全 文 ：药用植物辣木内生真菌的分离及其抗菌活性分析
廖友媛1 ,曾松荣2 ,马建波2 ,刘　芳2 ,王人俊2
(1.湖南工业大学 , 湖南 株洲 412008;2.韶关学院 英东生物工程学院 ,广东 韶关 512005)
　　摘　要:从新鲜植株辣木的茎和叶中分离出内生真菌 35株 。以金黄色葡萄球菌 、藤黄八叠
球菌 、大肠杆菌 、绿脓杆菌 、白色念株菌 、掷孢酵母为受试菌株 ,对其进行抗菌活性筛选。结果表
明 ,共有 29株内生真菌对 1株或 1株以上的受试菌株有抗菌活性 ,其中平板抑菌圈直径大于 15
mm的菌株有 1株 。研究结果表明 ,辣木内生真菌具有良好的潜在应用价值 ,值得做进一步研究 。
关键词:辣木;内生真菌;抗菌活性物质
中图分类号:Q949.748.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-2611(2006)06-0036-03
　　辣木(Moringa sp.)为辣木科(Moringaceae)辣木属
(Moringa)多年生植物 ,是单科单属植物 ,现有 14个已
知种 ,因其根有辛辣味故名辣木。种植 6个月后即可
开花结实 ,为多用途速生落叶乔木树种 。原产于印度
西北部的喜马拉雅山南麓 ,现己广为引种 ,我国的澳
门 、两广 、海南和云南如今都有种植 。辣木全株均可被
利用 ,根和树皮是传统医药原料 ,嫩叶和嫩果荚是味道
鲜美且营养丰富的蔬菜 ,种子富含植物油分[ 1 ,2] 。
医学研究表明:辣木叶提取物能在 3 h内有效地
降低血糖 ,随着剂量的增加而功效提高 。干叶提取物
对实验动物的溃疡治愈非常有效 ,通过注射可以显著
提高胃溃疡的治愈率 。干叶粉的提取物对中枢神经系
统有非常有效的抑制作用 ,实验小鼠出现明显的肌肉
松驰 、体温下降 ,睡眠时间延长。小鼠口服干根提取
物 ,有明显的抗炎功能 。种子和花的浸液能显著地抑
制脚部浮肿。种子的浸提液具有抑制肠痉挛和利尿的
功效 。体外实验也证明了种子和根的水浸提物能有效
抑制假单胞杆菌 、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌[ 3] 。因
此 ,辣木作为一种新的营养保健食品和药品的研究与
开发具有非常重要的利用价值 。
植物内生真菌的研究已有许多报道 。本研究旨在
从辣木新鲜植株中分离出内生真菌并对其进行初步鉴
定 ,同时初步分析其内生真菌的抗菌活性 ,为寻找新的
抗菌药物资源奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料
植株来源　　新鲜植株辣木的茎及叶片 , 2005年
6月采自广东韶关。
培养基　　试验用培养基参见文献[ 4] 。分离培
养基:马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose agar ,
PDA);发酵培养基:马铃薯葡萄糖液体培养基(potato
dextrose broth , PDB , 在上述 PDA 培养基中 , 没有加琼
脂);受试菌株培养基:牛肉膏蛋白胨固体培养基。
受试菌株　　本试验的受试菌株有细菌中的革兰
氏阳性菌:藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)、金黄色葡萄
球菌(Staphylococcus aureus)和革兰氏阴性菌:大肠杆菌
(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa),
真菌中的白色念珠菌(Candida albicans)、掷孢酵母
(Sporobolomyces roseus)共6种 。
1.2　方法
1.2.1　内生真菌的分离和纯化[ 5]
将刚采集的新鲜辣木的茎在自来水下冲洗干净 ,
沥干水分 ,切割成 2 ～ 3 cm 小段 ,按常规无菌操作进行
如下表面消毒处理:75 %酒精漂洗 3 ～ 5 s※0.1 %升
汞漂洗 4-5 min※无菌水冲洗 4 ～ 5次 。将上述处理
过的茎在无菌条件下剥开取其韧皮部 ,并将其外围剪
去 ,再剪切成约 0.5 cm×0.5 cm 的小片 ,放置于加有
0.03 g/L 链霉素的 PDA平板上 ,每个平板放置 4块。
新鲜辣木叶片的表面消毒处理方式与茎消毒稍有不
同 ,即 0.1 %升汞漂洗时间由 4 ～ 5 min减为 2 ～ 3 min ,
将处理过的叶片剪切成约 0.5 cm×0.5 cm 的小片 ,放
置于加有 0.03 g/L链霉素的 PDA平板上 ,每个平板放
置4片 。28 ℃条件下培养 3 ～ 7 d后 ,可见样品剪切过
的边缘有真菌菌丝长出 ,真菌菌丝经纯化后转接到
PDA斜面上培养好后备用 。为检查材料表面消毒的效
果 ,做如下对照实验:将上述同样表面消毒过的一部分
第 20 卷 第 6 期
2006 年 11 月 　　　　　 　　 　 　 　 　
株 洲 工 学 院 学 报
Journal of Zhuzhou Institute of Technology
　　　　　　　 　 　 　 　Vol.20 No.6
Nov.2006
繱收稿日期:2006-10-10
基金项目:香港铭源基金资助项目(20050202)
作者简介:廖友媛(1974-), 女 ,湖南隆回人 ,湖南工业大学讲师 , 主要从事生物技术方面的研究.
材料不做剪切 ,直接放置于 PDA平板上作对照培养处
理 ,结果对照材料周围均无任何真菌长出 ,证明表面消
毒彻底 ,从而保证了所分离出的真菌是植物的内生真
菌而不是空气中的或组织块表面附生的微生物。
1.2.2　内生真菌的鉴定
按常规鉴定方法进行[ 6 , 7] 。
1.2.3　内生真菌的液体培养
将保存在斜面上的内生真菌菌株分别接种于盛有
7 mL PDB培养基的 18 mm×180 mm试管中 ,同时做不
接种任何菌株的 PDB 空白对照试验 ,置于 25 ℃摇床
上(200 r/min)振荡培养7 d ,无菌条件下过滤除去菌丝
体。考虑到内生真菌在发酵过程中产生有机酸 ,为避
免发酵液中因产有机酸而导致的抑菌结果 ,发酵结束
后测量 PDB空白对照实验试管培养液的 pH 值 ,并以
此值为标准 ,用 0.1 mol/L NaOH溶液调节内生真菌发
酵液 pH 值 ,使过滤后的发酵液的 pH 值与空白对照的
PDB的 pH 值一致 ,取已调节好 pH 值的发酵过滤液及
PDB空白对照实验的培养液备用 。
1.2.4　抑菌实验
抑菌实验采用杯碟法 。在供试无菌培养皿中加入
1 mL 的上述6种受试菌的菌悬液 ,再倒入冷却至45 ℃
左右的牛肉膏蛋白胨固体培养基约 15 mL 摇匀待凝。
待平板凝固后 ,每个平板放入两个牛津杯 ,在每个杯中
分别加入一种上述已调好 pH 值的发酵过滤液 200μL ,
同时做上述 PDB培养液空白对照试验 , 37 ℃培养 24
h ,观察结果 ,并用游标卡尺测量抑菌圈直径 。试验重
复3次 ,以抑菌圈直径的平均值为试验结果。
2　实验结果
2.1　菌株分离结果
本次试验共分离到 35株内生真菌 ,其中从茎中分
离得 20株 ,叶片中分离得15株。经初步鉴定 ,来自茎
的20株内生真菌中无孢菌群(Mycelia sterilia)12株 ,曲
霉属(Aspergillus)3株 ,青霉属(Penicillium)1株 ,木霉属
(Trichoderma)1株 ,拟小卵孢属(Ovulariopsis)1株 ,交链
孢属(Alternaria)1株 ,圆孢霉属(Staphylotrichum)1株;
来自叶片的 15株内生真菌中无孢菌群 7株 ,青霉属 2
株 ,曲霉属 6株(具体见表 1 、表 2 、表 3)。
　表 1　辣木茎的内生真菌的鉴定结果
菌株号 鉴定结果 菌株号 鉴定结果 菌株号 鉴定结果
LJ1 无孢菌群(Mycelia sterilia)
LJ2 无孢菌群(Mycelia sterilia)
LJ3 无孢菌群(Mycelia sterilia)
LJ4 无孢菌群(Mycelia sterilia)
LJ5 无孢菌群(Mycelia sterilia)
LJ6 青霉属(Penici llium)
LJ7 交链孢属(Alternaria)
LJ8 无孢菌群(Mycelia steri lia)
LJ9 拟小卵孢属(Ovulariopsis)
LJ10 无孢菌群(Mycelia steri lia)
LJ11 圆孢霉属(Staphylotrichum)
LJ12 无孢菌群(Mycelia steri lia)
LJ13 无孢菌群(Mycelia steri lia)
LJ14 无孢菌群(Mycelia steri lia)
LJ15 无孢菌群(Mycelia sterilia)
LJ16 木霉属(Trichoderma)
LJ17 无孢菌群(Mycelia sterilia)
LJ18 曲霉属(Aspergillus)
LJ19 曲霉属(Aspergillus)
LJ20 曲霉属(Aspergillus)
　表 2　辣木叶的内生真菌的鉴定结果
菌株号 鉴定结果 菌株号 鉴定结果 菌株号 鉴定结果
LY1 曲霉属(Aspergi llus)
LY2 曲霉属(Aspergi llus)
LY3 曲霉属(Aspergi llus)
LY4 曲霉属(Aspergi llus)
LY5 无孢菌群(Mycelia sterilia)
LY6 曲霉属(Aspergillus)
LY7 青霉属(Penicillium)
LY8 无孢菌群(Mycelia steri lia)
LY9 无孢菌群(Mycelia steri lia)
LY10 无孢菌群(Mycelia steri lia)
LY11 无孢菌群(Mycelia sterilia)
LY12 无孢菌群(Mycelia sterilia)
LY13 青霉属(Penicillium)
LY14 曲霉属(Aspergillus)
LY15 无孢菌群(Mycelia sterilia)
表 3　从辣木植株上分离到的内生真菌的种群组成
亚门 目 科 属 菌株数
半知菌亚门 无孢目 无孢科 无孢菌群 19
半知菌亚门 丛梗孢目 丛梗孢科 曲霉属 9
半知菌亚门 丛梗孢目 丛梗孢科 青霉属 3
半知菌亚门 丛梗孢目 丛梗孢科 木霉属 1
半知菌亚门 丛梗孢目 丛梗孢科 拟小卵孢属 1
半知菌亚门 丛梗孢目 丛梗孢科 圆孢霉属 1
半知菌亚门 丛梗孢目 暗色孢科 交链孢属 1
2.2　内生真菌产抗菌活性物质的菌株
在35株内生真菌中 ,共筛选出 29株内生真菌对
数量不等的受试菌株有不同程度的抗菌活性 ,其余的
菌株及空白对照均无抑菌作用。特别值得关注的是
LY14菌株发酵液对所有的受试菌株均有一定程度的
抑制作用 ,其次 LY2 、LJ17号菌株发酵液对 4种受试菌
株有抑制作用 ,而LY3 、LY13 、LJ10 、LJ12 、LJ18对3种受
试菌株有抑制作用(具体见表 4 、5)。
3　讨论
从分离出的结果看 ,无孢菌群 、曲霉属和青霉属的
分离频率高 ,在辣木植株中为优势菌;木霉属 、交链孢 、
圆孢霉属和拟小卵孢属则相反 ,为稀有种 。并且显示
出从植物茎 、叶所分离的内生真菌数量和种类存在着
一定的差异 ,表明了该植物的不同部位内生真菌具有
一定的多样性。
植物内生真菌是一类相对来说开发较少 、次生代
37第 6期　　　　　廖友媛 ,曾松荣 , 马建波 ,刘　芳 , 王人俊　　药用植物辣木内生真菌的分离及其抗菌活性分析
谢产物丰富 、应用前景广阔的资源微生物 。研究结果
表明辣木内生真菌的代谢产物具有不同程度的抑菌能
力 ,说明辣木内生真菌的代谢产物普遍具有一定的抗
菌活性 ,其中有些可能会成为抗菌药物的来源 ,它为人
类发现具有药用价值的新化合物提供了一个尚未开发
的新资源。特别是 LY14菌株的发酵液对所有的受试
菌株均有一定程度的抑制作用 ,有待于今后对其做进
一步研究 。近年来细菌等微生物对抗生素耐药性的出
现和蔓延 ,已对人类的健康构成了潜在的威胁 。因此 ,
开发和利用植物内生真菌资源 ,寻找新的活性代谢产
物用于医药方面具有重要的医学意义和现实意义 。
表 4　辣木植物茎中内生真菌的抗菌试验结果
菌株
编号 属　　　名
受试菌抑菌圈直径/mm
A B C D E F
菌株
编号 属　　　名
受试菌抑菌圈直径/mm
A B C D E F
LJ1 无孢菌群(Mycelia sterilia) - - - 9 10 - LJ12 无孢菌群(Mycelia steri lia) - - 9 9 - 9
LJ3 无孢菌群(Mycelia sterilia) - - - 9 - 9 LJ13 无孢菌群(Mycelia steri lia) - - - 9 - 10
LJ4 无孢菌群(Mycelia sterilia) 10 - - - - 9 LJ15 无孢菌群(Mycelia steri lia) - - - - - 11
LJ6 青霉属(Penicillium) - - - - 10 10 LJ16 木霉属(Trichoderma) - 11 - - - -
LJ7 交链孢属(Alternaria) - - - 13 - 11 LJ17 无孢菌群(Mycelia steri lia) - 11 11 - 12 15
LJ8 无孢菌群(Mycelia sterilia) - - - 10 10 - LJ18 曲霉属(Aspergillus) - 11 - - 11 10
LJ9 拟小卵孢属(Ovulariopsis) - - - - 10 - LJ19 曲霉属(Aspergillus) - - - - - 10
LJ10 无孢菌群(Mycelia sterilia) - - - 11 9 12 LJ20 曲霉属(Aspergillus) - 14 - - - 10
LJ11 圆孢霉属(Staphylotrichum) - - - 9 - -
表 5　辣木植物叶中内生真菌的抗菌试验结果
菌株
编号 属　　　名
受试菌抑菌圈直径/mm
A B C D E F
菌株
编号 属　　　名
受试菌抑菌圈直径/mm
A B C D E F
LY1 曲霉属(Aspergillus) - - 13 - - 12 LY7 青霉属(Penicillium) - - 9 - - 10
LY2 曲霉属(Aspergillus) - 10 13 - 11 11 LY11 无孢菌群(Mycelia steri lia) - - - - - 10
LY3 曲霉属(Aspergillus) - - 12 - 11 13 LY12 无孢菌群(Mycelia steri lia) - - - - - 10
LY4 曲霉属(Aspergillus) - - - - 9 9 LY13 青霉属(Penicillium) - 11 - 10 - 10
LY5 无孢菌群(Mycelia sterilia) - - - - - 11 LY14 曲霉属(Aspergillus) 23 20 19 10 17 23
LY6 曲霉属(Aspergillus) - - - - 11 - LY15 无孢菌群(Mycelia steri lia) - - - - - 11
　注:1)A 为藤黄八叠球菌(Sarcina lutea), B为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus), C 为大肠杆菌(Escherichia coli), D为绿脓杆菌(Pseudomonas
aeruginosa), E为白色念珠菌(Candida albicans),F 为掷孢酵母(Sporobolomyces roseus);2)“ -”为无抑菌圈。
参考文献:
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Isolation of Endophytic Fungi from Moringa sp.and Preliminary Analysis
of Antimicrobial Activity of the Isolates
LIAO You-yuan1 , ZENG Song-rong2 , MA Jian-bo2 , LIU Fang2 , WANG Ren-jun2
(1.Hunan University of Technology , Zhuzhou Hunan 412008 , China;
2.Yingdong College of Bioengineering , Shaoguan University , Shaoguan Guangdong 512005 , China)
Abstract:Thirty-five isolates of endophytic fungi were isolated from the rhizomes and leaves of Moringa sp..Staphyllo-
coccus aureus , Candida albicans , Sarcina lutea , Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa and Sporobolomyces roseus were
selected as an indicator bacteria when the antibiotic activity of these endophytic fungi was tested through antimicrobial experi-
ments in the exterior body.The result showed that 29 isolates of them were able to produce antibiotic active substances.One
isolate (LY14)of the endophytic fungi producing antibiotic active substance showed the diameter of inhibition zone to 15mm.
These endophytic fungi indicated that they have potential applications , and need to be further studied.
Key words:Moringa sp.;endophytic fungi;antibiotic active substance
38 株　洲　工　学　院　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　2006年