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中国科学 B 辑:化学 2009 年 第 39 卷 第 2 期: 153 ~ 158
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《中国科学》杂志社
SCIENCE IN CHINA PRESS
矢车菊甙-辣根过氧化物酶-过氧化氢新体系及其在
酶联免疫传感分析中的应用
龚福春*, 李定中, 杨荣, 魏建科, 曹忠, 谭淑珍, 谭亚非
长沙理工大学化学与生物工程学院, 长沙 410004
* 通讯作者, E-mail: gfc139@yahoo.com.cn
收稿日期：2008-11-08; 接受日期：2008-12-09

摘要 以一种天然色素矢车菊素-3-葡萄糖苷(Cyanidin-3-glucose, CAG)为辣根过
氧化物酶(HRP)底物建立了矢车菊甙-辣根过氧化物酶-过氧化氢新体系. CAG在 540
nm处有一个吸收峰(AP1), 在 HRP催化下被 H2O2氧化, AP1降低; 同时, 其氧化产物
在 482 nm 处产生一个新吸收峰(AP2), 并且反应体系中两峰值的比值 R(AP2/AP1)与
HRP 量在一定浓度范围内呈线性相关.根据此原理, 以猪口蹄疫病毒蛋白(food and
mouth disease virus antigen, FMDVAg)为分析模型, 建立了检测猪口蹄疫病毒的酶联
免疫传感分析新方法. 该方法利用伴刀豆蛋白(Conconvalina, ConA)对糖蛋白的识别
特性固定HRP-猪口蹄疫病毒抗体连接物(HRP-FMDVAb), 由 ConA介导和磁性分离
实现了免疫反应特异性组分和非特异成分, 以及反应免疫磁性珠与没反应免疫磁性
珠的分离. 运用制备的传感体系测定猪口蹄疫病毒的线性范围为 1.5×10−8∼2.7×10−6
g/mL, 抗原检出限为 3.1×10−9 g/mL, 相对标准偏差为 3.7%(n=11). 底物 CAG及其产
物的水溶性好, 对人体无毒副作用, 在临床上可代替传统 HRP底物进行免疫检测.
关键词
矢车菊甙
HRP底物
酶联免疫传感
猪口蹄疫病毒


免疫分析是临床诊断、食品和药物分析以及环境
化学等领域中最常用的分析方法之一. 酶联免疫分
析将酶的催化放大作用和抗原抗体反应的专一性相
结合, 具有很高的选择性和灵敏度, 特别适合于低浓
度的样品和含有大量蛋白质、氨基酸、糖类等干扰物
的临床样品检测[1,2]. 辣根过氧化物酶(HRP)是广泛应
用于酶联免疫分析(ELISA)中的一种标记酶 [3], 鉴于
其优良特性, 已建立了各种光学酶联免疫分析[4,3]和
电化学酶联免疫分析等体系[6,7]. 酶免疫检测方法的
特征在很大程度上取决于所用的酶-底物系统. 传统
HRP 底物主要有邻苯二胺(OPD)、3,3,5,5-四甲替联
苯胺(TMB)、5-氨基水杨酸(5-AS)、联大茴香胺(OD)、
邻联苯甲胺(OT)、3,3-二氨基联苯胺(DAB)和 2,2-连
胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐(ABTS)等, 这些
底物存在如下不足：(1) OPD、TMB、5-AS、OD、
OT 及 DAB 的水溶性差, 其水溶液在空气中不稳定,
需新鲜配制[8]; (2) 多数酶催化产物水溶差, 不便于
比色定量测定, 例如组化法常用的 HRP 底物 3,3-二
氨基联苯胺盐酸盐(DAB), 其反应物由于形成的氧化
型中间体迅速聚合, 形成不溶性的棕色吩嗪衍生物[9],
只能用于染色定性测定; (3) 有的底物对人体健康有
害, 例如 OPD 可以使人体致癌[10]等. 因此,寻找更敏
感、稳定、安全无毒的 HRP 新底物对发展酶联免疫
分析方法具有重要意义.




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本课题组前期工作开发了几种性能优异的新底
物, 如白藜芦醇、2,3,5,4-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-
葡萄糖甙和 4-羟基苯乙烯基吡啶, 并分别将其应用
于酶联免疫反应体系测定不同的抗原抗体. 本文建
立了矢车菊素-3-葡萄糖苷(CAG)-辣根过氧化物酶-过
氧化氢新体系. 对新体系的紫外-可见光谱特性进行
了研究, 发现 CAG 及其氧化产物分别在 540 nm 和
482 nm 处有一个紫外吸收峰, 并且两峰值的比值 R
与 HRP 在一定浓度范围内呈线性相关. 以猪口蹄疫
病毒抗原蛋白(Foot and mouth disease virus, FMDVAg)
为分析模型, CAG为HRP底物, 建立了检测猪口蹄疫
病毒的酶联免疫传感分析新方法. 该方法利用伴刀
豆蛋白(Conconvalina, ConA)对糖蛋白的识别特性和
磁性分离同时实现了对 HRP-猪口蹄疫病毒抗体
(HRP-FMDVAb)固定, 以及免疫反应特异性组分和非
特异成分、反应免疫磁性珠与没反应免疫磁性珠分离.
该 CAG 及其氧化产物均有很好的水溶性, 储备液在
室温下稳定. 该体系可用于酶联免疫光度分析, 具有
操作简便、灵敏度较高、试剂稳定等优点.
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
样品的紫外-可见光谱测定在 Shimadzu UV-1601
PC 型紫外-可见分光光度计上进行.矢车菊素-3-葡萄
糖苷(CAG)、β -D-甲基葡萄糖苷和伴刀豆蛋白从
Sigma 公司获得; 邻苯二胺(OPD)、3,3,5,5-四甲替联
苯胺(TMB)、5-氨基水杨酸(5-AS)和 3,3-二氨基联苯
胺(DAB)购于中国医药集团上海化学试剂公司; 甲基
三甲氧基硅烷(MTEOS)从武汉大学试剂厂购买; 聚
乙烯亚胺(polyethyleneimine, PEI, Mn ~400)购自东京
化成株式会社; 猪口蹄疫病毒抗原(FMDVAg)和猪口
蹄疫病毒抗体(FMDVAb)为中国农业部青岛动物检疫
研究所龚振华副研究员赠品; Fe3O4 磁性纳米粒子(25
nm)由长沙理工大学物理与电子学院提供. 辣根过
氧化物酶标记猪口蹄疫病毒抗体(HRP-FMDVAb)按
文献方法[11]合成. 为本实验所用其他试剂均为国产
试剂.
1 mmol/L 矢车菊甙和 0.01 mol/L H2O2储备液：
称取 4.85 mg 矢车菊素-3-葡萄糖苷溶于 100 mL pH
6.8 的B-R缓冲液, 即得底物储备液; 将 0.28 mL 30%
H2O2 用 pH 6.8 的 B-R 缓冲液定容至 250 mL 制得
0.01 mol/L H2O2储备液.
1.2 矢车菊甙-辣根过氧化物酶-过氧化氢反应体
系测试
于10 mL的试管中加入 1 mL矢车菊甙储备溶液,
用 pH6.8的B-R缓冲液稀释至刻度, 在 35℃下分别加
入 0.2 mL 浓度为 2.00×10−3 mol/L H2O2和 2.00×10−3
mol/L H2O2+1.00×10−6 mol/L HRP-FMDVAb, 反应 1
min 后, 用 2 mol/L H2SO4终止反应. 在紫外-可见分
光光度仪上记录矢车菊甙溶液的紫外可见吸收变化
值 . 以邻苯二胺 (OPD)、 3,3,5,5- 四甲替联苯胺
(TMB)、5-氨基水杨酸(5-AS)和 3,3-二氨基联苯胺
(DAB)作为对照, 进行相同实验.
1.3 抗体在 PEI-Fe3O4 磁性微珠上的固定
PEI-Fe3O4 聚合物磁性微珠的制备参照文献[12]
进行：取 60 mL 质量分数为 2%的 PEI 溶液于三颈烧
瓶中, 在 N2 保护及快速搅拌下加入 15 mg Fe3O4纳米
粒子及 100 µL 1.5 N FeCl2, 搅拌混合, 加入 2.5 mL
质量分数为30%的H2O2, 同时进行紫外光照射, 反应
30 min. 反应完成后, 磁性分离, 用三蒸水清洗, 即
得 PEI 修饰的 Fe3O4 磁性微珠, 颗粒大小为 65 nm 左
右(图 1), 保存备用.
取 PEI-Fe3O4 磁性微珠 50 mg 于烧瓶中, 加入三
蒸水 15 mL 分散, 然后加入 3 mL质量分数为 2%的戊
二醛和 2 mL 质量分数为 0.5%的猪口蹄疫病毒抗体
(FMDVAb), 在 28℃恒温水浴条件下搅拌反应 45 min.
反应毕, 磁性分离, 用三蒸水清洗后, 将 FMDVAb 修
饰磁性纳米颗粒(FMDVAb-P)悬浮于 20 mL pH6.8 的
B-R 缓冲液中, 保存备用.



图 1 PEI-Fe3O4磁性微珠的扫描电子显微镜图
(a) 低倍; (b) 高倍




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1.4 猪口蹄疫病毒抗原传感体系的制备
按参考文献[13]利用溶胶-凝胶技术, 以四甲氧
基 硅 (TMOS) 和 γ- 氨 丙 基 甲 基 二 甲 氧 基 硅 烷
(APMDMOS)为前驱体制备一种氨基化硅胶基质. 并
以戊二醛为交联剂 , 利用该氨基化硅胶为载体对
ConA 进行交联固定化. 具体步骤: 一种含有 6.5 mL
甲基三甲氧基硅烷、1.5 mL γ-氨丙基甲基二甲氧基硅
烷、5.5 mL 水和 2 mL 0.05 mol/L HCl 的混合溶液经
超声振荡器超声分散 15 min 后, 室温放置水解 36 h,
获得约 7.1 g 硅溶-胶凝(sol-gel)泥. 取 5.0 g sol-gel 泥
填充于一根内径为 6 mm的 PVC管内, 制得一种含氨
基的硅胶支持棒, 在进一步胶化或老化后(28℃, 24 h)
可用于 ConA 的固定.
将上述硅胶棒开口一端的表面沾水, 在 Al2O3 砂
纸上打磨光亮后, 用 pH 6.8的B-R缓冲液冲洗. 取 50
µL 5%的戊二醛滴加在更新的表面, 室温放置 20 min,
用蒸馏水洗掉未反应的戊二醛, 然后将处理的硅胶
棒在浓度为 1.5×10−4 mol/L 的伴刀豆蛋白溶液中培
育 20 min, 冲洗后, 从而将伴刀豆蛋白固定在硅胶棒
上. 最后, 将伴刀豆蛋白修饰的硅胶棒在 5.5×10−6
mol/L HRP标记的猪口蹄疫病毒抗体(HRP-FMDVAb)
的溶液中 37℃培育 45 min, 用 pH 6.8 的 B-R 缓冲液
冲洗后, 即获得猪口蹄疫病毒抗原传感体(CoA-HRP-
FMDVAb).
1.5 酶联免疫传感分析程序
酶联免疫传感测定程序如图 2所示. 首先将猪口
蹄疫病毒抗原传感体在含待测 FMDVAg 和 FMDVAb
修饰磁性纳米颗粒(FMDVAb-P)的混合溶液中 37℃培
育 30 min 后, 用 pH6.8 的 B-R 缓冲液冲洗, 除去非特
异性吸附的 FMDVAg 和 FMDVAb-P.接着, 将免疫反
应后的硅胶棒在 5%的β-D-甲基葡萄糖苷溶液浸泡 15
min, 再用磁铁吸引脱附的 HRP-FMDVAb-FMDVAg-
FMDVAb-P, 用 pH6.8 的 B-R 缓冲液冲洗, 保存备用.
最后 , 进行酶反应和测定：将磁铁吸附的 HRP-
FMDVAb-FMDVAg-FMDVAb–P 固定于位于光路上
的流通反应池上, 将包含 6×10−4 mol/L 矢车菊甙底
物溶液泵入流通反应池, 测定 540 和 482 nm 两处的
吸光度, 接着加入 1.0×10−4 mol/L H2O2 并记录变化
了的吸光度, 计算两峰处吸光值的比值 R.



图 2 免疫分析程序






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2 结果与讨论
2.1 矢车菊甙-辣根过氧化物酶-过氧化氢反应体
系的特性
对矢车菊甙对 H2O2和 HRP-FMDVAb + H2O2响
应性能进行了研究.表 1 是矢车菊甙(CAG)、邻苯二胺
(OPD)、3,3,5,5-四甲替联苯胺(TMB)、5-氨基水杨
酸 (5-AS)和 3, 3－二氨基联苯胺 (DAB)对 HRP-
FMDVAb+H2O2及单独 H2O2 反应的紫外吸光度数据,
从表中可知, CAG 对单独 H2O2的响应比 OPD、TMB
和 DAB 小, 与 5-AS 相当; 但对 HRP-FMDVAb+H2O2
的响应值则与 TMB 和 DAB 相当, 比 5-AS 的值要大.
矢车菊甙溶液对单独 H2O2 响应小, 可以较好地降低
背景信号, 增加灵敏性; 对 HRP-FMDVAb 响应大,
说明酶对催化 CAG 氧化反应速率大,灵敏高.

表 1 加入 H2O2和 HRP-FMDVAb+H2O2后底物矢车菊甙
(CAG)、邻苯二胺(OPD)、3,3,5,5四甲替联苯胺(TMB)、
5-氨基水杨酸(5-AS)和 3,3－二氨基联苯胺(DAB)的紫外吸
收值变化率(∆A)
HRP 底物 a) 加 H2O2b) (∆A) 加 HRP/H2O2b)(∆A)
矢车菊甙 0.03 0.42
邻苯二胺 0.12 0.43
3,3,5,5四甲替联苯胺 0.11 0.39
5-氨基水杨酸
3, 3－二氨基联苯胺
0.04
0.12
0.16
0.44
a) 底物浓度均为 6×10−4 mol/L; b) H2O2 和 HRP-FMDVAb
的浓度分别为 3.5×10−3 和 1.2×10−7 mol/L, 反应时间为 2 min, 用 2
mol/L H2SO4 终止反应

对底物矢车菊甙最佳反应浓度及体系的 Km进行
了研究.底物矢车菊甙最佳反应浓度：加 3 mL pH 6.8
的 B-R 缓冲液于 10 mL 的试管中, 再加 50 µL
2.5×10−7 mol/L HRP 和 50 µL 1.00×10−4 mol/L H2O2,
最后加不同浓度的底物, 定容到 10 mL, 反应 2 min,
用 2 mol/L H2SO4终止反应, 测定吸光值. 由结果可知,
矢车菊甙浓度较低时, 底物浓度与可见吸收强度呈线
性关系, 当浓度大于 6×10−4 mol/L 时紫外吸收强度值
出现平台, 浓度达到 6.5×10−4 mol/L 时吸光值最大.
利用初速度法测定了 CAG-HRP-H2O2 体系的 Km
值. 反应条件同上, 取反应初速, 作ν-CCAG 图.由图上
任取几个点, 求其倒数, 用双倒数法作图, 得一直线.
该体系线性拟合方程为 1/ν = 5.7×10−13×1/CCAG+
3.5×10−3; 变异系数 r = 0.994, Vmax = 2.5×102 mol⋅s−1;
米氏常数 Km = 1.3×10−4mol/L. 由同样方法求得
3,3,5,5四甲替联苯胺(TMB)的 Vmax为 1.2×102 mol⋅s−1.
这说明 CAG-HRP-H2O2 体系比 TMB-HRP-H2O2体系
的反应速率大.
2.2 矢车菊甙及其产物的紫外-可见光谱特性及免
疫分析原理
对以 CAG 为 HRP 底物反应体系的紫外-可见光
谱进行了研究.图 3 是矢车菊甙及其 HRP 催化产物的
可见光谱, 由图可知, 底物在 540 nm 处有个吸收峰
(AP1), HRP催化H2O2氧化矢车菊甙, 生成的反应产物
在 482 nm 处有一个新的最大吸收峰(AP2), 并且随着
HRP 浓度增加, 吸收值(AP1)减少, 同时产物的吸收值
(Ap2)增加. 两吸收值之比值(Ap2/Ap1)R 与HRP的量在
一定范围内呈线性相关. 本酶联免疫分析方法通过
测定R 值来定量HRP, 进而间接定量测定猪口蹄疫病
毒抗原(FMDVAg)浓度.
由于本方法采用两峰的比值来定量 FMDVAg 克
服了传统直接测定酶产物吸收的方法易受背景信号
干扰大的问题,提高了分析的灵敏度.



图 3 CAG 及其 HRP 催化产物的可见光谱
a. 6×10−4 mol/LCAG+3.5×10−4 mol/L H2O2,以及 a 加入不同浓度的
HRP-FMDVAb: b. 1; c. 2; d. 4; e. 6 (×10−8 mol/L)

2.3 测定条件的选择
用底物 CAG 溶液在 540 nm 处的可见吸收强度
表示HRP-FMDVAb对CAG的催化活性. 根据吸收峰




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高低选择了 HRP-FMDVAb 催化反应缓冲液及其 pH.
对 B-R、HCl-Tris、Na2CO3-NaHCO3 、NaOH-H3BO3-
KCl 等几种缓冲液进行了比较, 结果表明：在 B-R 缓
冲液中, 响应较稳定.在 pH6.8 时, CAG 的吸收峰型好,
响应值最大.
对 CAG 和 H2O2 的浓度对酶联免疫反应的影响
进行了测试.结果显示, CAG 的浓度达到 6×10−4 mol/L
时, 可以得到最大的吸收响应值; H2O2 浓度为 3.5×
10−4 mol/L 时, 峰高变化最大, 超过此浓度后, 随着
H2O2浓度的增加, 峰高增加值变小, 这一现象体现了
H2O2既是 HRP 的底物又是其抑制剂的双重性.
鉴于免疫组分一般在动物体温下活力较好的特性,
所以, 传感体在免疫反应液的培育温度选择为 37℃.
考察了 HRP-FMDVAb 催化 CAG 与 H2O2反应的最适
温度.实验结果表明：反应温度在 30~40℃范围内, 吸
收响应较大. 本实验选择 37℃作为酶催化反应温度.
2.4 线性范围、检测限及 FMDVAg 的测定
按实验部分所述方法, 以 CAG 为HRP-FMDVAb
底物, 在所选择的最优条件下, 测得 R 响应值与猪口
蹄疫病毒蛋白抗原浓度在 1.5×10−8~2.7×10−6 g/mL
范围内呈线性关系, 其回归方程为: R＝0.031+42.8C
(g/mL), r2＝0.9983. 对浓度为 3.0×10−7 g/mL 的猪口
蹄疫病毒蛋白抗原连续进行 11 次平行测定, 得相对
标准偏差为 3.7%, 抗原检出限为 3.1×10−9 g/mL. 结
果表明 : 本体系的灵敏度稍优于诊断试剂盒所用
TMB 底物(5.4×10−9 g/mL), 而且所用底物矢车菊素-
3-葡萄糖苷比 TMB 更稳定, 无需避光保存.
2.5 样品回收测试
按照上述实验方法, 对猪口蹄疫病毒抗原蛋白
进行了回收率实验, 所得结果见表 2. 由表中数据可
以看出本方法稳定性和灵敏性均较好.
2.6 机理讨论
从花色苷的结构看, 由于共轭效应, 氧上的不成
对电子并不固定于氧原子, 而是靠近苯环, 从而削弱
氢氧键, 使羟基上氢原子活性提高, 易于脱去而成为
氢供体, 在植物体内是一种天然的抗氧化剂[14,15]. 矢
车菊素-3-葡萄糖苷是一种多酚类物质, 具有邻位的
羟基且数目较多.一方面有多次提供氢原子的能力,
另一方面其邻位羟基苯衍生物生成的苯氧基自由基
可在分子内部生成氢键而得到稳定, 还可以通过电
子转移, 形成稳定的化合物, 从而提高其活性. 在矢
车菊甙-辣根过氧化物酶-过氧化氢新体系中, 矢车菊
素-3-葡萄糖苷作为供氢体参与反应. 由实验结果和
相关工作可推测, 矢车菊素-3-葡萄糖苷在 HRP 催化
下被 H2O2氧化的机理如图 4:

表 2 样品回收数据
样品 起始浓度/mg⋅L−1 加入量/mg⋅L−1 回收量/mg⋅L−1 回收率(n=4) %
标准 10.00 1.50 1.48 098.7
FMDVAg 2.20 2.15 097.7
血清 00.00 1.70 1.67 098.2
4.00 4.05 101.3



图 4 HRP 催化矢车菊素-3-葡萄糖苷氧化反应机理





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3 结论
矢车菊素-3-葡萄糖苷及其产物水溶性好, 在空
气中稳定, 对光温度不敏感, 而对辣根过氧化物酶敏
感, 且无毒副作用, 是一种优良的 HRP 底物.将该新
HRP 底物运用于酶联免疫传感体系测定 FMDVAg,
结果表明：基于新底物的酶联免疫分析方法灵敏较
高、检测下限低、稳定性好. 以伴刀豆蛋白为介体能
较好固定 HRP-FMDVAb 连接物, 将伴刀豆蛋白对糖
蛋白的吸附-解脱特性与磁性纳米粒子的磁性结合可
以较好地解决酶联免疫传感体系免疫反应复合物-磁
性纳米颗粒与没反应磁性纳米颗粒的分离问题, 为
提高灵敏度开辟了一条有效途径.
致谢 本工作得到湖南省科技计划项目(批准号：2008SK3052)和湖南省教育厅科研项目(批准号：08B004,
07A006)资助.
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