全 文 ：研究报告 声西翌理
用高碘酸钠氧化法制备多管藻 R一 藻红 蛋白和钝顶螺旋藻 C -
藻蓝蛋 白的共价交联物
马圣媛 王广策 * 曾呈奎
( 中国科学院海洋研究所实验海洋生物学开放实验室 青岛 2仅刃 1 7)
提要 从海洋红藻多管藻 ( o Pl s r勿彻n ia
~
l a t) a和蓝藻钝顶螺旋藻 (助￡耐￡n a pa he o) s i中分
别纯化了 R -藻红蛋白和 C -藻蓝蛋白 , 然后用高碘酸钠氧化法将二者共价连接 。 交联反应液经
se 户ad ex 0 20 凝胶过滤纯化共价交联物 。 光谱分析表明 ,共价交联体内部存在着从 -R 藻红蛋
白到 G 藻蓝蛋白的能量传递 。
关键词 多管藻 ( oP lxs 动彻瓜 a ~
z
口招 ) , -R 藻红蛋白 ,钝顶螺旋藻 f SP ir诚an p hae o is ) , -C 藻蓝蛋白 ,高碘酸钠氧化交联法 ,共价交联物 ,光谱分析
中图分类号 Qsl 文献标识码 A 文章编号 1〕沉卜3o 6( 2朋3 )0吕0 5-2 04
藻胆蛋白是一类具有强烈荧光的水溶性的捕光
色素蛋白 , 目前已知的藻胆蛋白主要分布在蓝藻 、 红
藻 、 隐藻和少量甲藻中 , 主要分为 4类 : 藻红蛋白、 藻
蓝蛋白 、 别藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白。 藻胆蛋白是一类
寡聚体蛋白 , 基本构建单位是 a 和 俘亚基 , 在藻红蛋
白中还存在 了亚基 〔` !。 每种亚基是由脱辅基蛋白和开
链的四毗咯色基通过硫醚键共价交联 , 目前已鉴定的
色基也有 4 种 : 藻红胆素 、 藻蓝胆素 、 藻尿胆素和藻紫
胆素 〔2 ’ 。
藻胆蛋 白种类多 、 荧光强 、 量子产率高 , 因而有着
广泛的应用 , 如用作食品和化妆品的添加剂 、 肿瘤光
动力治疗中的光敏剂 3I] 等 , 但最多的还是用作藻胆蛋
白荧光探针 ,应用于医学诊断 ,动 、植物检疫 ,免疫学 ,
细胞生物学和分子生物学等方面 , 尤其是在表面抗原
的研究中 , 可替代酶标 、 放射性同位素等。 另外 ,藻胆
蛋白种类很多 , 斯托克 ( S toc k S )位移大 , 共价交联物之
间又存在能量传递 , 可对细胞表面做多色分析 4[] 。 目
前国外的一些公司 (如 iS g m a 公司等 ) 已有相关产品
出售 。
藻胆蛋白荧光探针制作的关键在于摸索简易 、 可
靠和有效的蛋白质交联方法 , 原理一般是利用交联剂
与蛋白质表面的活性基团反应产生共价连接 。但交联
剂对藻胆蛋白的荧光在一定程度上有淬灭作用 5l[ , 所
以选择合适的交联剂并且确定其用量是有必要的 。 以
前作者以戊二醛为交联剂 , 构建了多种藻胆蛋白共价
体 16 一 ’“ ’ , 共价交联和共价体的能量传递效率都有待提
高。 本文报道了一种新的藻胆蛋白交联方法 , 即高碘
酸钠氧化法 , 用于多管藻 -R 藻红蛋白和钝顶螺旋藻
G 藻蓝蛋白的共价交联 。
1 材料和方法
1
.
1 材料
多管藻 。 b妙,妙朋艺a !rtL 浓 o l a忿a )采自青岛汇泉湾 ,
螺旋藻 (助i耐 ina p lat e ns 司粉购自东营鲁胜公司 。
1
.
2 藻胆蛋白的分 离纯化及鉴定
藻胆蛋白的纯化采用羚基磷灰石法 , 具体操作
见文献 1 1 1 ] , 并通过吸收和荧光发射光谱鉴定 -R 藻
红蛋白 ( RP E )和 C一 藻蓝蛋白 ( C代 ) 。
测定藻胆蛋白在可见光区的特征吸收峰值 , 根据
助m 比 d , B e r 定律 ,计算藻胆蛋白的浓度 。查得 -R 藻红
蛋白的摩尔消光系数 。 ( 565 lun , l gm / mL ) = 8 . 17 , G
藻蓝蛋白的摩尔消光系数 。 (6 20 nl , l gm / mL ) =
7
.
65 ( iS g
n a 公司 19 7年产品目录 ) 。
吸收光谱采用岛津 U丫24 0 型扫描式分光光度
计 , 吸收池的光径 1 C ;m 室温荧光发射光谱用 日立
第一作者 : 马圣媛 , 出生于 19 76 年 , 硕士 ,研究方向为 : 藻类
生理学与生长发育的人工调控。 E们面卜 s yn 坦 @ nsI .叫10 . ` . c n
* 联系人
收稿 日期 : 2X( 〕如的旧;3 修回 日期 : 2X() 么 1 1如
函 海洋科学 / 2X() 3 年 /第 27 卷 /第 8 期
研究报告 尺男处四
一
8 50型荧光分光光度计 , 激发光和发射光的狭缝均为
5 r l ll l
。
1
.
3 高碘酸钠交联 R l〕 E 和 CCP 及交联物
R PE毛CP 的分 离纯化
RP E 和 C咒 的交联参见文献 〔121 , 具体方法如
下 : 0 . 4 毗 B甩 ( 0 . 1 m ol / L N aH CO 。 ) 中逐滴加 20
~
1几 NaI O ` (双蒸水 ) 0 . 63 毗 ,室温避光搅拌反应 2
h
,加 o . 4 mL e代 ( 0 . 1咖 l几 Na CH o 3 ) ,再加人 2 . 23 gm
干燥的 se 户ad ex 0 25 , 上述条件反应 3 h , 离心去掉
eS phad ex 倪 5 。 最后加 s n lg /献 N扔H 4 ( 0 . 1 mo l / L
N ao )H 0
. 价 mL , o . s h后再次加 5吨 / 毗 N aB H 4 O . 2
mL
, 反应 l h , cS 址f 碱可还原为稳定的交联物 。
同时 , 取相同数量的 RP E 和 CCP 作为对照 , 进
行上述反应 , 只是以相同体积的双蒸水和 0 . I n如。 1/ L
N a 0 H 代替 N aI O `和 NaB H 4。
吸收和荧光发射光谱检测交联情况 。
交联物的分离使用 s 甲卜a dex G Z〕 〕凝胶过滤 ( 70
58 5
x z
.
6
Cm )
. 以 0 . X() z mo z几磷酸盐缓冲液 ( pH 6 . s . o . 2
mo l几 N a cl )平衡和洗脱 。
2 结果
2
,
l 藻胆蛋白的特性鉴定
R正王 和 C代 的吸收光谱和荧光发射光谱如图
1
。
Rp E 在可见光区的特征吸收峰有 3 个 , 分别在 49 8
。 、 53 5 nl 和 5 6 5 nm 处 , 荧光发射峰约位于 585 nm ;
而 C代 的特征吸收峰只有 l个 ,位于 620 lun 附近 ,荧
光发射峰约处于 64 5 nm 。 这与文献 〔11 的报道相符 。
根据测得的特征吸收值计算得出 , 用于交联
的 R PE 和 c代 的浓度分别为 16 . % mg / nrL 和 16 . 47
mg /
n 1L
o
2
.
2 交联物 R PE一 PC 的制备及其特性分析
高碘 酸钠 交联反应液 和对照 以及分离后 的
甩犯毛CP 的吸收光谱如图 2 , 反应前后吸收光谱差异
非常明显 , 尤其是 R P E 和 CCP 的峰形和峰高均变化
很大 , 如 R p E 3 个特征吸收峰的峰高比值发生变化 ,
反应前 0 D 56 , : 0 D 53 , : OD。 :为 1 . 2 8 : 2 . 09 : 2 . X() , 而
反应后变为 0 . 09 : 1 . 03 : 1 . 0 。 纯化后共价交联体
R I
〕
E城二民 的吸收光谱中 , R PE 的特征峰则完全消失 ,
仗 X) n m 处出现了新的峰值 。 相 比之下 C代 吸收峰的
变化较少 , 62 0 nl 附近始终有吸收肩 , 只是反应后变
得不明显 , 而纯化后又可清楚辨认 。 这些可 以说明高
6 4 5
仁、、、 、、丫 //6 2 0
。 A队
,
。 ’ 3
} \ 礴
声
鬓“ ` 2{
一
\ \ 少?
。 1
{
、 、 ,厂“
铡燃未似反罕
5043210
一
\ , 、一
气泣叹
5 3军
5 6 5
八6 0 0
l
l
产
I
, /
尸尸
6420闷甘.0以仓
姿澎反罕
3 0C
矛ó
、、t、、、、 \、、 、、户,了`,|万才,`、几`
11,,
、 、鄂
6 0 0
波长 n/ m
荔。 。 ·编 5 0 0 6 0 0 7 0 0波长 /n m
图 I -R 藻红蛋白和 G 藻蓝蛋白的吸收和荧光发射光谱
F ig
.
1 hT
e ab so prt i
o n 印 “ I lu 毗 sc en e e e而 s s i o n 印 e e比
of R ,资w e oe 巧 dl ir n an d饰场〔嘴丫 Zyan in— 吸收光谱 ; 一 荧光发射光谱 ( E P E: E x 二 498 二 ; c代 :E x = 6 18。 )
A
. 耳 藻红蛋白 ; B . G 藻蓝蛋白
— 汕劝印 t io n s卿 atr of R p l: 田 ld C`气二;一 目朋嘟二e o e~幼 nD 5 1联 l扭 of Rp E aZ l d C日 : (班飞 : E x 二 498 mn ; C咒 : E x 二 6I 8 ln )
A
,
BP E : B
.
C民
图 2 高碘酸钠氧化法交联 印〕E 和 C代: 的吸收光谱
月 9 . 2 hT e ab s 。几〕t jon sP ec 加 of c onj u 邵le of R l犯 出 1〔 I C代
wi ht P eir 记二e a e id , x j l帅
一 刊钾E 和 口 { 交联反应对照 ;— 旧P E 和 叹1℃ 交联反应样品 ;-一 决 p h耐 ex G ZX() 纯化的 B P曰二CP
一 ht e co n园 of o nJ l lg , t e of R】〕 E an d C代 ; — ht e侧 ,钊 u脚 e of 用 IE 田 l d CCP ; - · 一 碑面 6曰 班压执〕叹: a n e r a
G Z创〕 e o l l lll l n
M丽 n e S e ien e e s /叩 0 1. 2 7 . N o . 8 2/ X() 3
研究报告 几男处四
碘酸钠交联 RP E和 C咒 时 , 对藻胆蛋白的结构产生
一定的影响 。
荧光发射光谱能更清楚地说明 R PE 和 CCP 交联
的情况 , 如图 3 。交联液和对照相比 , 虽然 M O nr 附近
没有出现 CCP 的荧光发射峰 , 可是 M O unI 和 5 85 unr
发射峰的比例明显升高 , 由对照中的 0 . 16 上升为
0
.
2 7
, 这说明交联液中存在着从 RP E 到 C代 的能量
传递 , 从而可以说明交联共价体 R l犯( 代 的生成 ; 纯
化以后发现 RP巳毛代 5 85 nYI 附近的峰蓝移到 5 75 nm
附近 , 而且 创O lun 附近出现了明显的发射峰 , 与 575
fun 发射峰的比值为 1 、 29 。 这证明 R卫E 和 C CP 交联成
功。
、卜产
、 \、!二é`、 ,
\ ,
8气,,|ISJ了r、
0n
一
98
月.
6 4 0
/ / 一 \ \弋内11!勺日J”Jz,.了了.厂r.夕沙.2
竹以日川曰八é0六U,产六054勺目
铡骡未似反罕
0 1二二二
5 0 0 6 0 0
波长 / n m
、 ~ 之》 卜 上
_
l
70 0
高碘酸钠氧化法交联 m , E和 CCP 的荧光发射光
谱 ( E x = 49 8 nm )
以分别与两个藻胆蛋白分子上的氨基形成 cS ih f 碱 ,
将两分子以五碳链的桥连接起来 , 如 C p C书咒医 10 ’ ,
Rp B A代 7[ ]和 R l〕E戒二CP 9l[ 3 种藻胆蛋白能量传递模型
的构建就是以 GA 为交联剂的 , 不过该法容易形成同
种蛋白间的交联 , 产物均一性较差 。 后者的原理是利
用蛋白表面的琉基 , SDP P 可先与一种蛋白分子反应 ,
生成保护性琉基 一 二硫毗咙基 , 通过琉基交换反应与
另一蛋白分子上的琉基形成共价的二硫键 , 因为反应
条件温和 , 蛋白分子中通常没有琉基反应活性基团 ,
琉基交换反应具有 良好的选择性 , 在一定程度上可避
免相同分子间的聚合 , 而且通过定量引人琉基及琉基
反应活性基团 , 可以实现控制交联 , 得到化学专一性
和生物专一性更好的交联产物 , 但是交联剂 SDP P 本
身比较昂贵 ,而且贮存时湿度大容易潮解 。
本文报道的高碘酸钠氧化法是通过高碘酸钠的
氧化作用将藻胆蛋白表面的糖基氧化为醛基 , 再与另
一蛋 白表面的氨基形成 cS hi f 碱的共价键结构 。
uT s
e l卜
K
t ir s t ak 〔12 脂出 N “ 0 4 对蛋白分子中糖基的氧化
的最佳浓度为 4 一 s n u 刀。 1/ L , 这样可以保证蛋白有效
的结合和活性的保持。 实验中发现高碘酸钠在交联过
程中对藻胆蛋白的结构有一定的影响 , 可能的原因是
高碘酸钠作为一种氧化剂 ,作用于色基附近的脱辅基
蛋白 , 使色基的微环境变化而导致其光谱发生变化 ,
如图 2o 在交联物的能量传递效率方面 , 64 0 n m 和 5 85
imr 荧光发 射峰 的 比例大 于 1 , 较戊 二醛交 联的
Rp引二代 传能效率要高 四 ’ , 这说明高碘酸钠共价交联
物的能量传递效率还是比较高的 。 所以高碘酸钠氧化
法交联藻胆蛋白对研制藻胆蛋白荧光探针 , 尤其是用
藻胆蛋 白探针对细胞表面作多色分析时意义重大 。
3 hT
e fl u二 s e e n e e e而 s s i o n sP e e atr o f e o nj u g a te o f 参考文献
门、,图
g
,上F
R I
〕
E an d C PC
w i th p e ir 记i e a e id sod i u m
一 R pE 和 c代交联反应对照 ;— l u 崛 和 C cP 交联反应样品 ;阮户出北x G Zo 纯化的 招硬义:代
一我 e c o ll t ro l of e o nj u g at . of R P E a们 { I C咒 : — t he s田 111〕l e of e o仆ju g l le of RP E a 们d C代 ; 一 ’ 一 p l l` if司 R I , “ :代 之db , a 柳had xe 0 2《x〕 2
c ol l ” l u l
3 讨论
蛋白质交联时 , 交联剂类型的选择和用量是非
常重要的 。 因为交联剂过量会导致蛋白变性 , 而不足 4
会影响交联效率 12 ]。 常见的藻胆蛋白交联方法有戊
二醛 (GA )和 -N 唬拍酞亚胺基 -3( -2 毗陡基二硫 )丙酸 5
醋 ( s DP P ) ` , 3’ 。 前者的反应原理是利用藻胆蛋白表面
的活性基团— 赖氨酸的 。一 H : , 以 的两个醛基可
王广策 ,周百成 , 曾呈奎 . E 藻红蛋白和 -R 藻红蛋白 7
亚基的分离 、特性及其在分子中的空间位置分析 . 中国
科学 (C ) , 19 8 , 2 8 ( l ) : 3以 l
王广策 ,邓田 ,曾呈奎 藻胆蛋白的研究 ( )I , 海洋科学 ,
2 (汇旧 , 24 ( 2 ) : 2 2尸 2 5
李冠武 , 王广策 . -R 藻红蛋白介导的光敏效应对 D N A 分
子的生物学效应 . 生物化学与生物物理进展 , 2 (xx ) , 27
( 6 ) : 6 2 1石 24
lG az er A N
,
S tI’y e r L . hP y e ofl u o r por b e s . reT n d s B io e h e m
S e i
,
19 84
,
9 : 42 3 4 2 7
肠 s t H P , aR ht K , Wan e r G , e t al
.
hP y
e ob i l ios m e s an d
iosl
a tde 户cor b i l ip or te i n s
.
E a七e t of gl u t耐i al dhe dy e an d
b e nz 叫 u i n o n e on flu o re s e e n e e . hP o l〔汉六硬)秘 t叮 an d 月 l。 句 -
函 海洋科学 / 2X() 3年 /第 27 卷 /第 8期
研究报告
b必及召 , , 19 8 1 , 3 4 : 13多 143
王广策 ,周百成 ,曾呈奎 . 钝顶螺旋藻 G 藻蓝蛋白和别
藻蓝蛋白能量传递模型的构建 . 科学通报 , 19 6 , 41
( 8 ) : 74 1一4 3
Wan g G C
,
z h ou B C
,
sT en g C K
.
hT
e e x c i t at i on e n e卿
tran
s fe
:
in an axt i if
e ial 即 hy e优砂 t h` 们 , ;山叩场 e , y an i n
e
onj
u
gat
e
.
hP
o ot卿 ht e t i e a , 199 6 , 3 2 ( 4 ) : 以珍巧 12
从朋 9 G C , hZ ou B C , sT en g C K . 印 e c t or p i e p哪 e rt i e s of
ht e 卿h y e oc yan i l l旧 U叩 hy e yan i n e onj u g at e 阴d ht e ios lat de
hP cy iob l主~
加 m SP 动21俪户滋` 矛L`“ . hP ot o s yn ht 即 ca ,
19 7
,
3 4 ( 1 )
: 5拓5
W a
ll
g G C
,
hZ
o u B C
,
sT en g C K
·
S tu d y o n ht e xe
e i ta it on
e n e卿 atrn sfe r o f an art 诉e i己 C镬通l y e o e yan i l l -B 岌〕hy e o e l叭11 ir n
e
onj
u
gat
e
.
B o tan i e a M面 n a , 19 7 , 4O ( 4 ) : 3 2幻2 8
W an g ( ; C
,
Z h o u B C
,
1
,
s e n g C K
.
C o n stru
e t i o n Of en e卿
腼sfe r xn 侧」e l o f 卿hy e oc yan in 田 ld al OP h y c oc y an i n fr o m
助 i耐、 尹范tens 站 . C hi n e s e s e i朋e e B u l e ti n , 19 7 , 42 ( l ) :
6 9 7 2
王广策 ,周百成 , 曾呈奎 . 钝顶螺旋藻 G 藻蓝蛋白和多
管藻 -R 藻红蛋白的分离及摩尔消光系数的测定 . 海洋
科学 , 19 6 , l : 5-25 5
洪孝庄 ,孙曼雾 ,龚雄麒 . 配体结合分析中的蛋白质连
接技术 . 北京 : 中国医药科技出版社 , 19 93 2叼 l
lG az e r A N
,
5 1叮 e r L . luF ore
s e en t it u ld em p h y
e o bi l ip or t e i n
C o n j u ga t es : E而 s ion aw vel e 日斟l z s h沮 in g b y en e 乓。 r atrn s fe l
.
.
B i叩h y s i e al J o u rn al , 19 8 3 , 4 3 : 3 8孚38 6
C O N J U G A T E O F R
一
P H Y C O E R Y T H R I N F R O M oP ly
s iP h o n 讯
u rc e o la ta A N D C
一
P H Y C O C Y A N I N F R O M SP i护u il n a P la te n s is
W I T H P E R IO D I C A C ID S O D I U M
M A
(肠
hs
e n叮 u an WA NG uG an 片Ce z EN G Ch e n g ~ K t l i ( C . K . sT e n g )
2仅刃7
五逮2沁ra to 理 of 忍叼〕ier me nt al M d r i二 B访如g ) , 加 it 以。 of 口仪 {a on 切邵 , the hC i二。 cA a 硬众哪 of cS ic ~ , iQ 刀g法 u ,
I )
R ec ie
v
ed
: S e p
,
3
,
2 1】〕2
K e y W O川 s 二 凡 lys 护ho n沁 u rceo 阮 ta
, 助h y e oe 巧l hi i n , SP i耐 ina 尸坛枷衍 , 卿h y e o e y an in , C ro s * ac t ion iw ht pe ir 记i e ac id s记i u m
C o nj u gat
e ,
pS
e e
atr an al y
s
i s
A bs tr 8 C t
R , 1
1y e叱 yr th ir n an d C一 y e o e y am n wer iosl a t e d a n d Po if e d ofr m amn n e er d 吨 a oP如 iPho n i a 一 lat a a dnb lu -e因℃ e n al ga 助 i rul i an 尸l aet o is er s详 e t iv e ly w i th a 饰如卿 l a tP it e e o lu mn . A n d ht e n , th e e o nj u gat e o f R P I沈CP was
o b扭 in ed 娜 e麟~
e t io n 俪 th pe r l o d ie a e记 so d iu m . ftA e r 悦 i飞 se l灿 I l e d 师 a eS p h a dex -G 2 (义) e o lu mn , tha e o nj l lg a t e aws
e
h跟 cI te ir z e d iw th fl u o re cs e cn e e而 s s io n s pe e atr a n d th e e n e卿 t ar ns fe r ofr m t he RP E ot t h e CCP e o ul d o e e ur i n the
R PE`C咒 co nj l l g a te .
(本文编辑 :张培新 )
M面 n e Se i即 e e s / V o l . 2 7 . NO . 8 / 2X(j 3 自