全 文 ：Chinese Journal of New Drugs 2013，22(18)
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中国新药杂志 2013 年第 22 卷第 18 期
［基金项目］ 国家自然科学基金(30600002)
［作者简介］ 蔡庆秀，男，硕士研究生。联系电话:(0571)88982291，E-mail:sochouchou@ 126． com。
［通讯作者］ 章初龙，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事内生真菌的基础和应用基础研究及生物农药的研究开发。联系电话:(0571)
88982291，E-mail:clzhang@ zju． edu． cn。
·实验研究·
辣木内生真菌 LM033 的分离鉴定及其代谢产物抗植物病原菌活性
蔡庆秀1，赵金浩1，3，王佳莹2，王丽薇4，章初龙2
(1 浙江工业大学绿色制药技术与装备教育部重点实验室，杭州 310014;
2 浙江大学生物技术研究所，杭州 310029;3 浙江大学农药和环境毒理研究所，杭州 310058;
4 杭州师范大学医药卫生管理学院药物科学部，杭州 310036)
［摘要］ 目的:鉴定一株来自药用植物辣木根部的内生真菌菌株 LM033，分离其抗植物病原菌活性代
谢产物。方法:依据 ITS序列测定结果对菌株 LM033 进行鉴定;采用硅胶柱层析，凝胶柱层析等色谱方法分
离发酵液的乙酸乙酯提取物中的活性物质，并根据化合物的光谱分析(MS，1H- and 13C-NMR，DEPT)确定化
学结构。结果:菌株 LM033 被鉴定为链格孢属的一种，从该菌株分离得到 5 个化合物:链格苝醇(1)，4，6，8
(14)，22-麦角甾四烯-3-酮(2)，异细交链孢素(3)，链格孢霉酚(4)和链格孢霉甲基醚(5)。5 个化合物对被
测试植物病原菌都有一定抑制活性，其中链格苝醇对供试的植物病原菌有较好的抑制活性，相应的对灰葡萄
孢和终极腐霉的 IC50值分别为 25． 6 和 29． 5 μg·mL
－1。结论:从辣木根部分离到的内生真菌链格孢属可产生
对植物病原菌具有中等抑制活性的链格苝醇，对植物病害防治具有一定的意义。
［关键词］ 辣木;内生真菌;链格孢属;代谢产物;抗植物病原菌活性
［中图分类号］ R915． 1 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1003 － 3734(2013)18 － 2168 － 06
Isolation and identification of endophytic fungus LM033 obtained from
Moringaoleifera Lam． and biological activity of the metabolites
CAI Qing-xiu1，ZHAO Jin-hao1，3，WANG Jia-ying2，WANG Li-wei4，ZHANG Chu-long2
(1 Key Laboratory for Green Pharmaceutical Technologies and Related Equipment，Ministry of Education，
Hangzhou 310014，China;2 Institute of Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China;
3 Institute of Pesticide and Environmental Toxicology，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China;
4 Department of Pharmaceutical Science，College of Medicine and Public Health Management，
Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China)
［Abstract］ Objective:To identify the endophytic fungus strain LM033 isolated from the roots of medicinal
plant Moringaoleifera Lam． and to isolate the metabolites with inhibitory activity against phytopathogens． Methods:
The strain LM033 was identified by analyzing ITS sequence． The ethyl acetate extract of the culture broth was puri-
fied by column chromatography． The structures of the compounds were determined on the basis of spectroscopic an-
alyses (MS，1H-and 13C-NMR，and DEPT)． Results:The fungus strain LM033 was identified as Alternariasp． Five
compounds were obtained and their structures were determined as alterperylenol(1)，ergosta-4，6，8(14)，22-tet-
raen-3-one(2)，altenuisol(3)，alternariol(4)，and alternariolmethyl ether(5)． The five compounds showed certain
inhibitory activity against phytopathogens． Among which，compound 1 showed good growth inhibition against Botry-
tiscinerea and Pythiumultimum with IC50 values of 25． 6 and 29． 5 μg·mL
－1，respectively． Conclusion:The endo-
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phytic fungus Alternaria sp． isolated from the roots of the medicinal plant M． oleifera can produce alterperylenol
which show moderate inhibitory activity against plant pathogens，which is meaningful to disease protection of plants．
［Key words］ M． oleifera;endophytic fungus;Alternaria sp．;metabolites;phytopathogens
内生真菌是一种寄生在植物活体组织中而不会
引发任何明显症状的微生物，已经被证明是一种能
产生新结构或者具有非常好的生物活性的次生代谢
产物的有效来源［1 － 2］。内生真菌及其宿主植物的关
系可能为潜在的植物病原菌或者互惠共生［3］。值
得注意的是，地球上大约有 300 000 多种植物，而每
个单独的植物个体都有一种或者多种内生真菌寄
生，因而内生真菌资源是非常丰富的［4］。内生真菌
的次生代谢产物的体外活性测试表明:大多数的内
生真菌都能产生抗菌的活性物质［5］。由植物病原
菌引起的人类和植物感染是一个持续和严重的问
题，因此从真菌次生代谢产物中寻找抗菌活性物质
具有一定意义。
辣木是热带落叶乔木，广泛分布在印度次大陆，
非洲。传统上，辣木的根、树皮、豆荚和叶子被用来
做药，来治疗多种人类疾病，而辣木的豆荚和叶子都
能做蔬菜食用［6］。然而对药用植物辣木的内生真
菌及其次生代谢产物的研究却很少。
菌株 LM033 是一株来自药用植物辣木的内生
真菌，其在 PDB培养基中培养的发酵液具有广谱抑
菌活性。进而对发酵液分离得到 5 个化合物，并鉴
定其化学结构，分析其对植物病原菌的抑制活性。
材料与方法
供试菌株、培养基和试剂
1． 1 供试菌株 链格孢属 Alternaria sp． LM033，
Rhizoctoniasolani(立枯丝核菌)，Botrytiscinerea(灰葡
萄孢)，Pythiumultimum(终极腐霉)，Fusariumoxyspo-
rum(尖孢镰刀菌)，Sclerotiniasclerotiorum(核盘菌)，
Pestalotiadiospyri(柿盘多毛孢)均由浙江大学生物技
术研究所真菌实验室分离并保存。
1． 2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂(potatodextrose-
agar，PDA)，马铃薯葡萄糖液体培养基(potatodex-
trosebroth，PDB)。
1． 3 试剂 化合物分离纯化使用的试剂均为国产
分析纯试剂。
# 内生真菌的分离纯化
参照 Gu［7］的方法进行内生真菌的分离，将采集
到的辣木的根用无菌水进行漂洗，接着用 75%的乙
醇消毒 30 s 以及 1． 5%的次氯酸钠消毒 10 min，然
后用无菌水漂洗 3 次。将消毒过的根部组织切成
0． 5 cm长的组织片，并将 6 个组织片移接在含 100
μg·mL －1氨苄西林和硫酸链霉素的 PDA 培养基上，
于 25 ℃避光培养。待菌丝长出来以后，将菌丝顶端
移接到新的 PDA培养基上，连续纯化 3 次获得纯培
养。分离得到的菌株保存在斜面培养基中，用液体
石蜡封存。
3 菌株 LM033 的鉴定
将菌株接于 PDA 培养基上于 25 ℃避光培养
6 d，然后把菌丝从培养基上刮下，于液氮中研磨成
粉末。用 Multisource Genomic DNA Miniprep Kit 试
剂盒(美国 Axygen 公司)提取菌株 LM033 的 DNA。
ITS序列扩增的引物为 Innis 等［8］设计的通用引物
ITS1 (5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和 ITS4
(5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3)。每 50 mL PCR
反应体系包含 1 × PCR 缓冲液，2． 5 mmol·L －1 Mg2 +，
100 μmol·L －1 dNTPs，两种引物各 0． 5 μmol·L －1，
10 ng 模板 DNA，以及 2U Taq DNA聚合酶。混合上
述反应液后，94 ℃预变性 3 min，然后按 94 ℃变性
40 s，54 ℃退火 50 s和 72 ℃延伸 60 s的步骤扩增 35
个循环，最后于 72 ℃延伸 10 min 结束反应。PCR
产物用一种 DNA凝胶试剂盒(中国 Axygen公司)纯
化，用 ABI 3730 定序仪(美国 Applied Bio-systems公
司)。将测定得到的序列在 NCBI 的 BLAST 软件进
行相似序列检索，并采用 ClustalX 1． 8 对这些同源
序列进行多序列联配分析，用MEGA 4 软件中的 N-J
法(Neighbor Joining)构建不同系统发育树，自举次
数设置为 1 000。
$ 发酵和代谢产物分离
将菌株 LM033 接到 1 000 mL锥形瓶中(500 mL
PDB)，25 ℃下，150 r·min －1避光振荡培养 15 d。发
酵结束后，用 4 层纱布过滤，收集发酵液(20 L)。发
酵液用等体积的乙酸乙酯萃取 3 次，减压浓缩干燥
后得乙酸乙酯浸膏(4． 33 g)。将所得浸膏与 12 g
100 ～200目硅胶拌样，混匀后上硅胶柱(1 000 mm ×
40 mm，200 ～ 300 目，216 g)分离。以石油醚-乙酸乙
酯混合溶液梯度洗脱(10∶ 1，8∶ 1，6∶ 1，4∶ 1，2∶ 1，1∶ 1，
1∶ 2，1∶ 3)，收集浓缩得到 9 个组分，编号 F1 ～ F9。
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组分 F1，F5，F7，F8，F9 对活性测试菌株灰葡萄孢有
抑制活性。组分 F1 用甲醇做流动相上 LH-20 葡聚
糖凝胶柱纯化后得到化合物 2(15 mg);组分 F5 经
重结晶后得化合物 5(44 mg);组分 F7 用 MeOH /
CHCl3(1∶ 1)作流动相上 LH-20 葡聚糖凝胶柱分离
得 8 个子馏分，每个 5 mL，合并子组分 6 ～ 8 得到化
合物 1(40 mg);组分 F8 用 MeOH /CHCl3(1∶ 1)做流
动相上凝胶柱反复纯化得化合物 4(32 mg);组分 F9
用 TLC制备板分离，用氯仿 ∶ 甲醇 = 15 ∶ 1混合溶液
做流动相，将 Rf 值在 0． 25 ～ 0． 33 的硅胶刮下于丙
酮中浸泡，过滤浓缩得化合物 3(34 mg)。
& 化合物的分析手段
解析 5 种化合物的化学结构采用的方法为质谱
和核磁共振光谱分析。质谱是用 Therm LCQ TM
Deca XP plus型质谱仪(美国 Thermo 公司)测定;所
有核磁共振数据都是在 Bruker AVANCE III 500
MHz型核磁共振仪(瑞士 Bruker公司)上测定收集，
使用 TMS做内标，δ(ppm)表示化学位移，J(Hertz)
表示耦合常数。化合物分离过程所用到的硅胶都是
青岛海洋化工厂生产;所用 SephadexLH-20(葡聚糖
凝胶)是瑞士 Pharmacia Biotech公司生产。
% 体外抗菌活性实验
采用菌丝生长速率法来测定化合物对 6 种植物
病原菌(立枯丝核菌、灰葡萄孢、终极腐霉、尖孢镰
刀菌、核盘菌、柿盘多毛孢)的抑制活性。用无菌水
将供试样品稀释成 5 个质量浓度梯度(6． 25，12． 5，
25，50，100 μg·mL －1)后加入到 PDA中，混匀后倒入
直径为 60 mm 的培养皿中制成有毒平板。每个梯
度 3 次重复，以无菌水为空白对照。将活化的供试
病原菌菌饼(直径 5 mm)接种至有毒平板中央，
25 ℃ 下培养至菌丝即将长满平皿时，用十字交叉
法测量各浓度培养皿的菌丝直径。
抑制率 /% = ［(对照菌落直径 － 处理菌落直
径)/(对照菌落直径 －菌饼直径)］× 100，后用 DPS
软件计算得 IC50，IC50是处理组在同等条件下生长速
率只有空白对照组的一半时所需测试化合物的浓度。
结 果
1 菌株 LM033 的鉴定
通过 PCR 扩增的菌株 LM033 的 ITS 序列与
GenBank 中的序列进行比较，与其同源性最高的菌
株为 链 格 孢 属 Alternariaalternata 菌 株 IEIHBT
(GQ121322)和 Alternariaalternata菌株H7(GU566303)，
相似性为 100%，最终鉴定为链格孢属 Alternaria
sp．，两者在以 N-J法构建的系统发育树上聚为同一
簇群，结果见图 1。
链格孢属普遍存在于植物中，已经有报道中从
南海红树林［9］、美登木［10］、无花果［11］中分离得到。
该属真菌也是生物活性次生代谢产物的重要来源，
如抗细菌活性的二萘嵌苯类衍生物［12］、抗人体肿瘤
细胞活性的萜类化合物、三环混元萜［13］及抗真菌活
性的二酮哌嗪类化合物［14］。本研究首次从辣木中
分离到链格孢属内生真菌。
# 化合物的结构解析
化合物1:淡黄色固体，ESI-MS m/z:349［M －H］－，
331［M － H-H2O］
－，提示化合物相对分子质量为
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350，结合波普数据推测其分子式为 C20 H14 O6。
1H-NMR(500 MHz，CD3COCD3)δ (ppm):2． 96(dd，
J = 15. 9，12． 1 Hz，1H，H-2)，3． 05(dd，J = 15． 9，
4． 7 Hz，1H，H-2)，3． 20(d，J = 9． 6 Hz，1H，H-12b)，
4． 72(m，1H，H-1)，6． 30(d，J = 10． 5 Hz，1H，H-5)，
6． 94(d，J = 8． 7 Hz，1H，H-12)，7． 02(d，J = 8． 7 Hz，
1H，H-11)，7． 97(d，J = 8． 7 Hz，1H，H-8)，8． 01(d，
J = 10. 5 Hz，1H，H-6)，8． 03(d，J = 8． 7 Hz，1H，
H-7)，12． 48(d，J =20． 3 Hz，1H);13C-NMR(126 MHz，
CD3COCD3)δ(ppm):48． 1(C-2)，52． 1(C-12b)，
65. 8(C-1)，67． 1(C-12a)，113． 6(C-5)，116． 7(C-8)，
117. 6(C-3a)，118． 3(C-9a)，125． 4(C-6a)，125． 6
(C-6b)，126． 5(C-6)，132． 3(C-11)，132． 7(C-7)，
138． 2(C-3b)，140． 9(C-9b)，153． 4(C-12)，161． 5(C-
9)，162． 3(C-4)，191． 3(C-10)，204． 3(C-3)。与文
献［15］对照，确定该化合物为链格苝醇，结构见图 2。
化合物 2:浅黄色固体，ESI-MS m/z:393 ［M +
H］+，433［M +H2O + Na］
+，提示化合物相对分子质
量 392，结合波普数据推测其分子式为 C28 H40 O。
1H-NMR数据高场区显示明显的甾体类化合物特征
峰，与硫酸-氯仿试剂显色反应为青色，推测化合物
为甾体。1H-NMR(500 MHz，CDCl3)δ(ppm):0． 83
(3H，d，J = 6． 8 Hz，H-26)，0． 85(3H，d，J = 6． 8 Hz，
H-27)，0． 94(3H，d，J = 6． 8 Hz，H-28)，0． 97(3H，s，
H-18)，1． 00(3H，s，H-19)，1． 07(3H，d，J = 6． 7 Hz，
H-21)，5． 21(1H，dd，J = 15． 3，8． 0 Hz，H-22)，5． 27
(1H，dd，J = 15． 2，7． 3 Hz，H-23)，5． 75(1H，s，H-
4)，6． 04(1H，d，J = 9． 5 Hz，H-6)，6． 62(1H，d，J =
9． 5 Hz，H-7);13 C-NMR(126 MHz，CDCl3)δ(ppm)
(ppm):16． 9(C-19)，17． 9(C-28)，19． 2(C-11)，
19. 2(C-18)，19． 9(C-27)，20. 2(C-26)，21． 4(C-
21)，25． 5(C-15)，27． 9(C-16)，33． 3(C-24)，34． 3
(C-1，2)，35． 8(C-12)，36． 9(C-10)，39． 5(C-20)，
43． 1(C-25)，44． 2(C-13)，44. 6(C-9)，55． 9(C-17)，
123． 2(C-4)，124． 6(C-6)，124． 7(C-8)，132． 8(C-
23)，134． 2(C-7)，135． 2(C-22)，156． 3(C-14)，164． 6
(C-5)，199． 7(C-3)。光谱数据和文献［16］对照，确
定化合物为 4，6，8(14)，22-麦角甾四烯-3-酮(2)，结
构见图 2。
化合物 3:异细交链孢素，褐色固体，分子式
C14H10O6。
1H-NMR(500 MHz，CD3COCD3)δ(ppm):
3． 97(s，7H)，6． 49(d，J = 2． 1 Hz，1H)，6． 83(s，
1H)，7． 02(d，J = 2． 0 Hz，1H)，7． 53(s，1H)，11． 63
(s，1H);13C-NMR(126 MHz，CD3COCD3)δ(ppm):
56． 12，98． 63，99． 52，100． 32，103． 99，108． 92，110. 35，
138. 39，144． 23，145． 60，149． 52，165． 20，166． 04，
167． 80。光谱数据与文献［17］对照一致，结构见图 2。
化合物 4:链格孢霉酚，淡黄色固体，分子式
C14H10O5，
1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ(ppm):
2. 66(3H，s，H-11)，6． 32(1H，d，J = 2． 0 Hz，H-8)，
6. 62(1H，d，J = 2． 0 Hz，H-2)，6． 69(1H，d，J = 2． 0
Hz，H-4)，7． 21(1H，d，J = 2． 0 Hz，H-10);13 C-NMR
(126 MHz，DMSO-d6)δ (ppm):25． 2(Me)，96． 5
(Ar-C)，101． 1(Ar-CH)，101． 6(Ar-CH)，104． 9(Ar-
CH)，108． 9(Ar-C)，117． 5(Ar-CH)，137． 9(Ar-C)，
138． 1(Ar-C)，152． 6，158． 6，164． 1，167． 0，164． 7。
光谱数据与文献［18］对比一致，结构见图 2。
化合物 5:链格孢霉甲基醚，淡黄色结晶，分子
式 C15H12O5。
1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ(ppm):
2． 72(3H，s，H-11)，3． 90(3H，s，OMe)，6． 60(1H，d，
J = 2． 0 Hz，H-8)，6． 64(1H，d，J = 2． 5 Hz，H-2)，
6. 72(1H，d，J = 2． 5 Hz，H-4)，7． 20(1H，d，J =
2． 0 Hz，H-10)，10． 41(1H，s，OH)，11． 82(1H，s，
OH);13C-NMR(126 MHz，DMSO-d6)δ(ppm):24． 9
(Me)，55． 8(OMe)，98． 4(Ar-C)，99． 1(Ar-CH)，
101． 6(Ar-CH)，103． 3(Ar-CH)，108． 8(Ar-C)，
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117. 6(Ar-CH)，137． 8(Ar-C)，138． 4(Ar-C)，152． 6，
158． 6，164． 0，164． 6，166． 1。光谱数据与文献［19］对
比，结果一致，确定化合物 5 为链格孢霉甲基醚，结
构见图 2。
! 体外抗菌活性测试
用菌丝生长速率法检测各化合物对 6 种供试病
原菌生长的影响，结果表明，化合物 1 有较好的抑菌
活性，对灰葡萄孢和终极腐霉的半抑制浓度分别为
25． 6 和 29． 5 μg·mL －1，对核盘菌和柿盘多毛孢也有
中等的抑菌活性。化合物 2 对立枯丝核菌和核盘菌
有微弱的抑菌活性。其他化合物没有明显的抑菌活
性。结果见表 1。
表 1 化合物 1 ～ 5 抑菌活性的半数抑制浓度(IC50) μg·mL
－1
供试菌株 1 2 3 4 5
立枯丝核菌(R． solani) ＞ 100 61． 1 ＞ 100 ＞ 100 ＞ 100
灰葡萄孢(B． cinerea) 25． 6 ＞ 100 ＞ 100 ＞ 100 ＞ 100
终极腐霉(P． ultimum) 29． 5 ＞ 100 ＞ 100 ＞ 100 ＞ 100
尖孢镰刀菌(F． oxysporum) ＞ 100 ＞ 100 ＞ 100 ＞ 100 ＞ 100
核盘菌(S． sclerotiorum) 41． 8 65． 6 ＞ 100 51． 6 ＞ 100
柿盘多毛孢(P． diospyri) 98． 8 ＞ 100 ＞ 100 ＞ 100 78． 7
结 果
在本研究中，在 ITS序列分析的基础上，将来自
药用植物辣木根部的内生真菌菌株 LM033 鉴定为
链格孢属，并从其次生代谢产物中分离到 5 个化合
物，都具有一定的抗菌活性。目前在对链格孢属研
究，主要集中在其细胞毒素方面，对其抗植物病原菌
代谢产物的研究并不多。如二苯并吡喃酮衍生
物［17，20］，二萘嵌苯类衍生物［21 － 22］都对多种人体肿
瘤细胞有较强的诱变活性。在本研究中，对菌株
LM033 乙酸乙酯萃取物进行分离，得到 5 个化合物，
其中化合物 1 有较好的抑菌活性。化合物 1 为二萘
嵌苯类衍生物，为链格孢属的独有性产物，到目前为
止未在其他菌属中分离得到。早期的研究发现该化
合物对人体端粒酶有抑制活性［23］，本研究证明该化
合物还具有较好的抑制植物病原菌活性。
值得注意的是，本研究初期将乙酸乙酯层进行
活性测试，发现对灰葡萄孢具有较好的抑制活性，
IC50为 40 μg·mL
－1，而在后续的分离，仅化合物 1 有
较好的抑菌活性，其他 4 种化合物抑菌活性较弱或
无。推测可能有以下 2 个原因:菌株 LM033 分泌的
某种活性物质可能在分离纯化的过程中丢失;化合
物 3，4，5 都为二苯并吡喃酮衍生物，在结构上相似，
在活性上可能有协同作用，表现在单体较弱。Pero
等［24］发现 1 ∶ 1的链格孢酚和链格孢甲基醚混合产
生协同作用，单独的链格孢酚或链格孢甲基醚对
HeLa细胞的毒性作用之和比它们的混合物毒性作
用要弱，对于植物病原菌是否也有同样的协同作用
还有待研究。分离纯化过程优化及协同作用探索的
研究工作正在进行中。
志谢:感谢浙江工业大学药学院张亚磊在化合物结构解
析中给予的帮助。
［ 参 考 文 献 ］
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编辑:周卓 /接受日期:
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2013 － 04 － 27
(上接第 2135 页)
甲醇、甲醇对各化合物的提取效率，结果显示，60%
甲醇对各化合物的提取效率最高，故选定 60%甲醇
作为样品提取溶剂。
对样品提取方式进行考察，结果显示，超声 15，
30，45，60 min及静置过夜的样品丹参素钠、原儿茶
醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸 B 的峰面积均基本一
致，说明上述提取方式对 5 种成分的提取效率无区
别。因丹参酚酸类成分的热不稳定性，故未考察热
回流提取和索氏回流提取等热提取方式。参照《中
华人民共和国药典》2010 年版一部复方丹参片项下
丹酚酸 B 的含量测定方法，样品提取选择超声处理
30 min。
对提取溶剂 60%甲醇的用量进行考察，结果显
示，60%甲醇用量在 20，30，40，50，60，70，80 mL 时
测得的丹参素钠、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚
酸 B 的含量均基本一致，说明不同的提取溶剂量对
各化合物的提取效率影响不大。为简化样品处理方
法，选择用 60%甲醇 50 mL制备样品。
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编辑:周卓 /接受日期:2013 － 07 － 18