全 文 ：第0 1 卷第4 期
1 9 94 年s 月
生 物 化 学 杂 志
Chi ne e s i Bo e hem ie al Jo ur n al
Vo l
.
10
,
N o
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4
A u g
.
,
1 9 9 4
笋瓜籽毒蛋白 M a ix m in — 一种新的蛋白质生物合成抑制剂的分离纯化及性质 ’
钟雪梅 高闻达 毛俊浩” 许驰捷 曹蕙婷 张祖传
(中国科学 院上海生物化学研 究所 ,上海 20 0 03 1)
摘要 笋瓜 (C cu o irb t 。 m ax lm 。 )种籽经去 壳捣碎 , 乙醚脱脂 ,硫酸按分级沉 淀 , 阳 离子 交换层 析及凝
胶过滤等步骤 , 纯化到一种有蛋 白质生物合成抑制活性的碱性蛋 白 ,命名 为 M ax im in , 5 1) S 一 P A G E 显
示单 一条带 , 其分子 量约为 28 k D 。 该蛋 白对兔 网织 红细胞 裂解 液的蛋 白生物合 成有较 强的抑制 , I C 50
为 4 . o x l 。一 `。 m ol / L , 与 天花粉蛋 白 ( T C )S 毒性相似 。 从这些特性 可 见 , 该蛋 白似为单链 核糖体失活蛋
白 ( R I P )家族 中的新成员 , 可 望作为免疫毒素的 一 种新 “ 弹头 ” 。
关键词 : 笋瓜籽毒蛋白 ; 蛋 白质生物合成抑制 剂 ; 免疫毒素
自免疫毒素问世 以来 , 人们 已使用了从细菌 、 植物和真菌来源的各种毒素作为 “ 弹头 ” l[] ,
其中植物来源的毒素包括两大类致核糖体失活蛋白 ( R IP ) : 第一类为单链毒蛋 白 ,如天花粉蛋
白 ( T C S ) ,至今所有已发现的这类单链毒蛋白分子量均在 3 k0 D 左右 , 具 R N A N 一糖昔酶活性 ,
专一性地作用于 285 r R N A 上 4 3 24 位腺昔酸的 N 一 C 糖昔键 ,释放出一个腺嚓吟 , 使核糖体 60 5
亚基不可逆失活从而抑制蛋白的合成川 。第二类为双链毒蛋 白 , 包括 A 、 B 两条链 , A 链是真正
的毒性部分 , 相当于单链毒蛋 白 , B 链具有糖结合位点 ,有凝集素的功能 。 比较这两类 R IP ,前
者作为免疫毒素的弹头 , 在分子量和结构上更具有优越性 。
笋瓜是南瓜属作物 , 其籽可食 ,来源丰富 。我们首次从该种籽 中纯化到一种分子量为 2 k8 D
的毒蛋白 M a ix m in ,并对它的理化性质和生物活性作了初步的研究 。
材 料 与 方 法
一 、 材料
笋 瓜 籽购 自上 海种 籽公司 ; 兔网织红 细 胞裂解液 ( L y sa et ) 按 应 文斌等川方法制备 ;
s e p h a e r y l s
一
1 0 0为 P h a m a e i a 产品 ; e M 一 5 2纤维素为 W h a t m a n 进 口分装 ;其 它试剂均为分析
纯 。
国家科委生物领域高技术基金资助项 目
料 浙江大学生物科学与技术系 93 届毕业实习生收稿 日期 : 1 9 9 3一 0 7一 1 9 ,修回日期 : 1 99 5一 1 1一 0 3
3 9 7
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 1994. 04. 003
二 、 方法
1 .粗提液的制备
去壳笋瓜籽绞细后用预冷的乙醚脱脂 , 干燥后用 10 倍体积 ( v /w ) , 含 0 . Zm ol / L N a CI 的
p H 7
.
2 Z o m m o l / L 磷酸缓冲液 ( P B ) , 室温抽提 6 h , 8 o o o r /m i n 冷冻离心 2 5 m in ,上清用硫酸
钱分级沉淀 ,取 40 % 一 85 %饱和度的沉淀 ,对 s m m ol / L P B , p H 6 . O充分透析 。
2
·
C M
一
5 2离子交换层析
透析后的样品上 s m m ol / L P B , p H 6 . o充分平衡的 C M 一 52 柱 (2 x 1c6 m ) , 上样后经约两个
柱体积 P B 洗涤 ,用 5 0 m l 含。到 0 . 6 m ol / L N a CI 的磷酸缓冲液进行梯度洗脱 。
3
·
S e p h a e r y l S
一
1 0 0凝胶过滤
将 C M 一 52 离子 交换层析有活性的峰用 P E G ( 20 0 0) 浓缩后 上 S e p h a c r y 1 S 一 1 0 层 析柱
( 1
·
6 x 1 0 0 e m )
,并用含 O · 1 4m o l / L N a C I 的 p H 7 . 2 , 1 0 m m o l / L 磷酸缓冲液洗脱 。
.4 H P L C 分子筛
凝胶过滤得到的有活性的样品经 iB o 一 51 1 S E C 2 5 0一 10 柱进一步纯化 。 洗脱液为 。 . l m ol / L
P B, p H 6
·
8
,流速 1 · 0 m l /m in 。此法除纯化样品外 , 同时还可根据洗脱时间测定其分子量 。
6
. 各组分的毒性鉴定
样品对免 网织红细胞裂解液蛋 白质生物合成的抑制活性按文献川的方法测定 。 以蛋 白生
物合成被抑制 50 %时的样品浓度作为样品的毒性指标 (I C S。 ) 。
三 、 性质鉴定
1
. 分子量的测定
按 L a e m m l i 二`〕方法 , 样品经 2 2 . 5 % S D S 一 P A G E 电泳后 , 以 W e b e r 等巨5〕方法测定分子量 。
2
. 非蛋白组分的检测
样品在 B ec k m a n D U 70 分光光度计上作 Z o o n m 至 4 0 0 n m 光吸收扫描 , 以确定是否含核酸
成分 。用 P A S 法叫染色以判断 M a ix m in 是否是糖蛋白 。
3
.
p l 的测定
在 L K B 2 1 1 7 M ul it p ho r 等电聚焦仪上进行板状等电聚焦 , 凝胶浓度 7 . 5% , 内含 p H 3 . 5一
1 0 A m p h a l i n e
。
l o
o
e
,
Z o o v
,
7 m A 预 电泳 l h 后加样 , 电泳 3 . s h 后 , 根据蛋白染色的位置 , 即可
求得样品的等 电点 。
4
. 氨基酸组成分析
样品经 6m ol / L H CI 1 1o0 C 水解 2 h4 后 , 在 日立 8 35 型氨基酸自动分析仪上分析 。
结 果 和 讨 论
一 M a x im i n 的纯化粗提液经硫酸钱分级沉淀初步纯 化后先用 C M 一 52 阳离子交换层析 ,这有利于以后较大规
模 的制备 。 iF g . 1为离子交换层析的结果 ,测活表 明峰 C 4有明显的蛋白质生物合成抑制活性 ,
C 6虽也有活性 , 但含量较少 . 我们只将 C 4进一步用 S e p h a c r y 1 S 一 1 0 柱纯化 。
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二 、 方法
. 1粗提液的制备
去壳笋瓜籽绞细后用预冷的乙醚脱脂 , 干燥后用 10 倍体积 ( v /w ) , 含 0 . Zm ol / L N a CI 的
p H 7
.
2 Z o m m o l / L 磷酸缓冲液 ( P B ) , 室温抽提 6 h , 8 o o o r /m i n 冷冻离心 2 5 m in ,上清用硫酸
钱分级沉淀 ,取 40 % 一 85 %饱和度的沉淀 ,对 s m m ol / L P B , p H 6 . O充分透析 。
2
·
C M
一
5 2离子交换层析
透析后的样品上 s m m ol / L P B , p H 6 . o充分平衡的 C M 一 52 柱 (2 x 1c6 m ) , 上样后经约两个
柱体积 P B 洗涤 ,用 5 0 m l 含。到 0 . 6 m ol / L N a CI 的磷酸缓冲液进行梯度洗脱 。
3
·
S e p h a e r y l S
一
1 0 0凝胶过滤
将 C M 一 52 离子 交换层析有活性的峰用 P E G ( 20 0 0) 浓缩后 上 S e p h a c r y 1 S 一 1 0 层 析柱
( 1
·
6 x 1 0 0 e m )
,并用含 O · 1 4m o l / L N a C I 的 p H 7 . 2 , 1 0 m m o l / L 磷酸缓冲液洗脱 。
.4 H P L C 分子筛
凝胶过滤得到的有活性的样品经 iB o 一 51 1 S E C 2 5 0一 10 柱进一步纯化 。 洗脱液为 。 . l m ol / L
P B, p H 6
·
8
,流速 1 · 0 m l /m in 。此法除纯化样品外 , 同时还可根据洗脱时间测定其分子量 。
6
. 各组分的毒性鉴定
样品对免 网织红细胞裂解液蛋 白质生物合成的抑制活性按文献川的方法测定 。 以蛋 白生
物合成被抑制 50 %时的样品浓度作为样品的毒性指标 (I C S。 ) 。
三 、 性质鉴定
1
. 分子量的测定
按 L a e m m l i 二`〕方法 , 样品经 2 2 . 5 % S D S 一 P A G E 电泳后 , 以 W e b e r 等巨5〕方法测定分子量 。
2
. 非蛋白组分的检测
样品在 B ec k m a n D U 70 分光光度计上作 Z o o n m 至 4 0 0 n m 光吸收扫描 , 以确定是否含核酸
成分 。用 P A S 法叫染色以判断 M a ix m in 是否是糖蛋白 。
3
.
p l 的测定
在 L K B 2 1 1 7 M ul it p ho r 等电聚焦仪上进行板状等电聚焦 , 凝胶浓度 7 . 5% , 内含 p H 3 . 5一
1 0 A m p h a l i n e
。
l o
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,
Z o o v
,
7 m A 预 电泳 l h 后加样 , 电泳 3 . s h 后 , 根据蛋白染色的位置 , 即可
求得样品的等 电点 。
4
. 氨基酸组成分析
样品经 6m ol / L H CI 1 1o0 C 水解 2 h4 后 , 在 日立 8 35 型氨基酸自动分析仪上分析 。
结 果 和 讨 论
一 M a x im i n 的纯化粗提液经硫酸钱分级沉淀初步纯 化后先用 C M 一 52 阳离子交换层析 ,这有利于以后较大规
模 的制备 。 iF g . 1为离子交换层析的结果 ,测活表 明峰 C 4有明显的蛋白质生物合成抑制活性 ,
C 6虽也有活性 , 但含量较少 . 我们只将 C 4进一步用 S e p h a c r y 1 S 一 1 0 柱纯化 。
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(pl > 10 )
,这一性质也与其它单链 R IP 相似 。从氨基酸组成分析结果 ( T ab le l) 可看出除个别
氨基酸外 , M a x im i n 的氨基酸组成与 T C S , L u f f i n A , B 有很大相似性 。从 2 0 0到 4 0 0 n m 吸收光
谱扫描表明 M a x im i n 只在 2 8 o n m 有 吸收 , 排除了含核酸 的 可能 , 而 P A S ( p e r io d i e a e id 一
S c h i f f )染色呈阳性 ,揭示 M a x im i n 是一种糖蛋白 。
T a b l e 1 A m i n o a e id e o m p o s it io n o f l u f f i n A
,
lu f f in B
,
T C S
a n d m a x im i n
A m i n o a e id L
u f f i n A L u f f i n B T C S M a x im i n
20n5143846 29巧219n64490281394632823017286A s x
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.
4表示不同浓度的 M a ix m in 对兔 网质红细胞裂解液 的蛋 白质生物合成抑制情况 ,从
抑制 曲线求得 IC S。为 4 . 。又 1 0 一 ’ 。 m ol / L ,表 明它对 无细胞系统的蛋 白质生物合成抑制活性与
T C S ( 2
.
9又 1 0一 ` 。m o l / L )相当 。
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8 0
6 0
4 0
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M ax im i
n e o n ce n t r a t i o n (
一 19 m o l / L )
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一t l o n o f p r o t e 一n s y n t h e s l s In e e l l f r e e s y s t e m o f r a b b l t r e r 一e u l o e y t e ly s a t e
I C s o
: 4
.
0 火 1 0一 ` om o l/ L
4 0 0
从石竹科 , 胡芦科 ,百合科等不同种属的植物 中发现的单链致核糖体失活蛋白 ( R IsP ) 已
有 30 多种 ,但迄今未见有关笋瓜籽 R IP 的报道 。笋瓜 ( C uc u嵌 at m a x im a) 又称北瓜 ,是葫芦科
南瓜属植物 , 它在我国普遍栽培 ,有很好的经济价值 , 种籽常被用作零食食用 , 来源极为丰富 。
我们从笋瓜籽中首次分离了高纯度的 M a ix m in ,从其理化性质及生物活性可以推测 ,它很可能
是一种新的单链 R IP 。 T C S 已被成功地用于免疫毒素的制备阁 , M a ix m in 在很多性质上与
T C S 相似 ,对蛋 白生物合成的抑制活性与之十分接近 , 因而可以推测它可望成为一种新的免
疫毒素的 “ 弹头 ” 。
参 考 文 献
1 R a m a k r i s h n a n S
, F r y x e l l D , M o h a n r a J D
,
et a l
.
A n n u R ve P h a
r 爪 a c o l T o x i c o l , 1 9 9 2 , 3 2 : 5 7 9一 6 2 1
2 Z h a n g J
,
L i u W
.
N
u c l e : c A c t d s R e s e a r c h , 1 9 9 2 , 2 0 ( 6 )
: 1 2 7 1一 1 2 7 5
3 应文斌 , 等 . 生物化学与生物物理进展 , 1 9 89 , 16( 6 ) : 46 7
4 L a e m m l i U K
, e t a l
.
N a t u re
, 1 9 70 , 2 2 7
: 6 80一 68 5
5 W e b e r K
,
o s b o r n M
.
J B i o l C h e m
,
1 9 6 9
, 2 4 4 : 4 40 6一 4 4 0 9
6 G lo s s m a n n H
,
N e v i lle D M J
.
J B
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e 阴 , 1 9 7 1 , 24 ` : 6 3 3 9一 6 3 4 6
7 Is l a m M R
,
N i s hi d a H
,
F u n a t s u G
.
A g 八 c B i o l C h em
,
1 9 9 0
,
5 4
:
2 9 6 7一 2 9 7 0
8 K a m e n o s o n o M
,
N i s h id a H
,
F u n a t s u G
.
A g
r i c B i o l C h e沉 , 1 9 8 8 , 5 2 : 1 2 2 3一 1 2 2 7
9 Y
e u n g H W
,
L I W W
,
C h a n W Y
, e t a l
.
I n t J P eP t id
e
P
r o t e i月 R e s , 1 98 6 , 2 8 : 5 18 一 5 2 4
1 0 W a n g Q
,
Y i n g W
,
X i e H
, e t a l
.
C a 刀 c er R e s e a cr h
,
1 99 1
,
5 1
:
3 35 3一 3 3 5 5
M
a x im i n A N
e w I n h ib i t o r y P r o t e i n o f P r o t e i n S y n t h e s i s
:
P u r i f i
-
e a t i o n a n d P r o P e r t i e s
Z h o n g
,
X u e
一
m e i G a o
,
W e n
一
d a M a o
,
J
u n 一 h a o X u
,
C h i
一
j i e
C a o
,
H u i
一
t i n g Z h a n g
,
Z u
一 e h u a n
( S h a n g h a i I n s t i t u t e of B i
o c h e m i
s t即 , A c a d e m ia S i n i c a , S h a n g h a i 2 0 0 0 3 1 )
A b s t r a e t A s e r i e s o f m e t h o d s i n e l u d i n g a m m o n i u m s u l f a t e p r e e i p i t a t i o n
,
C M
一
5 2 i o n
一 e x -
e h a n g e e h r o m a t o g r a p h y
,
S e p h a e r y l S
一
1 0 0 g e l f il t r a t i o n a n d H P L C w e r e a p p l i e d t o i s o l a t e
m a x im i n f r o m t h e s e e d s o f C u c u br i t a m a x im a
.
T h e r e s u l t s o f SD S
一
p A G E a n d H P L e g e l f i l
-
t r a t i o n i n d i e a t e d t h a t i t s m o l e e u l a r w e i g h t w a s a r o u n d 2 8 kD
.
I n h ib i t i o n t o p r o t e in s y n t h e s i s
w a s p r im a r i l y d e t e r m i n e d b y t h e e e l l f r e e s y s t e m o f r a bb i t r e t i e u l o e y t e l y s a t e w h i e h d i s p l a y e d
t h a t t h e IC
S。 o f m a x im i n w a s a t t h e s a m e le v e l o f t h a t o f T C S
.
T h e s t a t i s t i e s d i s e u s s e d i n t h i s
P a P e r i m p l ie d m a x im i n 15 l ik e l y t o b e a n e w m e m b e r o f R I P s a n d b e e o m e s a n o v e l t o x i e m o i
-
e t y o f im m u n o t o x i n
.
K e y w o r d s : M a x im i n ; R I P s ; Im m u n o t o x i n
4 0 1