全 文 ：第 47卷 增刊 2
2008年 12月
厦门大学学报(自然科学版)
JournalofXiamenUniversity(NaturalScience)
Vol.47 Sup.2
Dec.2008
收稿日期:2008-09-19
基金项目:福建省自然科学基金 (B0510003)和国家基础科学人才
培养基金项目(J0630649)资助
＊通讯作者:scyang@xmu.edu.cn
辣木植物 ISSR分子标记的初步研究
韩 闯 , 李 敏 , 钟 然 , 云 叶 , 杨盛昌＊
(厦门大学生命科学学院 ,福建 厦门 361005)
摘要:对从 7个不同地方采集的 7份辣木(Moringa)材料进行了 ISSR标记分析.结果表明 ,被测材料间 ISSR标记多态性
较高.从 18个 ISSR引物中筛选出 6个可扩增出清晰的且具多态性的条带的引物 ,共扩增出 75条带 ,其中 59条具有多态
性 , 占总扩增带数的 78.67 %, 其中每个引物可扩增出 4 ～ 14条多态性带 , 平均 10.17条.ISSR标记遗传相似性系数
(GS)变异范围为 0.557 0 ～ 0.836 7, 平均值为 0.687 6±0.080 9.聚类分析表明 , 7份辣木材料可以聚为四类 , 其中 MS2
为单独一类.ISSR标记可以有效地评价辣木植物遗传分化并为辣木种类的鉴别提供一定的理论依据.
关键词:辣木;ISSR;遗传分化;种类鉴定
中国分类号:Q 943 文献标识码:A 文章编号:0438-0479(2008)S2-0177-04
DNA分子标记技术的出现为在 DNA分子水平上
鉴定动植物种类提供了强有力的工具.ISSR(Inter
simplesequencerepeat)是 Zietkiewicz等于 1994年最
早采用的一种新型分子标记技术 [ 1] ,其基本原理是利
用包含简单重复序列并在 3′或 5′锚定的寡聚核苷酸
引物 ,对微卫星之间的 DNA序列进行 PCR扩增.ISSR
标记技术具有操作简单 ,快捷 ,重复性好 ,多态性水平
高等特点 ,已应用于玉米 、小麦 、葡萄 、柑橘 、水稻和马
铃薯等许多作物的品种鉴定 、系统分类 、遗传多样性检
测 、基因定位和遗传图谱构建等研究 [ 2-7] .
辣木为辣木科辣木属(Moringa)植物 ,共 14个种 ,
原产于印度北部 、非洲和阿拉伯半岛 ,是一种有独特经
济价值的热带植物.辣木叶片 、果荚富含多种矿物质 、
维生素 ,作为蔬菜和食品有增进营养和食疗保健功能.
辣木种子含有活性凝结成分 ,有净化水的特殊功能 ,因
此辣木又被誉为 “神奇之树”.辣木广泛种植于亚洲 、
非洲和中美洲的 30多个热带 、亚热带国家或地区 ,在
我国 ,广东 、海南 、云南 、台湾以及福建厦门等省市均有
引种.由于辣木是辣木属植物的总称 ,种系来源复杂 ,
加之改良品种的引进 ,因此利用传统的形态学 、解剖学
性状对辣木种类的鉴定具有一定的局限性.目前 ,厦门
已引种了 Moringaovalifolia、M.oleifera、M.stenopetala
等辣木种类 ,但有些种系的分类地位难以确定.
目前对辣木的研究主要集中在物质成分分析和活
性成分提取等方面 ,而采用分子标记技术对辣木种内
及种间遗传关系分析的研究报道较为少见 ,其中 Mu-
luvi等采用 AFLP分子标记技术分析了 M.oleifera种
群的遗传多样性 [ 8]并且评估了 M.oleifera种群的杂交
率 [ 9] ,本研究则采用了 ISSR标记技术分析了辣木部分
种类亲缘关系和遗传分化 ,以期为在分子水平鉴定辣
木种类提供可行性的理论依据.
1 材料和方法
1.1 材 料
7份辣木嫩叶样品包括 5个种类已知样品和 2个
种类未知样品 ,分别取自厦门市厦门大学 ,花卉中心 ,
天竺山农庄和万石植物园等处引种的辣木.辣木样品
编号及相关信息见表 1.
TaqDNA聚合酶 , dNTP, λDNAEcoRⅠ +HindⅢ
双酶切 Marker购于上海生物工程公司;PCR引物由上
海生物工程公司合成;其余试剂为进口或国产分析纯.
主要仪器有 UNOIThermocyclerPCR仪(Biome-
tra公司)、Bio-Rad-Power300型稳压稳流电泳仪 、SIG-
MA3K18冷冻离心机 、BeckmanDU-600核酸蛋白质分
析仪及 Bio-Rad多色凝胶扫描成像系统等.
1.2 DNA提取
分别称取 7种辣木样品各 1 g,按 CTAB法提取植
物总 DNA[ 10] .用 BeckmanDU-600核酸蛋白质分析仪
测定 DNA纯度及含量 , 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其
完整性.
1.3 ISSR检测程序及条件
经条件优化 , PCR扩增反应体系为总体积 20
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表 1 辣木样品编号及相关信息
Tab.1 ThesamplesNo.andrelativeinformationofMoringa
编号 种名 采集地 引种地 原产地
MS1 Moringaovalifolia 厦门大学 印度尼西亚 安哥拉和纳米比亚
MS2 待定 厦门大学 印度尼西亚 未知
MS3 Moringaovalifolia 花卉中心 台湾 安哥拉和纳米比亚
MS4 待定 花卉中心 台湾 未知
MS5 MoringaoleiferaPMK 天竺山农庄 海南 印度北部亚喜马拉雅区域
MS6 Moringastenopetala 天竺山农庄 海南 埃塞俄比亚和肯尼亚北部
MS7 Moringastenopetala 万石植物园 印度尼西亚 埃塞俄比亚和肯尼亚北部
μL,各反应物终浓度分别为 1UTaqDNA聚合酶 、1×
bufer、 2.0 mmol/LMgCl2 、 200 μmol/LdNTPs、 400
nmol/L引物和 50 ng模板 DNA.PCR反应条件:94℃
预变性 5 min;94℃变性 30s, 退火(退火温度 =引物
熔解温度 -1℃)45 s, 72℃延伸 2 min,循环 45次;
72℃后延伸 7 min.扩增产物电泳条件:1.5%琼脂糖
胶 , 120 V, 3 h.用 Bio-Rad多色凝胶成像系统拍照.
1.4 数据处理
每个样品电泳条带按有或无记录 ,有则赋值为 1,
否则赋值为 0;强带和弱带均赋值为 1.按 Nei指数法
计算材料间遗传距离(D)和遗传一致度(F).计算公
式为:F=2Nij/(Ni+Nj),其中 Nij为材料 i和 j
共有的扩增片段数目 , Ni, Nj为材料 i和 j个体分别拥
有的 ISSR扩增片段数目.D=1-F,根据 F值按不加
权成对群算术平均法(UPGMA, unweightedpairgroup
methodwitharithmeticmeansclusteranalysis)进行遗传
聚类分析.统计分析在 NTSYSPC(version2.10s)软
件系统下进行.
2 结果与分析
2.1 引物筛选及 ISSR多态性分析
采用 18个 ISSR引物对 7份辣木样品进行扩增筛
选 ,其中 6个 ISSR引物能稳定产生清晰 、多态的扩增
产物(表 2),扩增片断大部分集中在 0.2 ～ 2 kb范围
内(图 1).在 7份辣木材料中 , 每个引物能扩增出 4 ～
14条多态性带 ,平均 10.2条.6个 ISSR标记共产生
75条扩增带 , 其中 59 条为多态性条带 , 多态率
78.67%.这些结果说明 , ISSR标记能够揭示辣木材料
间较高的多态性.
2.2 遗传相似系数
根据 ISSR-PCR结果 ,计算辣木植物遗传相似系
数(GS)和遗传距离(GD).结果表明(表 3), 7份辣木
样品间的 GS值变化范围为 0.557 0 ～ 0.836 7,平均值
为 0.687 6±0.080 9.其中 MS6和 MS7遗传相似程度
最高 , MS1和 MS7的遗传距离最远.
图 1 辣木样品的 ISSR-PCR扩增产物电泳图谱
Fig.1 TheamplicationresultsofISSR-PCRonMoringasmaples
A.ISSR2;B.ISSR5;M.DNAMarker;1 ～ 7.SampleNo.(Tab.1)
增刊 2 韩 闯等:辣木植物 ISSR分子标记的初步研究 · 179 ·
表 2 有效引物序列及扩增结果
Tab.2 SequencesandPCRresultsofefectiveprimers
引物序号 序列 扩增条带数 多态条带数 多态条带百分率 /%
ISSR1 (AG)8T 6 4 66.67
ISSR2 (AG)8CTC 13 12 92.31
ISSR3 (GA)8TC 13 9 69.23
ISSR4 (GAA)6 16 12 75.00
ISSR5 (AG)8CT 17 14 82.35
ISSR6 CCA(GTG)4 10 8 80.00
表 3 遗传相似系数
Tab.3 Geneticsimilarity(GS)values
MS1 MS2 MS3 MS4 MS5 MS6 MS7
MS1 1.0000
MS2 0.5915 1.0000
MS3 0.8000 0.6667 1.0000
MS4 0.5647 0.6809 0.6939 1.0000
MS5 0.6341 0.6374 0.6947 0.7048 1.0000
MS6 0.6914 0.6444 0.7660 0.7500 0.7327 1.0000
MS7 0.5570 0.5682 0.6739 0.8235 0.7273 0.8367 1.0000
2.3 聚类分析
利用 ISSR标记数据 ,采用 UPGMA法对 7份辣木
样品间的亲缘关系进行聚类分析 ,结果见图 2.结果表
明 , MS6和 MS7遗传距离最小聚为一类 ,再与 MS4和
MS5松散的聚为一类;MS1和 MS3的遗传距离仅次于
MS6和 MS7 ,聚为一类;MS2与其它材料间的遗传分化
最大 ,单独聚为一类.因此利用 ISSR标记能较准确的
反映出辣木样品间的亲缘关系.
图 2 辣木样品的 ISSR聚类分析树状图
Fig.2 Treediagram forMoringasmaplesbasedonISSR
markers
3 讨 论
作为一种快速 、可靠并能够提供相关基因组丰富
的 DNA指纹信息技术 , ISSR标记己广泛应用于植物
品种鉴定 、遗传作图 、基因定位 、遗传多样性 、进化和分
子生态学研究中 [ 11] .本研究采用 ISSR方法检测 7份
辣木样品的多态百分率 ,其值达到 78.67 %,说明辣木
植物存在较为丰富的遗传变异或多样性;在分子聚类
图上 ,同一种辣木植物的样品间(MS6和 MS7, MS1和
MS3)的遗传距离相对较小 ,联系最紧密 ,而不同种的
辣木样品间仅松散地聚为一类 ,其中单独聚为一类的
MS2在形态特征上与其它样品差异也最明显 ,可以独
立作为一个种.而未知样品 MS4在遗传上更接近 M.
stenopetala非洲辣木种.据此我们认为 ISSR分子标记
能够有效 、准确地反映辣木种间的遗传变异水平并为
其分类 、鉴定提供可靠的分子水平证据.
如表 3和图 2所示 ,虽然同属 M.stenopetala的辣
木样品 MS6和 MS7的遗传距离和同属 M.ovalifolia
的辣木样品 MS1和 MS3的遗传距离均相对最小 ,但也
分别达到了 0.16和 0.20,其原因可能是由于厦门地
区的辣木均不是直接引种于原产地而是来自于海南 、
台湾和东南亚等地 ,在人工栽培和不同的生长环境作
用下 ,辣木种内的变异增大 、遗传多样性增加所致.
· 180 · 厦门大学学报(自然科学版) 2008年
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StudyonMoringaPlantsbyISSRMarker
HANChuan, LIMing, ZHONGRan, YUNYe, YANGSheng-chang＊
(SchoolofLifeSciences, XiamenUniversity, Xiamen361005, China)
Abstract:Inter-simplesequencerepeat(ISSR)methodwasappliedtodetectthegeneticvariationandrelationshipamongsevenmoringa
plantsamplesrepresentedfromMS1toMS7.MS1andMS3 wereMoringaovalifolia, MS5wasM.oleiferaPMK, MS6andMS7 wereM.stenope-
talaandMS2 andMS4wereunknown.SixeffectiveISSRprimersselectedfrom 18ISSRprimersgenerated75 bands, ofwhich59werepoly-
morphic, reachingto78.67 % ofalbands.Eachprimerwasabletogenerate4to14polymorphicbandsandaveragewas10.2.Geneticsimi-
larityvaluesbetweensamplesvariedfrom0.557 0to0.836 7.BasedonUPGMAclusteranalysis, MS6andMS7wereclassifiedintoagroup,
MS1 andMS3 wereothergroup, MS4andMS5 untightlyclusteredwiththegroupofMS6andMS7 andthenwiththegroupofMS1 and
MS3.MS2wasclassifiedintoasinglegroupduetothefarthestgeneticdistancetoothers.Theresultofclusteranalysiswasidenticaltoexpec-
tation, suggestingthatISSRmethodwasabletoevaluategeneticvariationofmoringaefectivelyandwasappliedtotheidetificationandclassi-
ficationofmorgingaplants.
Keywords:Moringa;ISSR;geneticvariation;speciesidentification