全 文 ：用 RAPD标记分析辣木的遗传多样性
李海渤 , 唐志明 , 任安祥 , 马崇坚 , 王玉珍
(广东韶关学院农业工程系 ,广东韶关 512005)
　　摘要:采用 RAPD分子标记技术对 78株不同形态特征的辣木遗传多样性进行了研究。 20个随机引物共扩增出 128条
DNA带 , 其中 47条为多态性带 ,占比为 36.7%。利用 NTSYS-PC软件进行加权组法(UPGMA)聚类分析 , 建立参试材料分子
系统树状图;以相似系数 0.67为标准 ,可将所有品种分为 4类 , 同时说明不同形态特征(叶柄颜色)的材料可能与遗传无关 ,
而可能是由于环境变化或营养组分的差异所致。
　　关键词:辣木;RAPD;聚类研究;形态特征;遗传多样性
　　中图分类号:Q78　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2009)01-0049-03
收稿日期:2008 -07-02
基金项目:香港铭源基金(编号:314-140449)。
作者简介:李海渤(1973— ),男 ,河北唐山人 ,讲师 ,从事遗传育种与
分子生物学研究。 Tel:(0751)8659616;E-mail:lihai bo@ 163.com。
　　辣木(Moringaoleifera)系辣木科辣木属植物 ,原产于印
度北部和非洲 ,为多年生常绿小乔木至大乔木。辣木是一种
具有独特经济价值和营养保健作用的热带植物 ,被西方科学
家誉为 “奇迹之树 ”,欧美等先进国家已将辣木视为新时代的
健康食物 。现在针对辣木的研究主要集中在其栽培技术 [ 1 ] 、组
培技术 [2 ] 、营养成分分析 [3 -5] 、育种研究 [ 6] 、遗传研究 [ 6]等方
面 ,此外还进行了辣木多糖含量测定 [ 7] 、Se含量测定 [ 8] 、多糖
提取及分离纯化 [9 ] 、籽油萃取 [ 10] 、蛋白质提取 [11] 、总黄酮乙醇
提取 [ 12] 、降血糖作用 [ 13 ] 、抗氧化作用 [ 14] 、纯化叶的总皂苷 [ 15] 、
辣木油脱色 [ 16] 、辣木内生菌产生扩菌物质的生物学特性 [ 17 ]等
研究 。 RAPD标记技术现已广泛应用于遗传多样性分析 、物种
进化 、品种鉴定 、分类 [ 18-20 ]等研究领域。关于辣木的分子生物
学方面研究目前尚未见报道 。另外 ,在辣木实生苗群体中 ,部
分单株之间存在形态学差异 ,其是否存在遗传方面差异尚未见
研究 。为了创造新的辣木种质资源 ,培育辣木新品种 ,本试验
以存在不同形态特征的辣木单株为研究材料 ,采用 RAPD技术
进行了聚类分析 ,从而确定单株之间是否存在亲缘关系以及单
株之间的形态学差异是否存在遗传学方面的因素 。
1　材料与方法
1.1　材料
供试材料辣木为韶关学院英东生物工程学院辣木课题组
提供 。三羟甲基氨基甲烷 (Tris)、重蒸酚 、溴化乙锭(EB)、
RNaseA、琼脂糖 (Agarose)、λDNAMarker(EcroI+HindⅢ )、
dNTPs、TaqDNA聚合酶 、 10 ×PCRbufer(含 20 mmol/L
Mg2 +)等由北京鼎国生物技术有限责任公司提供;随机引物
由北京奥科生物技术有限责任公司合成;异丙醇 、无水乙醇 、
三氯甲烷 、异戊醇 、EDTA、氯化钠 、蔗糖 、溴酚蓝等为国产分析
纯试剂 。
1.2　方法
1.2.1　辣木形态特征观察 　参试材料主要区别在于叶柄颜
色分为红色和绿色两种 ,对参试材料进行标号处理后 ,分两次
观察辣木叶柄颜色并记录结果(表 1)。
表 1　辣木部分形态学观察
序号 2007年 11月叶柄颜色
2008年 4
月叶柄颜色 序号
2007年 11
月叶柄颜色
2008年 4
月叶柄颜色
1 局部浅红 浅红 40 深红 深红
2 局部浅红 浅红 41 局部浅红 局部浅红
3 局部浅红 浅红 42 绿 局部浅红
4 深红 深红 43 局部浅红 局部浅红
5 局部浅红 浅红 44 浅红 浅红
6 局部浅红 绿 45 浅红 浅红
7 深红 深红 46 绿 浅红
8 绿 局部浅红 47 绿 局部浅红
9 局部浅红 浅红 48 深红 浅红
10 浅红 浅红 49 局部浅红 局部浅红
11 局部浅红 浅红 50 浅红 浅红
12 浅红 局部浅红 51 浅红 浅红
13 浅红 深红 52 浅红 浅红
14 局部浅红 局部浅红 53 局部浅红 局部浅红
15 局部浅红 绿 54 局部浅红 局部浅红
16 绿 局部浅红 55 局部浅红 局部浅红
17 绿 局部浅红 56 浅红 浅红
18 浅红 局部浅红 57 深红 浅红
19 局部浅红 局部浅红 58 浅红 浅红
20 绿 绿 59 局部浅红 局部浅红
21 局部浅红 红 、有毛 60 浅红 浅红
22 浅红 浅红 61 局部浅红 局部浅红
23 局部浅红 浅红 62 局部浅红 浅红
24 绿 绿 63 绿 浅红
25 绿 局部浅红 64 浅红 局部浅红
26 浅红 深红 65 浅红 红 、有毛
27 局部浅红 局部浅红 66 深红 深红
28 深红 浅红 67 深红 深红
29 局部浅红 浅红 68 浅红 局部浅红
30 绿 局部浅红 69 浅红 局部浅红
31 局部浅红 局部浅红 70 深红 浅红
32 绿 局部浅红 71 局部浅红 绿
33 深红 深红 72 浅红 局部浅红
34 局部浅红 浅红 73 局部浅红 深红
35 局部浅红 局部浅红 74 局部浅红 局部浅红
36 浅红 浅红 75 深红 浅红
37 浅红 浅红 76 局部浅红 局部浅红
38 浅红 浅红 77 浅红 浅红
39 浅红 浅红 78 浅红 局部浅红
—49—江苏农业科学　2009年第 1期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2009.01.037
1.2.2　总 DNA提取　以 SDS法提取上述材料总 DNA(参照
傅荣昭等方法 [ 21 ] )。
1.2.3　DNA样品的紫外消光值检测　取上述方法提取的各
DNA样品 60 μl,用 TE稀释 50倍至 3 ml,分别测定其 A230
nm、A260 nm和 A280 nm的光吸收值 , 根据 DNA浓度
(μg/ml)=50 ×OD260 nm ×稀释倍数 ,确定 DNA母液浓度 ,进
而按 30 ng/μl进行稀释 。
1.2.4　PCR扩增与产物检测　RAPD反应体系为:2.5 μl10
×PCRbufer、0.5 μl2 U/μl的 Taq酶 、4.0 μl2.0 mmol/L
dNTPs、4.0 μl2 μmol/L引物 、2.0 μl30 ng/μlDNA和 12.0
μlddH2O,总反应体系体积为 25 μl。热循环参数为:95 ℃预
变性 3 min, 94 ℃变性 1 min, 45 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 2
min, 35个循环 ,最后 72 ℃延伸 10 min, 4℃保存 。扩增产物
在 1.0%(W/V)琼脂糖凝胶中电泳 , 以 λDNA(EcroI+Hind
Ⅲ)为 Marker,经 EB染色 。在 hnageMasterVDS凝胶成像系
统上成像检测 ,照相并存盘 。
1.2.5　统计方法和数据处理 　将电泳图谱的同一位置上的
条带视为一个性状 ,有条带记为 “1” ,无条带记为 “0”。运用
NTSYSpc2.10e软件分析计算遗传距离和相似系数 ,采用 UP-
GMA方法构建聚类分析图 。
2　结果与分析
2.1　PCR扩增结果
本试验选用 20个随机引物 ,获得了较好的扩增效果 ,电
泳条带多态性丰富 ,带型清晰(图 1)。 20个随机引物中有多
态性的引物有 17条 ,占 85%,共扩增出条带 128条 ,其中有
多态性的条带数量为 47条 ,多态性位点占比为 36.7%。
2.2　利用 RAPD技术对参试材料聚类分析结果
从聚类图中可以看出 ,所有参试材料差异较大 ,明显地分
为 4大类 。说明在辣木材料中 ,单株之间变异丰富 。在系统
树状图(图 2)中 ,当相似系数为 0.67时 ,可将 78份参试材料
明显分为 4组:Ⅰ组包括了 1、2、4、5、7、15、6、21、17、45、71、
52、54、46、42、43、63、44、76、49、55、74、59、64、41、51、53、62、
72、73等材料 ,相似系数为 0.669;Ⅱ组包括 3、12、58、61、10、
18、20、40、9、60、30、37、14、50、19、 23、24、25、26、27、29、36、
28、31、34、32、65、33、39、57、13、16、38、56、35、47、77、8等材
料 ,相似系数为 0.687;第Ⅲ组包括 66、67、68、78、69、70等材
料 ,相似系数为 0.74;第Ⅳ组包括 11、22、48、75等材料 ,相似
系数为 0.74。
2.3　叶柄颜色与遗传背景的关系
在聚类图(图 2)中 ,部分材料严格的聚为一类 ,如 2、4、
5;7、15;45、71等 ,说明部分单株之间遗传背景完全相同 。从
单株之间的形态特征来看 , Ⅲ类和Ⅳ类所有材料全部为浅红 、
局部浅红或深红植株 ,没有绿色植株 。 Ⅰ类和Ⅱ类材料中既
有红色植株又有绿色植株 ,说明绿色与红色植株聚为一类 ,其
中 7号材料与 15号材料严格地聚为一类 ,而 7号材料叶柄为
深红色 , 15号材料叶柄为绿色 。说明叶柄颜色的差异可能是
由于环境的影响 ,而不是遗传差异造成 。从两年对参试材料
的形态学观察也可得到相似结论 ,如 8、16、17、25、30、32、42、
46、47、63等材料由 2007年 11月的绿色性状变化为 2008年
4月的浅红或局部浅红 。同样 2007年 11月观察的单株中 6、
15、71号等由原来的局部浅红变化为 2008年 4月的绿色性
状 。说明单株之间存在叶柄红色与绿色之间的动态变化 ,从
侧面说明叶柄颜色的差异与遗传无关 。
3　讨论
RAPD反应涉及模板 DNA、随机引物 、Taq酶 、MgCl2以及
dNTPs等 。 RAPD反应的稳定性较差 ,其中对 RAPD反应影
响较大的因素主要有引物浓度 、MgCl2 、dNTPs等 。只有将这
些因素经过最佳组合试验加以确定才能得到稳定的实验条
件 。值得注意的是 ,不同公司提供的 Taq酶对 RAPD反应也
有影响 ,所以在进行 RAPD反应的过程中 ,最好采用同一家公
司生产的 Taq酶。利用 RAPD技术鉴定种质资源的遗传多样
性已多见报道 。本试验证明 , RAPD标记可以应用于辣木遗
传聚类分析 ,且可将参试材料划分为 4个大类 。
选取的参试材料虽为同一品种但单株之间差异较大 ,说
明辣木遗传背景丰富 。另外 ,辣木材料中存在叶柄红 、绿色差
异 ,试验及观察记录说明造成辣木叶柄颜色差异的原因可能
与遗传无关 ,可能是由于环境变化或营养组分的差异所致 ,这
有待进一步研究 。
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(下转第 52页)
—51—李海渤等:用 RAPD标记分析辣木的遗传多样性
正交试验优化菊花组织培养条件
邱　璐 , 范树国 , 文正山 , 杨海艳 , 邹银燕 , 黄　静 , 郑才智 , 胡明建 , 杨启国
(楚雄师范学院化学与生命科学系 ,云南楚雄 675000)
　　摘要:通过菊花无菌苗体系建立 、愈伤组织诱导 、不定芽分化 、不定根诱导试验 ,发现用 0.2%HgCl2对叶片 、茎尖消毒 3 ～
4 min建立无菌苗体系较好;2, 4 -D 0.5 mg/L、6 -BA0.5 mg/L对愈伤组织的诱导较好;生长素 NAA 0.1 mg/L、IBA0.1
mg/L、2, 4-D0.1 mg/L和细胞分裂素 6-BA1.0 mg/L、ZET1.0mg/L、2-ip1.0mg/L对不定芽分化形成均有较好效果。
　　关键词:菊花;组织培养;正交试验;激素
　　中图分类号:S682.1+10.4　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2009)01-0052-03
(上接第 51页)
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　　菊花 (Dendranthemamorifolium)为菊科(Compostitae)多
年生草本植物 [ 1 ] ,具有观赏及药用价值 。菊花喜凉爽 、较耐
寒 ,生长适温 18 ～ 21 ℃[ 2] ,在微酸性至微碱性土壤中皆能生
长 ,以 pH值 6.2 ～ 6.7最好 [3 ] 。菊花味甘 、苦 ,微寒 。归肺 、
肝经 [ 4 ] 。花和全草含挥发油 ,成分有菊油环酮 、蜡状物 、单龙
脑酞酸酯 、菊醇利黄酮类成分 、木樨草素 -7 -葡萄糖苷二水
合物等 [ 5 ] 。具有散风清热 、平肝明目之功效 ,可用于风热感
冒 、头痛眩晕 、目赤肿痛 、眼目昏花的治疗 [ 6] 。本试验的目的
旨在通过正交试验优化菊花组织培养的条件 。
1　材料与方法
1.1　材料
菊花采自楚雄师范学院校园 , 4个品种代号分别为品种
1、品种 2、品种 3、品种 4。
收稿日期:2008 -08-14
基金项目:云南省自然科学基金(编号:2006C0086M);云南省学术技
术带头人后备人才项目(编号:2006PY01 -61);云南省楚雄州学
术技术带头人项目(编号:200401);楚雄师范学院院级重点建设
学科项目(编号:05YJJSXK03)。
作者简介:邱　璐(1965— ),女 ,四川人 ,硕士 ,副教授,主要从事植物
组织培养及转基因研究。 E-mail:qiulu55@163.com。
通讯作者:范树国(1965— ),男 ,博士 , 教授 ,主要从事生物化学及分
子生物学研究。 E-mail:fansg@cxtc.edu.cn。
1.2　方法
采用正交试验设计 ,结果用 SPSS11.5软件进行统计
分析 。
1.2.1　不同外植体部位 、不同消毒时间对菊花无菌苗体系建
立的影响试验　采用 1/2MS0为基本培养基 ,选取菊花茎尖 、
叶片 、根 [ 7-8] ,用 0.2%HgCl2分别处理 3 min、4 min、5 min[ 9] ,
进行单因素多水平对照试验 。每组试验接 5瓶 ,每瓶接种 4
个材料 ,暗处理 7 d后观察 。
1.2.2　不同外植体部位 、基本培养基类型及激素组合对菊花
愈伤组织诱导的影响试验　采用 5因素 4水平正交试验 [ 10] ,
每组试验接 5瓶 ,每瓶接种 4个材料。因素水平见表 1。
1.2.3　不同来源的愈伤组织 、基本培养基类型及激素组合 、
蔗糖浓度对诱导菊花愈伤组织分化形成不定芽的影响试验采
用 5因素 4水平正交试验 [ 11 ] ,每组试验接 5瓶 ,每瓶接种 4
个材料 。因素水平见表 2。
表 1　菊花愈伤组织诱导的正交试验设计因素水平
水平
因　素
品种 外植体 培养基 细胞分裂素(0.5 mg/L)
生长素
(0.5 mg/L)
1 1 茎尖 MS 6 -BA NAA
2 2 叶片 B5 KT IAA
3 3 叶柄 改良 Read ZET IBA
4 4 根 Anderson 2 -ip 2, 4-D
—52— 江苏农业科学　2009年第 1期