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HPLC-ELSD法测定珠子参根茎中新化合物24(R)-珠子参苷R_1的质量比



全 文 : 第52卷 第5期 吉 林 大 学 学 报 (理 学 版 ) Vol.52 No.5
 2014年9月 Journal of Jilin University(Science Edition) Sep 2014
doi:10.13413/j.cnki.jdxblxb.2014.05.44
HPLC-ELSD法测定珠子参根茎中新化合物
24(R)-珠子参苷R1的质量比
王加付1,2,彭 绍1,李兰杰1,杨 洁1,孙 婷1,李绪文1,金永日1,时晓磊1,3
(1.吉林大学 化学学院,长春130012;2.黑龙江烟草有限责任公司,哈尔滨150001;
3.吉林大学 军需科技学院,长春130062)
摘要:采用高效液相色谱蒸发光散射法(HPLC-ELSD)测定珠子参根茎中新化合物24(R)-珠
子参苷R1 的质量浓度.色谱条件为:Aglilent Zorbax SB-C18(ODS,4.6mm×250mm,
5μm)色谱柱,流动相V(甲醇)∶V(水)=58∶42,流速1.0mL/min,柱温25℃,载气压力
1.94×105 Pa,漂移管温度85℃,撞击器关闭,进样量20μL.结果表明:在0.40~20.0μg
内,24(R)-珠子参苷R1 线性关系较好,r=0.999 3(n=6);24(R)-珠子参苷R1 的平均回收
率为98.7%,RSD=1.28%(n=6).
关键词:24(R)-珠子参苷R1;高效液相色谱蒸发光散射法;质量比
中图分类号:R917;O657.7  文献标志码:A  文章编号:1671-5489(2014)05-1095-05
Determination of New Compound 24(R)-Majoroside R1in
Panax japonicus C.A.Mey.var.Major(Burk.)C.Y.Wu
et K.M.Feng by HPLC-ELSD
WANG Jiafu1,2,PENG Shao1,LI Lanjie1,YANG Jie1,SUN Ting1,
LI Xuwen1,JI Yongri 1,SHI Xiaolei 1,3
(1.College of Chemistry,Jilin University,Changchun130012,China;
2.Heilongjiang Tobacco Limited Liability Company,Harbin150001,China;
3.College of Quartermaster Technology,Jilin University,Changchun130062,China)
Abstract:The determination of the new compound of 24(R)-majoroside R1in Panax japonicus C.A.
Mey.var.Major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.Feng was developed by HPLC-ELSD method.The
conditions of chromatography were Aglient Zorbax SB-C18Column(ODS,4.6mm×250mm,5μm)
was adopted;mobile phase was composed of V(methanol)∶V(water)=58∶42;flow rate was set at
1.0mL/min;temperature of column was set at 25℃;carrier gas pressure was set at 1.94×105 Pa
tube temperature of ELSD was set at 85℃;impactor was set in closed state.As the results show in
the range of 0.4—20.0μg,the linearity of 24(R)-majoroside R1is good,r=0.999 3(n=6),the
average recovery was 98.7%,and RSD=1.28% (n=6).
Key words:24(R)-majoroside R1;high performance liquid chromatography-evaporative light
scatteringdatection(HPLC-ELSD);mass ratio
收稿日期:2013-10-24.
作者简介:王加付(1985—),男,汉族,硕士研究生,从事天然植物化学成分及化学分析方法的研究,E-mail:wangjiafu09@163.
com.通信作者:时晓磊(1982—),女,汉族,博士,讲师,从事小分子与生物大分子作用光谱学的研究,E-mail:xlshi@jlu.edu.cn.
基金项目:教育部博士学科点新教师基金(批准号:20120061120116).
  珠子参为五加科植物珠子参(Panax japonicus C.A.Mey.var.Major(Burk.)C.Y.Wu et K.M.
Feng)的干燥根状茎,具有补肺、养阴、活络和止血的作用,用于治疗气阴两虚、烦热口渴、虚劳咳
嗽、跌扑损伤、关节疼痛、咳血、吐血和外伤出血等症.珠子参广泛分布于云南、贵州、湖北和四川等
地[1],生长于阴湿的针阔叶林、阔叶灌木、竹叶林以及杂灌丛中.目前,珠子参根茎的化学成分[2-5]和
药理作用[6-9]研究较多,其化学成分测定[10-11]主要集中在质量浓度较大的皂苷竹节参皂苷Ⅳa和竹节参
皂苷Ⅴ.本文采用高效液相色谱蒸发光散射法(HPLC-ELSD)测定珠子参根茎中新化合物24(R)-珠子
参苷R1 的质量比[12].
1 材料与方法
1.1 样品与试剂
珠子参分别购于云南省昆明市和河北省安国市,经吉林大学药学院张静敏教授鉴定为珠子参的干
图1 化合物24(R)-珠子参苷R1 的结构式
Fig.1 Chemical structure of 24(R)-majoroside R1
燥根茎;实验用水为二次蒸馏水;甲醇为色谱纯;
化合物24(R)-珠子参苷 R1 对照品自制,经质谱
(MS)、红外光谱(IR)、核磁共振氢谱(1 H NMR)
和核磁共振碳谱(13 C NMR)等方法表征样品结构,
按 HPLC-ELSD色谱条件归一化测定样品的质量
分数为98.85%,其化学结构如图1所示.
1.2 仪 器
Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent
公司);Altech 2000型蒸发光散射检验器(美国
Altech公司);RE-201C型旋转蒸发仪(巩义市英
峪予华仪器厂);Mettlertoledo AG135型电子天平
(德国Startorius YDO-OIR公司);KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器公司).
1.3 对照品的分离纯化
将珠子参根茎80%的乙醇粗提取物(约1.4kg)用洗脱剂V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(水)=
20∶1∶0.05进行硅胶柱层析.经薄层色谱(TLC)检测可得A,B,C,D 4个极性不同的部分.将B部分
用洗脱剂V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(水)=10∶1∶0.05进一步硅胶柱纯化、合并并浓缩,得到B1
和B2两部分.将B1部分用V(甲醇)∶V(水)=1.5的溶剂进行ODS柱层析,分离得到对照品70mg.
1.4 对照品溶液的配制
称量对照品约10.12mg,置于10.00mL容量瓶中,以甲醇溶解、定容,得1.00mg/mL对照品
储备液.将2.0mL储备液置于10.00mL容量瓶中,用甲醇定容,得0.2mg/mL对照品溶液.
1.5 供试品溶液的制备
将干燥的珠子参粉碎,过60目筛,精密称取2.0g,用16mL甲醇作为提取溶剂,连续回流3次,
回流时间依次为1.5,1.0,1.0h,合并提取液并用旋转蒸发仪蒸干,以甲醇溶解,并定容至10.00mL,
过0.22μm有机滤膜,取续滤液.
1.6 色谱条件
Aglilent Zorbax SB-C18(ODS,4.6mm×250mm,5μm)色谱柱;流动相为甲醇和水,等度洗脱,
体积比为58∶42;流速为1.0mL/min;柱温为25℃;载气压力为1.94×105 Pa;漂移管温度为
85℃;撞击器关闭;进样量为20μL.将对照品溶液(质量浓度为0.2mg/mL)和供试品溶液各20μL
置于高效液相色谱仪进行测定.
2 条件优化
2.1 ELSD条件选择
经紫外光谱测定,24(R)-珠子参苷R1 在200~400nm无吸收,因此选择ELSD作为检测器.对
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ELSD的检测条件进行优化,确定其条件为:载气压力1.94×105 Pa;漂移管温度85℃;撞击器关闭.
2.2 流动相选择
采用不同体积比的甲醇和水及乙腈和水作为流动相,通过比较色谱可见:采用乙腈和水作为流动
相,待测化合物与样品中的其他化合物无法达到基线分离;采用V(甲醇)∶V(水)=58∶42作为流动
相可使混合物达到较好的分离效果 (分离度 >1.5),且保留时间为 14.2 min,因此采用
V(甲醇)∶V(水)=58∶42作为流动相.
2.3 提取条件的选择
2.3.1 提取溶剂选择 将干燥的珠子参粉碎,过60目筛,称取2.0g,分别选乙酸乙酯、乙醇、体积分
数为80%的乙醇及甲醇为提取溶剂,连续回流3次,合并、浓缩提取液,置于10.00mL容量瓶中,分别
用色谱甲醇溶解、定容,过0.22μm有机滤膜,取20μL续滤液置于高效液相色谱仪进行测定,结果列于
表1.由表1可见,甲醇的提取效率最高,乙酸乙酯的提取效率最低,因此选择甲醇作为提取溶剂.
表1 不同提取溶剂所得24(R)-珠子参苷R1 的峰面积
Table 1 Peak areas of 24(R)-majoroside R1extracted by different extraction solvents
提取溶剂      24(R)-珠子参苷R1 的峰面积/a.u.
乙酸乙酯 98 928
甲醇 1 112 452
乙醇 1 050 504
φ(乙醇)=80% 1 036 583
2.3.2 提取溶剂用量选择 将干燥的珠子参粉碎,过60目筛,精密称取2.0g,将甲醇作为提取溶
剂,考察每次提取用量为12,16,20mL时对待测物峰面积的影响,通过加热回流的方式提取3次,分
别用色谱甲醇定容至10.00mL,过0.22μm有机滤膜,取20μL续滤液置于高效液相色谱仪测定.结
果列于表2.由表2可见,当甲醇用量为16mL时,所得待测物的峰面积较大,因此甲醇的用量
为16mL.
表2 提取溶剂不同用量所得24(R)-珠子参苷R1 的峰面积
Table 2 Peak area of 24(R)-majoroside R1extracted at different solvent volumes
提取溶剂用量/mL  24(R)-珠子参苷R1 的峰面积/a.u.
12  921 260
16  1 126 026
20  1 125 125
2.3.3 提取次数的确定 将2.3.2中提取过3次的样品,继续提取1h,按1.5方法进行处理,经
HPLC-ELSD测定,没有待测物检出,故提取次数确定为3次.
综上,确定提取条件为:将干燥的珠子参粉碎,过60目筛,精密称取2.0g,分别用16mL甲醇连
续回流3次,回流时间依次为1.5,1.0,1.0h,合并、浓缩提取液,以甲醇溶解,并定容至10.00mL.
最佳条件下提取的24(R)-珠子参苷R1 对照品和样品的色谱如图2所示.
图2 24(R)-珠子参苷R1 对照品(A)和珠子参样品(B)的色谱
Fig.2 HPLC chromatograms of reference substances(A)and sample(B)of 24(R)-majoroside R1
7901 第5期   王加付,等:HPLC-ELSD法测定珠子参根茎中新化合物24(R)-珠子参苷R1 的质量比   
3 方法与结果
3.1 线性关系考察
按照1.4方法制备1.00mg/mL对照品储备液,精密移取0.20,0.50,1.00,2.00,5.00mL储备液
分别置于10.00mL容量瓶中,加色谱甲醇定容,得系列标准溶液,分别吸取标准溶液及对照品储备液
20μL置于高效液相色谱仪,平行测定3次,取平均值;以对照品进样量的lg m值为x轴、对照品峰
面积的lg S值为y轴做标准曲线,24(R)-珠子参苷R1 的回归方程为
lg S=1.317 7lg m+1.760 5,  r=0.999 3,
其线性范围为0.40~20.0μg.
3.2 精密度实验
将质量浓度为0.1,0.2,0.5mg/mL的对照品溶液各20μL置于高效液相色谱仪中,分别连续进
样6次(日内精密度),测得24(R)-珠子参苷R1 峰面积的RSD值分别为0.27%,0.52%和0.17%.连
续进样3d,每天进样2次(日间精密度),测得24(R)-珠子参苷R1 峰面积的RSD值分别为1.37%,
1.61%和1.18%.
3.3 重复性实验
按1.5方法操作,制得6份供试品溶液,分别吸取20μL注入高效液相色谱仪进行测定,结果表
明,24(R)-珠子参苷R1 质量浓度的RSD=0.96%(n=6).
3.4 稳定性实验
按1.5方法制备供试品溶液,分别于0,2,4,6,8,10h按上述色谱条件进样测定,结果表明,
24(R)-珠子参苷R1 峰面积的RSD为1.71%,供试品在10h内完成测定即可.
3.5 加样回收率实验
将干燥的珠子参样品粉碎,过60目筛,精密称取2.0g(化合物24(R)-珠子参苷R1 的质量分数为
0.045 3%),共6份,每份均加入0.9mg的对照品,按1.5方法制备6份加标供试品溶液.对其质量
浓度进行测定,测得24(R)-珠子参苷R1 的平均回收率为98.7%,其RSD=1.28%(n=6).
3.6 样品的测定
将分别购于河北省安国市和云南省昆明市的珠子参样品按1.5方法进行处理,分别取质量浓度为
0.2mg/mL的对照品溶液及2份样品溶液各20μL置于高效液相色谱仪中,分别连续进样3次,记录
峰面积,测得河北省安国市和云南省昆明市的珠子参根茎中24(R)-珠子参苷 R1 的质量比分别为
3.06mg/g和0.45mg/g.
综上,本文采用 HPLC-ELSD方法测定了不同产地珠子参根茎中新化合物24(R)-珠子参苷R1 的
质量比,并对其方法学进行了考察.结果表明,该方法可准确、快速测定珠子参中24(R)-珠子参苷R1
的质量比,重复性及回收率较好,方法可靠.
参 考 文 献
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(责任编辑:单 凝)
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