全 文 ：矢车菊 －3 －O －葡萄糖苷与牛血清白蛋白相互作用的光谱学研究
王 海，王 帅，王日为*
( 山东农业大学化学与材料科学学院，山东 泰安 271018)
摘要: 应用紫外吸收光谱、荧光光谱和同步荧光光谱法研究了矢车菊 － 3 － O － 葡萄糖苷与牛血清白蛋白
( BSA) 的相互作用，结果表明: 矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷能使 BSA 发生内源荧光猝灭，属静态猝灭机理。
25 ℃和 30 ℃下，矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷与 BSA的静态猝灭速率常数分别为 3． 7 × 104 L·mol －1，4． 1 ×
104 L·mol －1，结合常数为 1． 1 × 105 L·mol －1，1． 5 × 105 L·mol －1，结合位点数为 1。根据 Fòrster非辐射
能量转移机理，矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷与 BSA之间的作用距离约为 5． 6 nm，能量转移效率为 0． 085。热
力学分析表明矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷与 BSA存在疏水相互作用，矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷对 BSA 构象影
响较小。
关键词: 矢车菊 － 3 － O －葡糖糖苷; 牛血清蛋白; 荧光光谱; 热力学参数
中图分类号: O 657． 39 文献标识码: A 文章编号: 1000 － 2324 ( 2012) 02 － 0179 － 05
收稿日期: 2011 － 11 － 10
作者简介: 王 海 ( 1987 － ) 男，山东青州人，在读硕士研究生，主要从事天然产物的分离与分析研究。
* 通讯作者: Author for correspondence． E － mail: wjfx@ sdau． edu． cn
SPECTROSCOPIC STUDY ON INTERACTION OF CYANIDN － 3 －O －GLUCOSIDE
CHLORIDE WITH BOVINE SERUM ALBUMIN
WANG Hai，WANG Shuai，WANG Ri － wei*
( College of Chemistry and Materials Science，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China)
Abstract: The interaction of Cyanidin － 3 － O － glucoside chloride with bovine serum albumin ( BSA) was
studied by UV absorption spectroscopy fluorescence spectroscopy and synchronous fluorescence spectroscopy in
the work． The results showed that Cy － 3 － O － Glu could induce an endogenous fluorescence quenching of BSA
under a mechanism of static quenching． The quenching rate constants at 25℃ and 30℃ were determined to be
3． 7 × 104 L·mol － 1，4． 1 × 104 L·mol － 1，respectively; the binding constants 1． 1 × 105 L·mol － 1，1．
5 × 105 L·mol － 1，respectively． The number of binding site of the static quenching was calculated． According
to the theory of Fòrster nonradiative energy transfer the interacting distance of Cy － 3 － O － Glu and BSA was esti-
mated to be 5． 62nm nm with an efficiency of 0． 0851． By analysis of thermodynamic parameters，the binding
of Cy － 3 － O － Glu with BSA was mainly attributed to the hydrophobic interaction． The Cy － 3 － O － Glu had on-
ly a slight influence on the BSA conformation by the fluorescence spectra．
Key words: Cyanidin － 3 － O － glucoside chloride; bovine serum albumin; fluorescence pectroscopy; thermo-
dynamic parameter
矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷 ( Cyanidin － 3 － O － glucoside chloride，结构式见图 1) 是矢车菊素与葡萄
糖形成的一种花色苷，主要从桑葚、黑豆皮中提取得到。研究表明: 花色苷具有很强的抗氧化作用，可
以清除体内的自由基，具有抗变异、抗肿瘤、抗过敏、保护胃粘膜等多种生物活性［1］。目前对其研究
主要集中于色素的提取方法、分离纯化方法、热稳定性、抗氧化活性及其生理功能方面。而从分子水平
上研究其与生物大分子的相互作用机理则鲜有报道。
山东农业大学学报 ( 自然科学版) ，2012，43 ( 2) : 179 － 183
Journal of Shandong Agricultural University ( Natural Science)
图 1 矢车菊 － 3 －O －葡萄糖苷的分子结构
Fig． 1 The Structure ofCyanidin － 3 －O － glucoside chloride ( C3G)
牛血清白蛋白 ( bovine serum albumin，简称 BSA) 是血浆中的重要载体蛋白，能和许多内源、外源
性物质结合，起到存储和转运的作用，是药物发挥药效的重要载体和靶分子。小分子和血清白蛋白相互
作用的研究，可从分子水平的角度认识蛋白质与小分子相互作用的机理，为生命科学研究以及药物研究
提供有用的信息［2，3］。
本实验采用紫外和荧光光谱法研究了矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷与 BSA 的相互作用机理，得到了矢
车菊 － 3 － O －葡萄糖苷与 BSA的猝灭速率常数、表观结合常数、结合位点数及结合距离，根据热力学
参数确定了其相互作用力类型，并用荧光法研究了矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷对 BSA 构象的影响，为阐
明矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷在体内的输送和代谢过程，了解其生物学作用机理提供了实验证据。
1 实验部分
1． 1 仪器与试剂
RF －5301PC型荧光分光光度计、UV －2450 紫外 －可见分光光度计 ( 日本岛津公司) ，HH －2 数显
恒温水浴 ( 国华电器) ，矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷 ( 98%，美国 CHROMADEX 公司) ，牛血清白蛋白
( 99%，Sigma公司) ，其他试剂均为分析纯，实验用水为二次重蒸馏水，经检测无荧光杂质。
准确称取矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷并配制浓度为 4． 194 × 10 －5 mol·L －1标准液，准确称取牛血清
白蛋白配制成 1． 0 × 10 －5mol·L －1置于 4 ℃冰箱中保存。0． 5 mol·L －1NaCl溶液、pH 7． 40 的 Tris －
HCl缓冲溶液 ( 浓度为 5． 0 × 10 －2 mol·L －1标准液) 。
图 2 矢车菊 － 3 －O －葡萄糖苷存在下 BSA的荧光猝灭光谱
Fig． 2 Fluorescence quenching spectra of Cy － 3 －O －Glu － BSA
CBSA = 2． 0 × 10
－6mol·L － 1 ; Cy － 3 －O －Glu /10 －6mol·L － 1，from 1 to 6: 0，0． 839，2． 52，4． 20，5． 87 and 7． 55
1． 2 实验方法
准确移取一定体积的矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷标准液于 10 mL 比色管中，加入 BSA 标准液 2． 00
·081· 山东农业大学学报 ( 自然科学版) 第 43 卷
mL、NaCl溶液 2． 00 mL、Tris － HCl缓冲溶液 2． 00 mL，定容。一定温度下恒温 1 h后，选择激发和发
射光栅狭缝均为 3 nm，激发波长为 282 nm，恒温扫描一定波长范围内 BSA的荧光发射光谱、BSA在矢
车菊 － 3 － O －葡萄糖苷作用下的荧光猝灭光谱、同步荧光光谱 ( Δλ 分别为 15 nm、60 nm) 、UV 吸收
光谱。
2 结果与讨论
2． 1 矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷对 BSA荧光的猝灭光谱及猝灭机制
2． 1． 1 荧光猝灭光谱 BSA 中因含有色氨酸 ( Trp) 、酪氨酸 ( Tyr) 、苯丙氨酸 ( Phe) 等残基而发
射一定强度的内源荧光。图 2 是在 BSA溶液中加入不同浓度的矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷溶液后的荧光
光谱。BSA在 338nm 处有较强的荧光，随着矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷浓度的增加，338nm 附近的荧光
强度被有规律的猝灭，说明矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷与 BSA发生了相互作用。
2． 1． 2 荧光猝灭机制 荧光猝灭通常可以分为动态猝灭和静态猝灭［4］。动态猝灭作用过程遵循 Stern
－ Volmer方程。荧光猝灭符合式 ( 1) F0 /F = 1 + Kq ［Q］ ( 1)
［5］
式中: F0为不存在猝灭剂时的荧光强度，F为加入猝灭剂后的荧光强度，Kq 为猝灭常数，［Q］为
猝灭剂浓度。根据式 ( 1) ，对于单一的动态或静态猝灭过程，以 F0 /F 对猝灭剂浓度 ［Q］作图应为直
线关系，直线斜率则代表荧光猝灭过程速率常数 Kq。
通常，生物大分子的最大动态猝灭过程速率常数 K ＜ 100 L·mol － 1［6］，而速率常数大于 100 L·
mol － 1的猝灭过程应是静态猝灭。将 25，30 ℃不同温度下 BSA的荧光强度 F0 /F比值与猝灭剂矢车菊 －
3 － O －葡萄糖苷浓度分别作图，图 3 显示随着矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷浓度的增加和 F0 /F 逐渐增大，
且二者呈良好的线性关系，直线斜率分别为 3． 7 × 104和 4． 1 × 104，相关系数分别为 0． 9913，0．
9937，因此可以判断 BSA的荧光猝灭是由于矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷与 BSA 形成的配合物引起的静态
猝灭。
2． 2 矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷与 BSA的结合常数和结合位点数
在静态猝灭作用中，荧光强度与猝灭剂的关系可由静态猝灭公式 ( 2) ［5］表示:
lg ［ ( F0 － F) /F］ = lgKA + nlg ［Q］ ( 2)
将 lg ［ ( F0 － F) /F］对 lg ［Q］作图，直线斜率代表结合位点数 n，截距为结合常数 lgKA。
将 25 ℃、30 ℃下实验体系的测量数据用式 ( 2) 处理，如图 4 及表 1 所示。矢车菊 － 3 － O －葡萄
糖苷和 BSA相互作用时结合常数 KA随温度的升高变大，结合位点数 n 为 1。说明矢车菊 － 3 － O －葡萄
糖苷可与 BSA上的某一类结合位点发生结合。矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷与 BSA的结合常数 KA值均能达
到 104数量级，表明它与 BSA之间有较强的结合作用，可以被蛋白质运输和储存。
·181·第 2 期 王 海等: 矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷与牛血清白蛋白相互作用的光谱学研究
表 1 矢车菊 － 3 －O －葡萄糖苷与 BSA作用的结合常数 KA， 结合位点数 n和热力学参数
Table 1 Dinding constants ，binding numbers and thermodynamic parameters of Cy － 3 －O －Glu—BSA system
T /K KA / ( L·mol － 1 ) n R ΔH/ ( kJ·mol － 1 ) ΔG ( kJ·mol － 1 ) ΔS / ( J·mol － 1·K － 1 )
298
303
1． 1 × 105
1． 5 × 105
1． 1
1． 1
0． 9942
0． 9925
53． 24
53． 24
－ 28． 60
－ 30． 06
274． 6
274． 9
2． 3 矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷与 BSA的主要作用力类型
通常情况下，小分子与生物大分子的作用力类型包括氢键、范德华力、静电引力、疏水相互作
用［7］。根据反应前后热力学焓变 ( ΔH) 和熵变 ( ΔS) 的相对大小，可以判断小分子与血清白蛋白之间
的主要作用力类型。根据不同温度下小分子与蛋白质的结合常数，可由下列公式计算出热力学常数。温
度变化不大时，可以将作用过程的 ΔH、ΔS视为常数，依据热力学公式:
ln ( K2 /K1 ) = ( 1 /T1 － 1 /T2 ) ΔH /R ( 3)
ΔG = ΔH － TΔS = － RTlnK ( 4)
根据 25 和 30℃下的结合常数，可以计算出矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷和 BSA相互作用的热力学函数
值，结果见表 1，数据显示矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷和 BSA相互作用的过程是一个吸热熵增加的过程。
Ross等［7］根据大量实验结果总结了生物大分子与小分子作用力类型的热力学规律: ΔS ＞ 0 可能是
疏水和静电作用力，而 ΔH ＞0 同时 ΔS ＞ 0 为疏水相互作用力; ΔH ＜ 0 时则主要表现为静电作用力，可
以推测天竺葵素和 BSA之间的作用力为疏水相互作用。
2． 4 矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷与 BSA结合距离的计算
图 5 BSA荧光光谱 ( a) 和矢车菊 － 3 －O －葡萄糖苷的吸收光谱 ( b)
Fig． 5 The fluorescence emission spectra of BSA ( a) and the UV absorption spectra
of Cy － 3 －O －Glu ( b) CBSA = CCy － 3 －O －Glu = 2． 0 × 10 － 6 mol·L
－ 1
根据 Frster偶极 －偶极非辐射能量转移理论［8］，可以求出小分子与蛋白质分子中发射荧光的基团之间的
距离。距离越小，小分子越容易被蛋白质存储与转运。能量转移效率与给体 －受体间的距离 r的关系为
E = 1 / ［1 + ( r /R0 )
6］ ( 5)
能量转移效率 E为 50%时的距离称为临界距离 R0
R0
6 = 8． 8 × 10 －25K2n － 4ΦDJ ( 6)
式中，K2为供体 －受体各项随机分布的取向因子，n 为介质的折射指数，ΦD为给体的荧光量子产
率，J表示供体的发射光谱与受体的吸收光谱二者重叠积分。将式子变形整理得到:
J = ΣF ( λ) ε ( λ) λ4Δλ /ΣF ( λ) Δλ ( 7)
F ( λ) 为荧光受体在波长 λ处的荧光强度，ε ( λ) 为受体在波长 λ处的摩尔吸收系数。能量转移
效率 E可用 ( 8) 式计算:
·281· 山东农业大学学报 ( 自然科学版) 第 43 卷
E = 1 － F /F0 ( 8)
只要得到 E，K2和 n并通过测定光谱求出积分 J，就可以计算得到 R0与 r。
BSA的荧光光谱图和矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷的吸收光谱如图 5。用矩形分割法对该图中光谱重叠
部分的面积求和。求得光谱的重叠积分 J = 1． 104 × 10 －16cm3·L·mol － 1。
在上述实验条件下，取向因子供体受体各项随机分布的平均值 K2 = 2 /3，n 折射指数，取水和有机
物平均值 n = 1． 336，ΦD = 0． 118
［9］，将上述数值代入式 ( 6 ) 求得 R0 = 1． 6 nm。再通过矢车菊 － 3
－ O －葡萄糖苷与 BSA摩尔比为 1∶ 1 时络合物的荧光强度，通过 ( 8) 式计算得到能量转移效率 E = 0．
085。BSA的荧光主要来自于色氨酸残基 Trp214，计算得到它们的距离 r = 5． 6 nm，r 值均小于 7 nm，
符合非辐射能量转移理论。
2． 5 矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷对 BSA构象的影响
在蛋白质的同步荧光光谱中，Δλ = 15 nm时表现出酪氨酸残基的荧光光谱，Δλ = 60 nm时则表现出
色氨酸残基的荧光光谱。固定 BSA浓度逐渐增大矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷的浓度时，记录 Δλ = 15 nm
和 Δλ = 60 nm时的同步荧光光谱 ( 图 6 ) ，发现酪氨酸残基和色氨酸残基的最大发射波长基本保持不
变。这一结果表明，矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷的加入对酪氨酸残基和色氨酸残基的微环境影响小。
图 6 矢车菊 － 3 －O －葡萄糖苷 － BSA体系同步荧光光谱
Fig． 6 Synchronous fluorescence spectrum of Cy － 3 －O －Glu—BSA
cBSA = 2． 0 × 10
－6mol·L － 1 ; Cy － 3 －O －Glu /10 －6mol·L － 1，from 1 to 6: 0，0． 839，2． 52，4． 20，5． 87 and 7． 55
3 结论
研究结果表明，矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷对牛血清白蛋白的荧光存在猝灭作用，此荧光猝灭过程
是由于形成复合物而引起的静态猝灭，且都发生分子内的非辐射能量转移。依据热力学参数与作用力的
关系确定矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷与 BSA之间的作用力为疏水作用; 同步荧光光谱表明矢车菊 － 3 － O
－葡萄糖苷的加入对 BSA中酪氨酸残基和色氨酸残基的微环境影响小，BSA构象变化可忽略。
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·381·第 2 期 王 海等: 矢车菊 － 3 － O －葡萄糖苷与牛血清白蛋白相互作用的光谱学研究