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基于5-LOX体外代谢途径的火绒草抗炎活性部位筛选



全 文 :基于5-LOX体外代谢途径的火绒草抗炎活性部位筛选
姜 鸿,邹桂欣,王光涵,邸子真,尤献民*
(辽宁省中医药研究院,辽宁 沈阳110034)
摘 要:目的:筛选火绒草中的抗炎活性部位。方法:采用系统溶剂法按照极性由低到高的顺序分离得
到火绒草石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇萃取物、水提取物。采用酶联免疫法(ELISA)建立花
生四烯酸(AA)的5-脂氧合酶(5-LOX)体外代谢途径,检测火绒草提取物抑制5-LOX活性的能力。结
果:火绒草乙酸乙酯提取物对5-LOX活性有76.92%强度的抑制作用。结论:火绒草乙酸乙酯提取物具
有较强的抗炎活性,可作为潜在的抗炎活性成分筛选药物。
关键词:火绒草;抗炎;酶联免疫法;花生四烯酸;脂氧合酶
中图分类号:R285.5   文献标识码:A   文章编号:1673-2197(2015)06-0036-02
DOI:10.11954/ytctyy.201506016
收稿日期:2014-10-29
基金项目:国家科技重大专项:中药新药临床评价研究技术平台(2012ZX09303-017-001)
作者简介:姜鸿(1975-),男,辽宁省中医药研究院副研究员,研究方向为中药药效物质基础及中药新药研发。E-mail:jh0723
@126.com
通讯作者:尤献民(1964-),男,辽宁省中医药研究院研究员,硕士生导师,研究方向为药物分析及中药新药研发。E-mail:
youxianmin1120@126.com
Leontopodium Anti-inflammatory Active Site Selection Based on 5-LOX in Vitro Metabolic Pathways
Jiang Hong,Zou Guixin,Wang Guanghan,Di Zizhen,You Xianmin*
(Medical Research Institute of Liaoning Province,Shenyang 110034,China)
Abstract:Objective:To filtrate anti-inflammatory active site of leontopodium.Methods:The system solvent method is adopted
according to the polarity from low to high,the leontopodium petroleum ether extract and ethyl acetate extract,n-butanol extract and
water extract was isolated.Using ELISA,to establish the AA of 5-LOX in vitro metabolic pathways,detect leontopodium extracts in-
hibit the ability of 5-LOX activity.Results:The Ethyl acetate extract of leontopodium inhibits the 76.92%activity of 5-LOX.Con-
clusion:The ethyl acetate extract of the leontopodium has strong anti-inflammatory activity.
Keywords:Leontopodium;Anti-inflammation;ELISA;Arachidonic Acid;Lipoxygenase
  火绒草(Leontopodium leontopodioides(Wild.)Beauv
为菊科火绒草属植物的干燥全草,其味微苦,性寒,入肾、膀
胱二经,具有清热凉血、消炎利尿的功效。火绒草常用于治
疗炎症性疾病,对于流行性感冒、急慢性肾炎、尿路感染、尿
血、创伤出血等菌有一定的治疗效果。目前关于火绒草的
文献报道较多,但对其活性部位的筛选研究尚未有文献报
道。
炎症引发的疾病是人类常见的免疫系统疾病,医药市
场对抗炎药物的需求量极大。药理学研究表明,花生四烯
酸(arachidonic acid,AA),即5,8,11,14二十碳四烯酸,是
生物体内必需的一种不饱和脂肪酸,在炎症发生过程中起
着重要作用。在正常生理状态下,AA在生物体内主要以磷
脂的形式存在于细胞膜上,当细胞膜受到各种刺激,特别是
炎症反应发生时,在磷脂酶A(phospholipase A2,PLA2)和
磷脂酶C(phospholipase C,PLC)的催化下,磷脂从细胞膜
的磷脂池中释放出来,并在花生四烯酸代谢酶的作用下转
变为具有生物活性的代谢产物,进而发生花生四烯酸的炎
症级联代谢。目前研究表明,至少有环氧化酶(cycloxygen-
ase,COX)、脂氧合酶(1ipoxygenase,LOX)和细胞素P450
(cytochrome P450,CYP450)三类酶参与了 AA代谢途径,
主要的代谢通路为 COX 和 LOX。LOX 通路中至少有
5-LOX、12-LOX和15-LOX三种酶参与了AA代谢。其中,
5-LOX在激活蛋白(5-FLAP)的协助下催化 AA转化生成
白三烯(1eukotrienes,LTs)、脂质过氧化物,如在中性粒细
胞和其他炎症细胞中,LTA4由环氧化物水解酶(LTA4H)
催化生成LTB4;LTA4与谷胱甘肽结合转化为LTC4,而
LTC4转运至细胞外并裂解形成LTD4和LTE4。形成白
三烯的5-LOX通路在前炎症级联反应中起到重要作用,其
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中5-LOX、LTs、脂质过氧化物等分别是抗炎药物设计的重
点靶标。
本研究采用酶联免疫法(Enzyme-Linked Immuno Sor-
bent Assay,ELISA),借助AA的LOX体外生化代谢途径,
筛选火绒草的抗炎活性部位,现报道如下。
1 仪器与试剂
1.1 药品
火绒草药材提取物,由本实验室提供。
1.2 试剂
Tris-HCl(Trizma Pre-set crystals pH7.0-biotechn,Lot
No:11M5401),5-LOX(Lipoxidase Type V from soybean,
Lot No:91K7026V),AA(Arachidnic ACID free ACID from
porcine,Lot No:31M1213V),HRP(Peroxidase Type VI-1
from horseradish*PA,Lot No:90M77151V),以上试剂均
购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;TMPD(N,N,
N’,N’-Tetramethy-p-phenylenediamine dihydrochloride,
Johnson Matthey Company,Lot No:10119382);二甲基亚砜
(DMSO,色谱级),购自国药集团化学试剂有限公司。
1.3 仪器
Biotek酶联免疫检测仪(Elx800型,美国伯腾仪器有限
公司);DHZ-D冷冻恒温震荡器(江苏太仓市试验设备厂);
QL-901漩涡振荡器(江苏海门麒麟仪器厂);96孔板(美国
Comning公司)。
2 方法
2.1 提取物制备
取火绒草药材适量,加水提取,量取1/2提取液,减压
干燥至干,称定重量,粉碎成细粉,作为Ⅰ号提取物(火绒草
药材提取液);剩余提取液置于分液漏斗中,分别用石油醚、
醋酸乙酯、水饱和正丁醇各萃取5次,分别合并各自萃取溶
液,回收溶剂,减压干燥至干,称定重量,粉碎成细粉,分别
作为Ⅱ号提取物(石油醚层)、Ⅲ号提取物(醋酸乙酯层)、Ⅳ
号提取物(正丁醇层)。取经过上述溶剂萃取后的水溶液,
浓缩并减压干燥至干,称定重量,粉碎成细粉,作为Ⅴ号提
取物(剩余水层)。
2.2 方法
2.2.1 原理 花生四烯酸(AA)可被脂氧合酶(5-LOX)催
化氧化生成5-羟基过氧四烯酸,辣根过氧化酶(HRP)可以
5-羟基过氧四烯酸和四甲基对苯二胺盐酸(TMPD)为底物
生成一种可在610nm处产生吸收的物质。
2.2.2 试剂配制 Tris-HCl:0.1mol·L-1,pH7.0;5-LOX:
用前将其稀释至360μL,每次用量10μL,使其终浓度为
1μg/孔;AA:采用95%乙醇将原液配置成浓度为21mmol·
L-1的储备液,用时稀释30倍,每次用10μL,终浓度为33.
33μmol·L
-1;HRP:配置13.9mg/mL储备液,置于低温下
保存,用时稀释20倍;TMPD:配制成28mg/mL储备液,置
于低温下保存,用时蒸馏水稀释10倍。样品制备:将提取
物溶解于DMSO中,制备成含200mg/mL生药的储备液。
2.2.3 操作步骤 ①空白:180μL Tris-HCl、10μLHPR;
②控制池:170μL Tris-HCl、10μL 5-LOX、10μLHPR;③N:
160μL Tris-HCl、10μL待测药物、10μL 5-LOX、10μLHPR;
④小心振摇酶标板使溶液混匀,37℃孵育10min;⑤每个池
加入10μL TMPD,再加入10μL花生四烯酸以激活反应,小
心振摇酶标板数秒钟使溶液混匀,在25℃下孵育15min。
采用酶标仪于610nm波长处测定吸光度,以上试验重复操
作5次,计算吸光度平均值。
2.2.4 计算方法 实验结果采用均值加减标准差(珚x±
SD)表示,以未加样品所测得的A值为100个活力单位,相
对酶活力(%)=(AN-Ablank)/(Acontrol-Ablank)×100%。
3 结果
从表1结果可以看出,Ⅲ号提取物抑制了76.92%
5-LOX的活性,为5个提取物中5-LOX活性抑制作用最强
的,其次为Ⅰ号提取物(57.69%)和Ⅳ号提取物(43.85%),
Ⅱ号提取物对5-LOX的抑制作用很弱(15.38%),Ⅴ号提取
物对5-LOX几乎没有抑制作用。由此可知,火绒草中具有
抗炎作用的部位主要为Ⅲ号提取物,即乙酸乙酯提取物;Ⅰ
号提取物(火绒草药材提取液)的抗炎作用次于Ⅲ号提取
物,可能是由于Ⅰ号提取物是火绒草药材原提取液,所含成
分复杂,一些杂质成分干扰活性成分的抗炎效果;Ⅳ号提取
物,即正丁醇提取物,也有一定的抗炎作用,仅次于Ⅰ号提
取物,说明Ⅳ号提取物中也可能含有一些具有抗炎活性的
成分,或者这些成分是和Ⅲ号提取物共有的。基于以上结
果,笔者将进一步对Ⅲ号、Ⅳ号提取物进行研究,寻找火绒
草药材中具有抗炎活性的单体化合物。
表1 样品吸收度及相对酶活力 (珚x±s)
项目 空白 控制池 Ⅰ号提取物 Ⅱ号提取物 Ⅲ号提取物 Ⅳ号提取物 Ⅴ号提取物
吸收度(n=5) 0.103±0.003  0.132±0.004  0.115±0.002  0.133±0.004  0.111±0.003  0.128±0.002  0.154±0.005
相对酶活力(%) - - 42.31  84.62  23.08  56.15  96.15
抑制率(%) - - 57.69  15.38  76.92  43.85  3.85
4 讨论
4.1 DMSO对实验结果的影响
由于火绒草提取物中含有脂溶性和水溶性两种成分,
为使提取物完全溶解,故采用DMSO作为溶媒,并分别配制
含有不同浓度的DMSO缓冲液,按相同的实验方法进行测
定。结果显示,DMSO浓度对测定结果的影响很小,各组间
比较无显著差异,但为使实验结果更加科学、真实,实验中
应使DMSO浓度保持一致。
4.2 测定时间对实验结果的影响
TMPD易被氧化,其水溶液在空气中就可被缓慢氧化
成蓝色,蓝色的深浅程度与所检测的酶活性具有良好的线
性关系,因此可用于检测抑制剂的活性。但空气中也可能
含有具有一定氧化能力的物质,因此确定最佳测定时间点
为本实验的关键。本研究按照上述测定方法,在0~60min
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黄芪炮制方法历史沿革及研究进展
王文兰,陶 波
(宁夏医科大学附属回医中医医院,宁夏 吴忠751300)
摘 要:黄芪历代炮制方法丰富多样。查阅从汉代至今关于黄芪炮制方法的相关文献,对其炮制历史沿
革进行归纳,总结其炮制方法研究进展,为系统性研究黄芪的炮制工艺、探讨其炮制原理提供参考依据。
关键词:黄芪;炮制;历史沿革;研究进展
中图分类号:R283   文献标识码:A   文章编号:1673-2197(2015)06-0038-03
DOI:10.11954/ytctyy.201506017
收稿日期:2014-10-31
作者简介:王文兰(1988-),女,回族,宁夏医科大学附属回医中医医院药师,研究方向为中药制剂。E-mail:ningxiatongxin@
126.com
  黄芪是中医常用补气药,始载于《神农本草经》,被列为
上品,其味甘,性微温,归肺、脾两经,具有补气固表、利尿、
脱毒排脓、收敛生肌等功效[1]。《中国药典》收载的黄芪为
豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch).Bge.
var.mongholicus (Bge.)Hsiao或膜荚黄芪 Astragalus
membranaceus(Fisch)Bge.的干燥根。在临床用药中,历代
医家都非常注重黄芪的炮制工艺。黄芪入药有去芦、切制、
炙制、炒制、盐制、酒制、煮制、蒸制、蜜制、醋制、酥制、辅药
汁制等多种炮制方法。为继承和发扬传统黄芪炮制经验,
笔者通过查阅从汉代至今的黄芪炮制相关文献,
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对其炮制
内动态考察样品与纯TMPD吸收度在不同时间段的比值,
以此确定其最终测定时间。本实验结果表明,在15min时
两者的比值最大,因此确定最佳测定时间为15min。
4.3 测定样品终浓度对实验结果的影响
测定样品终浓度对测定结果影响很大,当样品溶液终
浓度过高时,反应体系颜色明显变浅,但吸光度值很大,甚
至超过控制池的限值,会造成样品几乎没有抑制5-LOX活
性作用的假象,且每次实验结果的重复性很差。通过对样
品系列浓度考察发现,以提取物中对5-LOX活性抑制作用
最强的Ⅲ号提取物为准,样品最佳终浓度为200mg/mL,每
次加10μL,测定结果重复性较好,5个提取物的变异系数在
1.06%~1.82%之间(n=5),实验重复性良好。
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(责任编辑:尹晨茹)
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