全 文 ：辣木 RAPD最佳反应体系的构建
李海渤 ,任安祥 ,马崇坚 ,王玉珍　(韶关学院英东生物工程学院 ,广东韶关 512005)
摘要　[目的 ]研究辣木(MoringaoleiferaLamarch.)PAPD最佳反应体系 ,为辣木RAPD扩增提供研究基础。 [方法]以辣木为研究材料 ,
通过正交设计建立辣木RAPD最佳反应体系。 [结果]辣木最佳RAPD反应体系为:10×PCRBuffer2.5 μl, Taq酶 0.5μl(2.0U/μl),
dNTPs4.0μl(2.0mmol/L), primer4.0μl(2.0 μmol/L), DNA2.0 μl(30.0 ng/μl), ddH2O12.0μl;反应总体积为 25.0μl。 [结论 ]
RAPD可以应用于辣木研究。
关键词　辣木;RAPD;最佳体系
中图分类号　S188　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)02-00504-02
ConstructionofRAPDOptimalReactionSysteminMoringaoleiferaLamarch.
LIHai-boetal　(YingdongColegeofBioengineering, ShaoguanUniversity, Shaoguan, Guangdong512005)
Abstract　[ Objective] TheresearchaimedtostudytheRAPDoptimalreactionsystemofMoringaoleiferaLamarch., toprovidetheresearch
basisforRAPDamplification.[ Method] TheRAPDoptimalreactionsystemwasconstructedthroughorthogonaldiagram.[ Result] Itcon-
firmedthatthesystemwascomposedof2.5μl10×PCRBuffer, 0.5 μlTaqenzyme(2.0 U/μl), 4.0 μldNTPs(2.0mmol/L), 4.0 μl
primer(2.0μmol/L), 2.0μlDNA(30.0ng/μl), 12.0μlddH2Ointotal25.0 μl.[ Conclusion] RAPDcanbeusedinMoringaoleifera
Lamarch.study.
Keywords　MoringaoleiferaLamarch.;RAPD;Optimalreactionsystem
基金项目　 2006年香港铭源基金重点项目(314-140449)。
作者简介　李海渤(1973-),男 ,河北唐山人 ,讲师 ,从事植物遗传育种
及分子生物学方面的研究。
收稿日期　 2008-11-18
　　辣木(MoringaoleiferaLamarch.)为辣木树科(Moringaceae)
辣木属植物 ,原产于印度北部和非洲 ,为多年生常绿小乔木
至大乔木。辣木是一种具有独特经济价值和营养保健作用
的热带植物 ,被西方科学家誉为 “奇迹之树 ”,欧美等先进国
家已将辣木视为新时代的健康食物。目前 ,针对辣木的研究
主要集中在组成成分 、种植技术 、植物生理 、生产开发等方
面 ,而在分子生物学方面的研究尚未见报道 。
RandomAmplifiedPolymorphismDNA(RAPD)标记 [ 1-2]
是由 Wiliams等和 Welsh等在 PCR技术基础上发展起来的
一种分子标记 ,其优点是自动化程度高 、费用低 、无放射性污
染 、信息量较大及简便快速等。该技术现已广泛应用于遗传
多样性分析 、物种进化 、品种鉴定 、分类等研究领域 。但由于
RAPD技术的扩增结果的稳定性和重复性较差 ,对反应条件
比较敏感 ,因而其应用受到一定的限制 。为了充分利用
RAPD技术 ,科研人员进行了大量的试验 ,结果表明:虽然
RAPD的扩增结果会因反应体系中各种成分及热循环参数
等许多因素的改变而改变 ,但在高度重复的 RAPD反应条件
确定的前提下 ,不同研究者 、不同研究室完全可以获得高度
一致的试验结果。通过使用高纯度 DNA和优化了的反应条
件 ,以及只计数清晰的主带 ,同一样品在不同重复和计数间
的误差频率可控制在 3%以下 [ 3] 。为此 ,笔者以辣木 DNA为
材料 ,建立了适合于辣木的 RAPD最佳反应体系 ,旨在为更
好地利用 RAPD技术对辣木进行深入研究奠定基础。
1　材料与方法
1.1　DNA的提取 　采用 SDS法提取辣木总 DNA,并用
UV3000型紫外分光光度计检测 DNA浓度 ,用 ddH2 O稀释至
30ng/μl。
供试材料由韶关学院英东生物工程学院辣木产业化开
发与研究课题组提供。
1.2　正交试验设计　选用 L25 (56)正交表(表 1),共设计 25
个处理 ,反应总体积为 25 μl,每个反应体系均含 10 ×PCR
Bufer(含 20 mmol/LMg2+)2.5 μl,其余组分 [ TaqDNA聚合
酶 、dNTPs(北京鼎国生物技术有限责任公司提供),引物(北
京奥科生物技术有限责任公司提供);DNA]按表 1稀释并添
加 ,再用 ddH2O将体系补至 25μl。
表 1　辣木 RAPD反应体系的正交设计
　　Table1　OrthogonaldesignoftheRAPDsystemofMoringaoleif-
eraLamarck
处理
Treatment
因素组成 Factorcomposition∥μl
dNTPs
2.0mmol/L
Taq酶(2U/μl)
Taqenzyme
引物(2.0μmol/L)
Primer
DNA
(30ng/μl)
1 1.0 0.5 1.0 1.0
2 1.0 1.0 2.0 2.0
3 1.0 1.5 3.0 3.0
4 1.0 2.0 4.0 4.0
5 1.0 2.5 5.0 5.0
6 2.0 0.5 2.0 3.0
7 2.0 1.0 3.0 4.0
8 2.0 1.5 4.0 5.0
9 2.0 2.0 5.0 1.0
10 2.0 2.5 1.0 2.0
11 3.0 0.5 3.0 5.0
12 3.0 1.0 4.0 1.0
13 3.0 1.5 5.0 2.0
14 3.0 2.0 1.0 3.0
15 3.0 2.5 2.0 4.0
16 4.0 0.5 4.0 2.0
17 4.0 1.0 5.0 3.0
18 4.0 1.5 1.0 4.0
19 4.0 2.0 2.0 5.0
20 4.0 2.5 3.0 1.0
21 5.0 0.5 5.0 4.0
22 5.0 1.0 1.0 5.0
23 5.0 1.5 2.0 1.0
24 5.0 2.0 3.0 2.0
25 5.0 2.5 4.0 3.0
责任编辑　姜丽　责任校对　吴晓燕安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2009, 37(2):504-505, 518
1.3　PCR扩增与产物检测　在 FTH-04AB-102型 PCR仪
(杭州大和热磁电子有限公司生产)上进行扩增 ,热循环程序
为:95 ℃预变性 3min;94℃变性 1 min, 45℃退火 1 min, 72
℃延伸 2 min, 35个循环;72 ℃延伸 10 min, 4℃保存。
扩增产物在 1.0%琼脂糖凝胶中电泳 ,以 λDNA(EcroI
+HindⅢ)(北京鼎国生物技术有限责任公司提供)为 Mark-
er,经 EB染色。在 hnageMasterVDS凝胶成像系统上成像检
测 ,照相并存盘。
2　结果与分析
2.1　RAPD最佳反应体系的构建　根据表 1配制的反应体
系扩增结果见图 1。引物为 P28(GGTCGGAGAA)。
图 1　RAPD最佳反应体系的构建
Fig.1　ConstructionofRAPDoptimalreactionsystem
2.1.1　dNTPs用量的确定 。从图 1带型亮度变化趋势可以
看出 ,随着 dNTPs用量的逐渐增加 ,带型亮度逐渐增加 ,其中
反应体系 16 ～ 25亮度变化不大。这说明当反应体系中
dNTPs用量达 4.0 μl,即达到 dNTPs最佳用量时 ,扩增带型
不再随着 dNTPs用量的增加而发生变化。
2.1.2　Taq酶用量的确定 。由图 1反应体系 1 ～ 10可知 ,随
着 Taq酶用量的增加带型无明显变化;反应体系 11 ～ 15亦
得相同结果;从反应体系 16 ～ 20可以看到 ,反应体系 16、17
为 5条带 ,其中 3条带亮度较高 , 2条带亮度偏低 ,反应体系
18、19为 3条带 ,亮度较高 ,反应体系 20为 4条带 ,其中 2条
带亮度较高。这说明由于反应体系中还有其他组分的影响 ,
Taq酶用量与带型数量及亮度并无正相关关系。由 21 ～ 25
的扩增结果也得出同样结论。
2.1.3　引物用量的确定 。由图 1反应体系 1 ～ 5可知 ,随着
引物用量的增加扩增带型无明显变化 ,造成该结果可能是由
于 dNTPs用量偏低成为主要的限制性因素;从反应体系 6 ～
10可知 ,反应体系 8扩增出 3条带 ,而反应体系 6、7、10扩增
出 1条带 ,说明当引物用量低于 4 μl时 ,扩增效果不佳;从反
应体系 11 ～ 15可知 ,随着引物用量的增加 ,带型逐渐变得清
晰 ,数量也有所增加;从反应体系 16 ～ 25可知 ,随引物用量
的增加 ,反应体系扩增带型数量增加 、带型清晰 ,但用量为 4
μl时与 5μl时扩增结果无明显变化 ,说明在该条件下 ,最佳
引物用量可以初步定为 4 μl。
2.1.4　DNA用量的确定。由图 1反应体系 1 ～ 5可知 ,随着
DNA用量的增加扩增带型无明显变化;从反应体系 6 ～ 10可
知 ,当 DNA用量为 5 μl时 ,带型为 3条 ,其余无明显变化;从
反应体系 11 ～ 15可知 ,当 DNA浓度为 2μl时 ,扩增带型为 5
条带 , DNA用量为 5 μl时 ,只扩增出 2条带 ,说明 DNA用量
与扩增带型并无正相关关系 。反应体系 16 ～ 25同样证明了
该结论 。总体来看 ,当 DNA用量达到 2 μl时 ,均可得到良好
的扩增带型。
2.2　最佳反应体系的初步确定　经上述分析 , RAPD反应体
系由 Taq酶 、dNTPs、随机引物 、DNA等共同组成 ,这些组成成
分之间存在一种相互作用的关系 ,最佳反应体系就是这些组
成成分间的最佳谐和状态。从图 1可以看出 ,反应体系 16
的 RAPD扩增带型清晰 ,数量适合 ,而且基本符合 Taq酶 、
dNTPs、引物及 DNA用量的初步确定条件 ,从而将该体系初
步确定为最佳反应体系。即在 25 μl的反应体系中 , 2.5 μl
10×PCRBufer、0.5 μl2 U/μlTaq酶 、4.0 μl2.0 mmol/L
dNTPs、4.0 μl2 μmol/L引物 、2.0 μl30 ng/μlDNA和 12.0
μlddH2O。
2.3　最佳反应体系的验证　为了检验试验结果的准确性 ,
按照上述最佳反应体系 ,任取引物 P6(ACGCATCGCA)、P14
(ACCAGGTTGG),任选 12个单株辣木 DNA分别对上述初步
确定的反应体系进行验证 ,结果见图 2。
　　从图 2可以看出 ,所有参试引物的扩增带型清晰 、稳
注:M.Marker;1～ 6为引物 P6;7～ 12为引物 P14。
Note:M.Marker;1-6.PrimerP6;7-12.PrimerP14.
图 2　RAPD最佳反应体系的验证
Fig.2　VerificationofRAPDoptimalreactionsystem
定性好 ,从而证实该试验体系可以作为最佳反应体系 。
3　结论与讨论
3.1　RAPD反应的影响因素　RAPD反应的影响因素涉及
Taq酶 、dNTPs、随机引物 、DNA等 。在辣木 RAPD扩增中 ,
dNTPs、随机引物的用量对扩增效果影响明显 ,随着 dNTPs用
量的逐渐增加扩增带型数量增多 ,亮度增大 ,但当达到某定
值时 ,扩增效果不再随 dNTPs用量变化而变化;另外 ,随着引
(下转第 518页)
50537卷 2期　　　　　　　　　　　　　　　　　　　李海渤等　辣木 RAPD最佳反应体系的构建
注:M.DNA标准分子量;P.阳性对照;N.阴性对照;1～ 10.转基因
植株。
Note:M.DNAstandardmolecularweight;P.Positivecontrol;N.Nega-
tivecontrol;1-10.Transgenicplant.
图 5　转基因植株中aroA-M1基因 PCR扩增结果
Fig.5　PCRresultsofaroA-M1intransgeniccotonplants
草剂草甘膦作选择剂 ,就在于草甘膦能够高效地与植物体内
的芳香族氨基酸合成酶(EPSPS)结合从而抑制芳香族氨基
酸的合成 ,最终造成植物饥饿而死亡。棉花茎尖对草甘膦非
常敏感 ,这与草甘膦常在植物体内生长点处富集的特点吻
合 。通过棉花茎尖草甘膦敏感性试验发现 ,与不同棉花品种
下胚轴对草甘膦表现出不同的敏感性不同 ,各品种棉花茎尖
对草甘膦的敏感性无明显差异 ,均在 60 μmol/L草甘膦浓度
下停止生长。 Hu等研究也表明 ,小麦分生组织比愈伤对草
甘膦更敏感 ,非转化的分生组织不能在 0.02 mmol/L的草甘
膦浓度下生长 [ 13] 。
3.2　棉花遗传转化体系　延迟筛选又称恢复培养 ,其本质
在于使外源基因表达有一个缓冲阶段 ,只有外源基因表达了
或达到了一定的水平 ,细胞才能表现出整体水平的抗性 ,此
过程相似于大肠杆菌转化后得在无抗生素条件下培养一段
时间 ,诱导抗性基因表达后才进行抗性筛选。试验结果显
示 ,不进行恢复培养就直接进行草甘膦筛选的所有品种棉花
茎尖全部死亡 ,说明对于高毒(相对组织培养来讲)筛选剂的
草甘膦来讲 ,进行 1周的恢复培养是非常必要的。
预培养的目的一方面是使外植体尽快适应新的生长条
件 ,另一方面是能减少褐化现象的产生 [ 10] 。在不含激素的
培养基上培养 2 ～3 d,使组织中的酚类物质先部分渗入到培
养基中 ,当外植体的切口愈合后 ,酚类物质减少或停止 ,这样
可减少组织的氧化褐变 ,使外植体能正常生长和分化。棉花
是含酚类物质较高的作物之一 ,因此采用预培养这一步骤也
显得非常必要 。试验结果表明 ,各棉花品种茎尖切段经过预
培养处理后 ,在后期的根诱导阶段根诱导率要比对照组高
15%左右 。
　　利用农杆菌介导法转化的棉花外植体有下胚轴 、子叶 、
胚性细胞悬浮培养物等 ,但是这些外植体类型的转化效率较
低 ,且有严重的基因型依赖性 ,难于在一些优良的栽培品种
上应用 ,如中棉 35通过愈伤诱导而获得再生苗的几率极低。
离体茎尖转化具有直接产生不定芽和无基因型依赖性等优
点。该研究首次以草甘膦作为筛选剂和茎尖为外植体对 4
个陆地棉品种进行了成功转化。由于起始材料可直接再生
植株 ,与愈伤组织相比大大缩短了转化周期 ,整个转化周期
为 3 ～ 4个月 ,且后代变异性较小 [ 11] 。同时 , PCR对转基因
的初步分析也表明 ,以草甘膦为选择剂选择效率非常高 ,阳
性苗率达 100%,这可克服利用其他选择剂产生大量嵌合体
的困境 ,能适度减轻后续育种的工作量。总之 ,此遗传转化
体系的建立为进一步进行棉花遗传改良打下了坚实的基础 ,
同时对植物抗除草剂基因工程研究有积极意义。
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(上接第 505页)
物用量的增加 ,扩增带型数量增加 ,带型清晰 ,但达到某定值
时扩增效果不再发生过大变化 。Taq酶及 DNA用量对辣木
RAPD影响不大 ,且其浓度与扩增带型无明显相关。另外 ,通
常影响 RAPD扩增的另一个重要因素是 MgCl2浓度 ,因该试
验采用的是含 Mg2+缓冲液 ,故对 MgCl2用量未进行讨论。
3.2　辣木最佳 RAPD反应体系　经验证 ,辣木最佳 RAPD
反应体系为:在 25μl的反应体系中 , 2.5μl10×PCRBufer、
0.5μl2 U/μlTaq酶 、4.0 μl2.0 mmol/LdNTPs、4.0 μl2
μmol/L引物 、2.0μl30 ng/μlDNA和 12.0 μlddH2O。
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518 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年