全 文 ：2015 年 9 月第 22 卷第 9期 中国中医药信息杂志 ·87·
HPLC同时测定复方藤乌软膏中 6种乌头类生物碱含量
李美艳 1,2,赫清雪 1,2,王爱武 1
1.山东大学附属省立医院,山东 济南 250021；2.山东中医药大学,山东 济南 250355
摘要：目的 建立高效液相色谱法(HPLC)同时测定复方藤乌软膏中 6 种乌头类生物碱含量的方法。
方法 色谱柱为 Agilent XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相 A为乙腈-四氢呋喃(25∶8),B为 0.1 mol/L
醋酸铵溶液(每 1000 mL 加冰醋酸 0.5 mL),梯度洗脱；流速：1 mL/min；检测波长：235 nm；柱温：25 ℃。
结果 乌头碱在 0.072～0.648 μg 具有良好的线性关系(r＝0.999 5),平均回收率为 99.29%,RSD＝1.25%；新
乌头碱在 0.062～0.648 μg 具有良好的线性关系(r＝0.999 5),平均回收率为 99.12%,RSD＝0.85%；次乌头碱
在 0.064～0.384 μg 具有良好的线性关系(r＝0.999 8),平均回收率为 99.57%,RSD＝1.07%；苯甲酰乌头原碱
在 0.056～0.672 μg 具有良好的线性关系(r＝0.999 2),平均回收率为 98.11%,RSD＝0.61%；苯甲酰新乌头原
碱在 0.055～0.993 μg 具有良好的线性关系(r＝0.999 9),平均回收率为 99.27%,RSD＝1.10%；苯甲酰次乌头
原碱在 0.078～0.702 μg 具有良好的线性关系(r＝0.999 8),平均回收率为 99.08%,RSD＝1.38%。结论 本方
法操作简便、灵敏度高、重复性好,结果准确,可作为复方藤乌软膏中乌头类生物碱的含量测定方法。
关键词：复方藤乌软膏；乌头碱；新乌头碱；次乌头碱；苯甲酰乌头原碱；苯甲酰新乌头原碱；苯甲酰次
乌头原碱；高效液相色谱法
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.024
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2015)09-0087-04
Simultaneous Determination of 6 Aconitum Alkaloids in Compound Tengwu Ointment by
HPLC LI Mei-yan1,2, HE Qing-xue1,2, WANG Ai-wu1 (1.Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong
University, Jinan 250021, China；2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)
Abstract：Objective To establish an HPLC method for the simultaneous determination of the 6
aconitum alkaloids in compound Tengwu Ointment. Methods Chromatographic column was
Aglient XDB-C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm), with the mobile phase A of acetonitrile-
tetrahydrofuran (25∶8), phase B was 0.1 mol/L ammonium acetate solution (0.5 mL acetic acid
added to the 1000 mL) with gradient elution；the flow rate was 1 mL/min；the detection wavelength
was set at 235 nm；the column temperature was 25 ℃. Results Aconitine was in the good linear
range of 0.072-0.648 μg (r＝0.999 5), with the average recovery of 99.29%, RSD＝1.25%.
Mesaconitine was in the good linear range of 0.062-0.648 μg (r＝0.999 5), with the average
recovery of 99.12%, RSD＝0.85%. Hypaconitine was in the good linear range of 0.064-0.384 μg
(r＝0.999 8), with the average recovery of 99.57%, RSD＝1.07%. Benzoylaconine was in the good
linear range of 0.056-0.672 μg (r＝0.999 2), with the average recovery of 98.11%, RSD＝0.61%.
Benzoylmesaconine was in the good linear range of 0.055-0.993 μg (r＝0.999 9), with the average
recovery of 99.27%, RSD＝1.10%. Benzoylhypaconine was in the good linear range of 0.078-0.702 μg
(r＝0.999 8), with the average recovery of 99.08%, RSD＝1.38%. Conclusion This method is simple,
sensitive, repeatable and accurate, which can be used for determination of aconitum alkaloids in
compound Tengwu Ointment.
Key words ： compound Tengwu Ointment ； aconitine ； mesaconition ； hypaconitine ；
benzoylaconine；benzoylmesaconine；benzoylhypaconine；HPLC

通讯作者：王爱武,E-mail：wangaw66@163.com
·

专
药制
具有
劳损
临床

新乌
头
性成
肤安
(HP
测
应用
1

检测
柱
(奥
利斯
(昆

20
制
98%
98
98
原碱
新乌
苯
度
腈
析纯
2
2.

5 μ
0.
梯度
检测
理论
在此
达

88·
复方藤乌
家与药学人
剂,由鸡血
消肿止痛
、急性扭伤
应用 30 余
复方藤乌软
头碱、次乌
原碱、苯甲酰
分又是有效
全性进行了
LC)建立复方
定方法,为更
奠定基础。
仪器与试药
Waters 60
器,Empowe
(250 mm×4.
豪斯国际贸
科学仪器有
山市超声仪
复方藤乌
140711、201
备；乌头碱
)、新乌头
.3%)、次乌
.6%)均购自
对照品(批
头原碱对照
甲酰次乌头
≥98%)均购
、四氢呋喃为
。
方法与结果
1 色谱条件
色谱柱：A
m)；流动相
1 mol/L 醋酸
洗脱(0→3
波长：235
板数按苯甲
色谱条件下
到较好分离。

软膏是山东
员遵循中医
藤、生川乌
、续筋接骨等
、挫伤、闪
年疗效较好
膏中的生川
头碱、苯甲
次乌头原碱
成分[1]。我
研究[2]。本
藤乌软膏中
好地控制其


0F 高效液相
rs 色谱工作
6 mm,5 μm)
易有限公司
限公司)；
器有限公司
软膏样品(
40829),山东
对照品(批号
碱对照品(
头碱对照品
中国食品药品
号 RFS-B-1
品(批号 RF
原碱对照品
自成都瑞芬
色谱纯,水


gilent XDB-
A为乙腈-四
铵溶液(每
5 min,17%→
nm；柱温：
酰新乌头原
,6 种乌头
色谱图见图
Chinese Jo
大学附属省
药理论共同
、生草乌、
功效,主要
伤及轻度骨折
。
乌、生草乌
酰乌头原碱
等乌头类生
们前期对其
研究采用高
6种乌头类
质量、进一
色谱仪(Wa
站),Agilen
；CP2250 型
)；BSA223S
KQ-600DB 型
)。
批号分别为
大学附属省
110720-2
批号 0799
(批号 0798
检定研究院
10305,纯度≥
S-B-100713
(批号 RFS
思生物科技
为双蒸水,其
C18色谱柱(2
氢呋喃(25∶
1000 mL 加冰
25%A；35→
25 ℃；流
碱峰计算应
类生物碱均
1。
urnal of
立医院骨伤
研制的传统
自然铜等组成
用于治疗运
引起的疼痛
含有乌头碱
、苯甲酰新
物碱,既是
制备工艺及
效液相色谱
生物碱的含
步推广和扩
ters2996 紫
t XDB-C18色
电子分析天
电子天平(赛
超声波清洗
20140508
立医院制剂
00410,纯度
-9403,纯度
-9403,纯度
,苯甲酰乌
98%)、苯甲
,纯度≥98%
-B-110328,
有限公司；
余试剂均为
50 mm×4.6 m
8),流动相B
醋酸 0.5 mL
60 min,25%A
速：1 mL/mi
不低于 300
与其他组分
Informati
科
中
,
动
,
、
乌
毒
皮
法
量
大
外
谱
平
多
器
、
室
≥
≥
≥
头
酰
)、
纯
乙
分
m,
为
),
)；
n。
0。
能
注：A.
3
2.2
精
乌头原
照品适
甲醇溶
新乌头
头原碱
甲酰次
精
乌头原
备液各
一 10
刻度,
次乌头
乌头原
对照品
2.3
取
瓶中,
合溶液
度25
混合溶
渣用
孔滤膜


on on TCM
对照品；B.供试
.苯甲酰次乌头原
图 1 复方藤
对照品溶液
密称取乌头
碱、苯甲酰
量,分别置
液定容至刻
碱 0.180
0.560 mg
乌头原碱 0
密量取乌头
碱、苯甲酰
2.0、2、
mL 容量瓶中
制成每毫升
碱 32 µg、
碱 55.2 µg
溶液。
供试品溶液
复方藤乌软
加氨试液 3
30 mL,超声
℃)30 min,
液洗 3 次,
0.05%盐酸-
,即得。
10.0
1
1
Se

A

B
品；1.苯甲酰新
碱；4.新乌头碱
乌软膏中 6种乌
的制备
碱、新乌头
新乌头原碱
于10 mL容量
度,制成每毫
mg、次乌头碱
、苯甲酰新乌
.195 mg 的
碱、新乌头
新乌头原碱
0、1.0、1.0
,加入 0.05
含乌头碱 36
苯甲酰乌头
和苯甲酰次
的制备
膏约 10 g
mL,加入异丙
处理(功率
过滤,残渣用
每次 10 mL,
甲醇溶液定容
20.0 30
2
3
2 3
p.2015 Vo
乌头原碱；2.苯甲
；5.次乌头碱；
头类生物碱 HPL
碱、次乌头
、苯甲酰次
瓶中,加入
升含乌头碱
0.180 mg
头原碱 0.4
对照品储备液
碱、次乌头
及苯甲酰次
、1.2、2.0
%盐酸-甲醇
µg、新乌头
原碱 56 µg
乌头原碱 3
,精密称定,
醇-乙酸乙
100 W,频率
异丙醇-乙酸
合并滤液,回
至 2 mL,过
.0 40.0
4
5
4 5
6
l.22 No.9


酰乌头原碱；
6.乌头碱
C图
碱、苯甲酰
乌头原碱对
0.05%盐酸-
0.180 mg、
、苯甲酰乌
60 mg 和苯
。
碱、苯甲酰
乌头原碱储
mL,置于同
溶液稀释至
碱 36 µg、
、苯甲酰新
9 µg 的混合
置具塞锥形
酯(1∶1)混
40 kHz,温
乙酯(1∶1)
收溶剂,残
0.45 µm 微
t/min
50.0
6

2015 年 9 月第 22 卷第 9期 中国中医药信息杂志 ·89·
2.4 线性关系考察
分别吸取混合对照品溶液 2、6、10、14、18 µL,
按“2.1”项下色谱条件测定,记录峰面积。以进样量
为横坐标,峰面积为纵坐标,分别进行线性回归,得回
归方程,结果见表 1。
表 1 6种乌头类生物碱线性关系考察结果
对照品 回归方程 相关系数 线性范围(µg)
乌头碱 Y＝762.499 0X－4948.856 3 0.999 5 0.072～0.648
新乌头碱 Y＝1233.151 7X＋1285.265 8 0.999 5 0.062～0.648
次乌头碱 Y＝950.369 9X－14 745.094 9 0.999 8 0.064～0.384
苯甲酰乌头原碱 Y＝1083.185 0X－23 206.384 2 0.999 2 0.056～0.672
苯甲酰新乌头原碱 Y＝943.833 1X－3394.142 5 0.999 9 0.055～0.993
苯甲酰次乌头原碱 Y＝1083.185 0X－23 206.384 2 0.999 8 0.078～0.702
2.5 精密度试验
取混合对照品溶液 10 μL,按“2.1”项下色谱条
件连续进样 6次,测定乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、
苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头
原碱峰面积 RSD 分别为 0.92%、1.27%、1.69%、1.71%、
2.12%、2.24%,表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验
取复方藤乌软膏,按“2.3”项下方法制备供试品
溶液,按“2.1”项下色谱条件分别在 0、2、4、6、8、
12 h 对样品进行测定,记录积分峰面积,结果供试品
中乌头碱、新乌头碱、次乌头碱、苯甲酰乌头原碱、
苯甲酰新乌头原碱及苯甲酰次乌头原碱峰面积的 RSD
分别为 1.37%、1.56%、1.18%、0.94%、2.17%、1.89%,
表明供试品溶液在 12 h 内基本稳定。
2.7 重复性试验
取同一批复方藤乌软膏,按“2.3”项下方法平行
制备供试品溶液 6份,按“2.1”项下色谱条件进行测
定,记录峰面积。测得样品中乌头碱、新乌头碱、次
乌头碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱及苯甲
酰次乌头原碱峰面积的 RSD 分别为 1.75%、2.15%、
1.77%、1.41%、1.35%、1.88%,结果表明本方法重复
性较好。
2.8 加样回收率试验
取 6 份已知含量的复方藤乌软膏,每份约 5 g,精
密称定,分别精密加入一定浓度的 6 种乌头类生物碱
混合对照品溶液,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,
按“2.1”项下色谱条件进行测定,结果见表 2。
2.9 含量测定
取 3 批复方藤乌软膏,各约 10 g,精密称定,按
“2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色
谱条件进行测定,结果见表 3。
表 2 复方藤乌软膏中 6种乌头类生物碱加样回收率试验
成分
取样量
(g)
样品中
含量(µg)
加入量
(µg)
测得量
(µg)
回收率
(%)
平均回
收率(%)
RSD
(%)
乌头碱 5.000 2 118.554 7 93.600 0 210.151 7 97.86
5.002 9 118.618 8 93.600 0 210.562 0 98.23
5.009 8 118.782 4 117.000 0 235.372 9 99.65
99.29 1.25
5.006 8 118.711 2 117.000 0 237.126 9 101.21
5.004 4 118.654 3 140.400 0 259.096 4 100.03
5.001 5 118.585 6 140.400 0 257.230 6 98.75
新乌头碱 5.000 2 4.850 2 3.960 0 8.802 3 99.80
5.002 9 4.852 8 3.960 0 8.729 7 97.90
5.009 8 4.859 5 4.860 0 9.646 6 98.50
99.12 0.85
5.006 8 4.856 6 4.860 0 9.721 5 100.10
5.004 4 4.854 3 5.760 0 10.591 2 99.60
5.001 5 4.851 5 5.760 0 10.542 3 98.80
次乌头碱 5.000 2 34.351 4 27.360 0 61.949 4 100.87
5.002 9 34.369 9 27.360 0 61.289 4 98.39
5.009 8 34.417 3 34.200 0 68.364 2 99.26
99.57 1.07
5.006 8 34.396 7 34.200 0 68.241 0 98.96
5.004 4 34.380 2 41.040 0 75.806 0 100.94
5.001 5 34.360 3 41.040 0 74.998 1 99.02
苯甲酰乌 5.000 2 0.190 0 0.112 0 0.299 2 97.52
头原碱 5.002 9 0.190 1 0.112 0 0.301 0 99.01
5.009 8 0.190 4 0.168 0 0.355 2 98.11
98.11 0.61
5.006 8 0.190 3 0.168 0 0.355 7 98.47
5.004 4 0.190 2 0.224 0 0.408 2 97.34
5.001 5 0.190 1 0.224 0 0.410 0 98.21
苯甲酰新 5.000 2 0.180 0 0.138 0 0.316 2 98.67
乌头原碱 5.002 9 0.180 1 0.138 0 0.319 8 101.20
5.009 8 0.180 4 0.184 0 0.362 9 99.21
99.27 1.10
5.006 8 0.180 2 0.184 0 0.361 8 98.65
5.004 4 0.180 2 0.230 0 0.405 8 98.11
5.001 5 0.180 1 0.230 0 0.409 5 99.75
苯甲酰次 5.000 2 2.300 1 1.950 0 4.223 6 98.64
乌头原碱 5.002 9 2.301 3 1.950 0 4.193 8 97.05
5.009 8 2.304 5 2.340 0 4.637 7 99.71
99.08 1.38
5.006 8 2.303 1 2.340 0 4.672 4 101.25
5.004 4 2.302 0 2.730 0 4.999 0 98.79
5.001 5 2.300 7 2.730 0 5.003 7 99.01
表 3 复方藤乌软膏样品含量测定结果(n＝3,µg/g)
批号
乌头
碱
新乌
头碱
次乌
头碱
苯甲酰
乌头碱
苯甲酰
新乌头碱
苯甲酰
次乌头碱
20140508 23.71 0.970 6.87 0.038 0.036 0.46
20140711 23.68 0.980 6.90 0.041 0.037 0.44
20140829 23.74 0.990 6.89 0.037 0.035 0.49
·90· Chinese Journal of Information on TCM Sep.2015 Vol.22 No.9
3 讨论
复方藤乌软膏中,生川乌、生草乌所含的双酯型
生物碱(乌头碱、新乌头碱和次乌头碱)治疗量与中毒
量接近,经加工炮制后转化为单酯型生物碱(苯甲酰
乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱),
毒性大大降低[3]。目前关于含有乌头碱的中药含量测
定报道较多,但同时测定 6 种生物碱的方法少见。本
研究对乌头碱的提取方法、萃取溶剂和流动相的种类
及梯度洗脱条件进行了反复考察和试验,建立了同时
测定复方藤乌软膏 6种乌头类生物碱含量的方法。
参考乌头类生物碱含量测定的相关报道[4-5],以 6
种乌头类生物碱含量为指标,考察了样品中乌头类生
物碱的 3 种提取方法：①氨试液碱化,用乙醚提取后
再用0.05 mol/L盐酸萃取,最后用氨水调节pH到 10,
再用乙醚萃取的碱化酸提法；②用 0.05 mol/L 盐酸
酸化,乙酸乙酯萃取,水层用氨试液调节 pH 到 10,再
用乙醚萃取的酸化碱提法；③氨试液碱化,用异丙醇-
乙酸乙酯(1∶1)超声提取。结果发现,法①干扰杂质
最少,但提取率相对低,损失较多；法②萃取过程容易
乳化,提取率也较低；法③提取率最高,先将样品碱
化,使乌头类生物碱游离出来,再用有机溶剂提取的
方法干扰少,简便易行,提取效果较好。
对碱化后的萃取溶剂分别以乙醚、异丙醇-乙酸
乙酯(1∶1)进行了考察,结果发现,乙醚作为提取溶
剂,回收较为容易、杂质较以异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)
为溶剂者少,但提取率低于后者,原因可能为异丙醇-
乙酸乙酯(1∶1)混合溶液溶解范围大于乙醚,故选择
异丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液作为提取溶剂。
参考文献[6-8]考察了甲醇-水-氯仿-三乙胺、乙
腈-0.1 mol/L 醋酸铵溶液梯度洗脱、[乙腈-四氢呋喃
(25∶8)]-[0.1 mol/L 醋酸铵溶液(每 1000 mL 加冰醋
酸 0.5 mL)]梯度洗脱等流动相条件。结果发现,甲醇-
水-氯仿-三乙胺体系,6 种生物碱分离度不理想,出峰
时间在 20 min 以内。乙腈-0.1 mol/L 醋酸铵溶液体
系,苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次
乌头原碱及新乌头碱分离度较好,出峰时间在 20～
45 min 之间,但乌头碱与次乌头碱峰重叠,无法分离。
通过调节 pH、醋酸铵浓度等方法,发现醋酸铵浓度对
样品分离作用不大,当调节pH到9.5时,6种生物碱达
到基线分离,色谱峰对称性良好,但是 pH 9.5 为强碱
性,对标准填料色谱柱损伤较大。最终选择[乙腈-四
氢呋喃(25∶8)]-[0.1 mol/L 醋酸铵溶液(每 1000 mL
加冰醋酸 0.5 mL)]梯度洗脱。
总之,本研究在提取溶剂、萃取方法及流动相等
反复优选的基础上,成功建立了HPLC同时测定复方藤
乌软膏6种乌头类生物碱含量的方法,操作简便可行、
灵敏度高、重复性好、结果准确,不仅可作为复方藤
乌软膏的含量测定方法,也为含乌头碱类其他相关制
剂的含量测定提供了借鉴。
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(收稿日期：2015-02-06)
(修回日期：2015-03-03；编辑：陈静)