了漏芦
(RHU)抽提剂及其含药血清逆转肿瘤多药耐药的实
验研究 ,为拓展漏芦的临床应用范围提供科学依据 。
1　实验材料
1.1　细胞系　人乳腺癌细胞耐阿霉素株 MCF-7/
ADR和敏感细胞株 MCF-7 ,购自山东省医学科学
院基础所 。
1.2　药物　RH U 抽提剂的制备:山东中医药大学
附属医院中药制剂室提取 ,应用根粉碎乙醇提取法 ,
浓缩得粗提物 , 控制乙醇含漏芦生药量分别为
4 g/ml、2 g/ml 、0.5 g/ml三种梯度浓度的浸膏 ,4 ℃
冰箱储存备用。青霉素:华美生物工程公司生产 ,
2.0 g/瓶;链霉素:山东鲁抗医药股份有限公司生产。
1.3　主要试剂 　DMEM 培养基(DMEM/HIGH
G LUCOSE), HEPES 10 g B.M 分 ,胰蛋白酶 1∶
250 10 g GOBCP 分 ,均购自伯安生命技术有限公
司。噻唑兰(MT T), 二甲基亚砜(DMSO), 均为
Sigma公司(美国)产品。盐酸维拉帕米注射液:
5 mg/2 m l ,批号 980625 ,江苏连云港制药厂生产 。
盐酸阿霉素:10 mg/支 ,批号 010707 ,浙江海正药业
股份有限公司生产。
1.4　主要仪器设备　流式细胞仪 FACScan 型 美
国 BECTON DICKINSON 公司 。酶联免疫检测
仪:美国 550BIO-RAD M odel产品 。
2　实验方法
2.1　动物含药血清制备　取健康雄性昆明种大白
鼠 ,体质量在 200 ～ 240 g 之间 ,随机分成空白血清
组(对照组)6 只 ,低 、中 、高三个剂量组各 6 只。三
个剂量组设置为 0.5 g/ml 、2 g/ml 、4 g/ml。每天灌
药 1次 ,4 ml/d灌胃。空白组每日给予等量生理盐
水灌胃 ,与给药第 7 天 ,灌药后 1 h(灌药前禁食
12 h)乙醚麻醉 ,腹主动脉无菌采血 ,每鼠大约可采
血 6 ～ 8 ml , 置 无 菌 离 心 管 离 心 10 min
(1 500 r/min),无菌分离血清。用 0.22 μm 微孔滤
膜过滤除菌 , 分装入小瓶 , 每小瓶 5 ～ 10 ml , 置
-20 ℃冰箱保存备用 。
2.2　细胞培养　人乳腺癌细胞系 MCF-7 、MCF-7/
ADR培养参照刘文哲等介绍的方法[ 1] ,细胞传代参
照韩锐主编《抗癌药物研究与实验技术》[ 2] 。取对数
生长期 MCF-7 、MCF-7/ADR 细胞 , 加入适量
0.25%胰蛋白酶液消化 , PBS 液洗涤 2次 ,离心 ,吸
弃上清液 ,用 DMEM 培养液(含 10%胎牛血清 ,青 、
链霉素各 100 u/ml)配制成 2×105/ml 细胞悬液 ,
用于实验。
2.3　对体外乳腺癌耐药细胞及敏感细胞的细胞毒
作用　MTT 法:参照詹茂程等[ 3] 及李大成等[ 4] 的
方法并加以改进。取已经配成 2×105/ml细胞悬液
的人乳腺癌 MCF-7 、MCF-7/ADR细胞 , 100 μl/孔
(每孔细胞数为 2 ×104)接种于 96 孔平底培养板
中 ,最左方 8孔仅加入 DMEM 液 ,余则加细胞和含
药血清或药物。
2.4　实验分组　共分 96/4=24组 ,每组四个复孔。
1 ～ 2组为空白对照组 ,内加 DMEM 200 μl;3 ～ 4组
为细胞对照组加入MCF/7ADR细胞 100 μl及胎牛
血清 、DMSO 共 200 μl;5 组为正常鼠血清对照组;
6 ～ 8组分别为低 、中 、高剂量 RHU 鼠血清组;9组
为高剂量 RHU 鼠血清+ADM(5 mg/L)组;10 ～ 12
·415·山东中医杂志 2009年 6月第 28卷第 6期
组分 别为 低 (5 mg/ml)、中(10 mg/ml)、高
(20 mg/ml)剂量 RHU 组;13组为中剂量 RHU +
ADM(5 mg/ml)组;14组 ADM 组 5 mg/ml;15 组
VRP (7 mg/ml)+ ADM 组;16 组 VRP 组
(7 mg/ml);17 ～ 24组为 MCF-7 细胞系列实验组:
17组空白细胞对照组;18 组正常鼠血清对照组;
19 ～ 21组分别为低 、中 、高剂量 RHU 鼠血清组;22
组为高剂量 RHU 鼠血清+ADM(5 mg/ l)组;23组
ADM(5 mg/ml)组;24组 VRP(7 mg/ml)+ADM
5 mg/ml组。
空白组只加 DMSO ,作为调零孔组。各组接种
细胞后置于37 ℃、饱和湿度含 5%CO 2的 CO2 细胞
培养箱中无菌培养 24 h ,细胞生长旺盛贴壁后 ,小
心吸弃培养液 ,换成各种分组实验用药 ,以上实验共
加样 4板 ,加药后分别继续培养 24 、48 、72 、96 h ,培
养结束前 4 h ,每孔再加入 5 mg/ml的 MT T 20 μl
培养 4 h ,小心吸弃各孔中上清液 ,加入二甲基亚砜
(DMSO)200 μl ,混匀静置 5 min ,用酶标仪检测各
孔OD550吸光值 ,按以下公式计算乳腺癌细胞在各
实验条件 、不同培养时间细胞存活率 、死亡率及耐药
逆转倍数 ,结果如表 1 、表 2 、表 3 。
先后在不同时期进行两次实验 ,最终统计采用
平均值。
细胞死亡率=(1 - 实验组 OD550平均值空白对照组 OD550平均值)
×100%
耐药逆转倍数=
逆转剂加抗癌药物组细胞死亡率
抗癌药物组细胞死亡率
3　结果
表 1　RHU抽提剂含药血清对MCF-7 细胞系的
细胞毒作用
死亡率(%)
24 h 48 h 72 h 96 h
正常大鼠血清组 0 0 0 0
低剂量含药血清组 13.2 13.8 22.8 17.8
中剂量含药血清组 14.6 14.5 26.7 15.9
高剂量含药血清组 13.5 16.8 25.8 16.9
高剂量含药血清+ADM 组 74.0 72.1 81.5 78.6
ADM 组 84.0 65.3 83.1 75.8
ADM +VRP 组 83.0 65.1 79.4 73.1
　　表 1 结果显示 , RHU 各剂量含药血清组均对
MCF-7细胞(人乳腺癌敏感细胞)具有较轻的细胞
毒性 , 且与剂量 、作用时间无明显相关性(P >
0.05),单纯 ADM 组以及 ADM +VRP 组 、ADM +
RHU 含药血清组均具有显著细胞毒性 ,三组比较 ,
无显著性差异(P >0.05)。
　　表 2　RHU抽提剂含药血清对 MCF-7/ ADR 细胞系的耐药逆转作用
24 h
死亡率% 逆转倍数
48 h
死亡率% 逆转倍数
72 h
死亡率% 逆转倍数
96 h
死亡率% 逆转倍数
正常大鼠血清组
低剂量含药血清组
中剂量含药血清组
高剂量含药血清组
高剂量含药血清+ADM 组
ADM 组
ADM+VRP组
0
11
10.3
12.8
48.9
26.5
52.2
1.83
1.97
0
17.6
12.5
28.2
67
42.6
67.4
1.57
1.58
0
21.9
17.4
18.5
63.8
36
64
1.77
1.78
0
17.4
15.6
24.5
55
32.4
57.8
1.70
1.78
　　表 2结果显示 , RHU 各剂量含药血清组对人
乳腺癌耐药细胞株(MCF-7/ADR细胞系)具有较轻
的杀伤作用。综合表 1 结果表明 , RHU 各剂量含
药血清组对 MCF-7细胞 、MCF-7/ADR细胞系均具
有较轻的细胞毒作用 , 二者无显著性差异(P >
0.05)。当 RHU 抽提剂含药血清(大剂量)和 ADM
合用时 ,可显著提高 ADM 对 MCF-7/ADR细胞的
杀伤作用 ,细胞死亡率 96 h 平均为 ADM 的 1.70
倍 ,这一结果与耐药逆转剂维拉帕米作用结果相似
(ADM +VRP 组为 ADM 的 1.78倍)。表明 RHU
抽提剂含药血清与 ADM 合用 ,可明显增强 ADM
对乳腺癌耐药细胞株的杀伤作用 ,具有明显耐药逆
转作用。
表 3结果显示 , RHU 抽提剂直接加入细胞培
养液中 ,具有较强杀伤人乳腺癌耐药细胞株作用 ,而
且与剂量 、作用时间具有显著相关性 , 其中中剂量
RHU 抽提剂作用 48 h对人乳腺癌耐药细胞株增殖
抑制作用最强 ,与 ADM 合用逆转耐药作用与耐药
逆转剂 VRP 相比 ,无显著性差异(P >0.05)。
4　讨论
MT T 法通过对存活细胞和死亡细胞的计数 ,
可反映细胞所处的能量代谢状态 ,间接分析细胞的
增殖情况 ,目前已广泛应用于抗癌药物的筛选及抗
癌药物药敏实验 。上述实验结果显示:①RHU 含
药血清对肿瘤细胞具有轻微的细胞毒作用 ,与用药
剂量无明显相关性 ,当 RHU 抽提剂含药血清(大剂
·416· 山东中医杂志 2009年 6月第 28卷第 6期
　　表 3　RHU抽提剂对 MCF-7/ ADR 细胞系的细胞毒作用和耐药逆转作用
24 h
死亡率% 逆转倍数
48 h
死亡率% 逆转倍数
72 h
死亡率% 逆转倍数
96 h
死亡率% 逆转倍数
阴性对照组
低剂量 RHU 组
中剂量 RHU 组
高剂量 RHU 组
中剂量 RHU+ADM 组
ADM 组
ADM+VRP组
0
11.7
30
36.5
50.5
26.5
52.2
1.91
1.97
0
23.3
50.5
52.8
58.6
42.6
67.4
1.38
1.58
0
24.8
56.8
62.6
56.3
36
64
1.56
1.78
0
19
40
44.1
52.7
32.4
57.8
1.63
1.78
量)与 ADM 合用时 ,可显著提高 ADM 对耐药细胞
株的杀伤作用 ,培养 96 h 细胞死亡率平均为 ADM
组的 1.70倍 ,这一结果与耐药逆转剂维拉帕米的作
用结果相似(ADM+VRP 组为 ADM 的 1.78倍)。
表明 RHU 抽提剂含药血清与 ADM 合用 ,可明显
增强 ADM 对乳腺癌耐药细胞株的杀伤作用 ,具有明
显的耐药逆转作用。 ②RHU 抽提剂直接加入细胞
培养液中具有较强杀伤人乳腺癌耐药细胞株作用 ,而
且与剂量及作用时间具有明显相关性 ,其中中剂量作
用48 h 对 MCF-7/ADR 抑制作用最强。 RHU 与
ADM 合用可显著增加 ADM 对耐药细胞的增殖抑制
作用 ,耐药逆转倍数为 1.64 ,这一结果与 VRP 的疗
效相似 ,RH U抽提剂具耐药逆转作用 。
[参考文献]
[ 1] 刘文哲 ,李金瀚 ,胡义德 ,等.顺铂诱导人肺腺癌 A549细胞系多
重抗药性的形成[ J] .中国肿瘤临床与康复 , 1999 , 6(1):13-16.
[ 2] 韩锐.抗癌药物研究与实验技术[ M] .北京:北京医科大学 、中国
协和医科大学联合出版社 , 1997:271-272.
[ 3] 詹茂程 ,刘叙仪 ,蔡鹏 ,等.耐顺铂人肺腺癌A549/DDP 耐药机理
进一步探讨[ J] .中国肿瘤临床 , 1998 , 25(10):726-728.
[ 4] 李大成 ,屈艺 , 刘柏林 ,等.三种中药制剂 Am-11 、Fw-13 、T ul-17
逆转肿瘤细胞多药耐药性的研究[ J] .华西医科大学学报 , 1998 ,
29(1):18-20.
[ 收稿日期] 2009-01-05
[ 基金项目] 江苏省自然科学基金资助项目(编号:BK2003111)
[ 作者简介] 康然(1977-), 男 ,江苏南京人 ,博士研究生 , 研究
方向:脊柱病。
[ 通讯作者] 谢林 ,男 ,主任医师。 Emai l:Xielin117@126.com.
康颈颗粒对颈椎间盘退变及细胞凋亡影响的实验研究
康　然 ,谢　林
(南京中医药大学 ,江苏 南京 210000)
　　[ 摘要] 目的:检测康颈颗粒对大鼠颈椎间盘退变程度及细胞凋亡的影响 ,探讨颈椎间盘退变程度和颈椎间盘细胞凋亡之
间的关系及康颈颗粒防治颈椎病的可能机制。方法:125 只 SD 大鼠随机分成 5 组 ,每组 25 只 ,进行大鼠颈椎病造模。于术后
3 月造模成功后给药 、术后 6 月分别处死各组 , 对颈椎间盘进行组织学观察和椎间盘细胞凋亡检测。结果:康颈颗粒抑制颈椎
间盘细胞凋亡 ,延缓颈椎间盘退变。并且颈椎间盘细胞凋亡指数与退变程度呈正相关 , 相关系数为 0.314 , P <0.01。结论:
康颈颗粒防治颈椎病的机制为抑制椎间盘细胞凋亡 , 从而延缓椎间盘的退变。
　　[ 关键词] 颈椎间盘退变;细胞凋亡;康颈颗粒;实验研究
[ 中图分类号] R285.5　　　[ 文献标识码] A　　　[ 文章编号] 0257-358X(2009)06-0417-03
　　颈椎病发生发展的根本原因是椎间盘退变 。
Thompson
[ 1] 指出抑制细胞的凋亡或增加细胞抵抗
凋亡的能力将有助于退行性病变的防治 。本研究观
察大鼠颈椎间盘退变模型椎间盘组织中细胞凋亡程
度及椎间盘退变分级情况 ,并探讨它们之间的关系 ,
推断康颈颗粒防治颈椎病的可能机制。
1　材料与方法
1.1　动物造模　3月龄 SPF 级 SD大鼠 125只 ,体
质量190±30 g ,由上海必凯实验动物中心提供 。随
机分为 5组 ,每组 25只。切除颈后肌群造模[ 2] 3月
后 ,开始给药 。B组为芬必得组(中美天津史克制药
有限公司生产);C 组康颈颗粒(由骨碎补 、续断 、黄
芪 、鸡血藤 、没药等组成 ,经现代制剂工艺制成颗粒 ,
院内制剂10 g/袋 ,江苏省中医药研究院提供);D组
给颈复康(承德中药集团生产)。将药物剂量按体表
面积换算 ,溶入蒸馏水中 ,灌胃给药。E为模型空白
对照组 , F 组为正常假手术组 ,E 、F 组不给药 。五组
动物在同样环境中自由饮水 、摄食。在造模和给药
·417·山东中医杂志 2009年 6月第 28卷第 6期