全 文 ：文章编号:0253-9837(2006)01-0025-04 研究论文:25 ～ 28
收稿日期:2005-04-28.　第一作者:刘森林 , 男 , 1975年生 , 博士.
联系人:刘森林.Tel:(0755)26534149;E-mail:liulsl@szu.edu.cn.
基金项目:国家自然科学基金(20376026), 高等学校博士学科点专项科研基金(20030561017), 教育部科技项目(104147)和深圳市
科技计划项目(200325)资助.
水/有机溶剂双相中郁李醇腈酶催化含硅
(R)-酮氰醇对映选择性合成
刘森林1 , 　宗敏华2
(1 深圳大学生命科学学院 , 广东深圳 518060;2 华南理工大学生物工程系 , 广东广州 510640)
摘要:研究了水/有机溶剂双相中来源于郁李仁的(R)-醇腈酶催化 2-三甲基硅-2-乙酮与 2-甲基-2-羟基丙腈对映选择性合成
(R)-2-三甲基硅-2-羟基丙腈 , 初步探讨了反应时间 、酶粉颗粒大小 、底物浓度 、底物配比和酶添加量对转氰反应的影响.结果
表明 ,适宜的反应条件为:反应时间 96 h 左右 , 酶粉颗粒大小 0.3 ～ 0.45 mm , 底物 2-三甲基硅-2-乙酮浓度 14 mmol/ L , 底物
2-甲基-2-羟基丙腈与 2-三甲基硅-2-乙酮摩尔比 2∶1 , 单位体积反应介质中的酶添加量 43.5 g/ L 左右.在该优化反应条件下 ,
反应平衡转化率和产物的光学纯度(ee值)均可高达 99%.对比研究发现 , 郁李醇腈酶催化 2-三甲基硅-2-乙酮反应在酶促反
应初速率 、底物转化率和产物光学纯度等方面均显著优于其碳结构类似物 3 , 3-二甲基-2-丁酮.
关键词:郁李仁;(R)-醇腈酶;2-三甲基硅-2-乙酮;氰基转移;对映选择性合成;(R)-2-三甲基硅-2-羟基丙腈;(R)-酮氰醇;
有机硅
中图分类号:O643/Q55　　　文献标识码:A
Enantioselective Synthesis of Silicon-Containing(R)-Ketone
Cyanhydrin Catalyzed by(R)-Oxynitrilase from Plum
in an Aqueous/Organic Biphasic System
LIU Senlin1＊ , ZONG Minhua2
(1 College of L ife Science , Shenzhen University , Shenzhen 518060 , Guangdong , China;
2 Department of Biotechnology , South China University of Technology , Guangzhou 510640 , Guangdong , China)
Abstract:The synthesis of an optically active organosilicon compound , (R)-2-t rimethy lsilyl-2-hydro xyl-ethy l-
cyanide , through enantioselective t ranscyanation of acety ltrimethylsilane w ith acetone cyanohydrin catalyzed by
(R)-oxynit rilase f rom defatted plum seeds in an aqueous/org anic biphasic sy stem w as carried out.The conver-
sion of acety ltrimethylsilane and enantiomeric excess of (R)-2-t rimethylsilyl-2-hydroxyl-ethylcyanide w ere de-
termined by gas chromatography on a β-cyclodex t rin chiral column.The influences of reaction time , particle size
of the crude enzyme , subst rate concentration , molar ratio of two substrates , and enzyme amount on the react ion
w ere investigated.Under the optimum conditions such as reaction time of 96 h , particle diameter of the crude
enzyme of 0.3 ～ 0.45 mm , acetylt rimethylsilane concentrat ion of 14 mmol/ L , acetone cyanohydrin to
acetylt rimethylsilane molar ratio of 2∶1 , and enzyme amount of 43.5 g/ L , both acetylt rimethy lsilane conversion
and enantiomeric excess of the product are as high as 99%.A comparative study shows that
acetylt rimethylsilane is a much bet ter subst rate fo r the (R)-oxynit rilase than its carbon counterpart 3 , 3-
dimethyl-2-butanone w ith respect to the react ion rate , substrate conversion , and product enantiomeric excess.
Key words:plum seed;(R)-oxynit rilase;acetylt rimethy lsilane;transcyanation;enantioselective synthesis;
(R)-2-trimethylsilyl-2-hydroxy l-ethylcy anide;(R)-ketone cyanohydrin;org anosilicon
第 27 卷 第 1 期 催　化　学　报 2006 年 1 月
Vol.27 No.1 Chinese Journal of Catalysis January 2006
　　光学活性氰醇及由其转化而成的 α-羟基酸
(酯)、α-羟基醛(酮)、α-氨基酸 、β-氨基醇和邻二醇
衍生物等是具有极大应用价值的手性中间体[ 1] .迄
今 , 醇腈酶催化醛与 HCN不对称合成光学活性醛
氰醇已得到广泛而深入的研究[ 2 ～ 4] .与此相比 ,醇
腈酶催化合成酮氰醇由于反应效率较低而研究甚
少.光学活性酮氰醇可转化为 α-羟基酸 ,后者在许
多手性天然化合物的合成中具有非常重要的应用
价值[ 5] .
　　有机硅化合物是一类非天然的化合物.近年来
的研究表明 ,许多有机硅化合物具有特殊的生物学
活性.由于有机硅化合物在诸多领域中的重要性以
及酶催化与化学催化相比表现出的独特优势 ,酶催
化有机硅化合物的不对称合成与转化近年来已逐渐
受到有机化学家及生物化学家的青睐[ 6] .Li等[ 7]首
次报道了杏仁醇腈酶催化含硅酮氰醇的不对称生物
合成 ,展现了醇腈酶在催化有机硅化合物生物合成
与转化中的诱人前景.有关来源于李子的(R)-醇腈
酶催化反应的研究 ,国际上仅 Kiljunen 等[ 8] 报道了
李子醇腈酶催化苯甲醛和对苯氧基苯甲醛与 HCN
的反应 ,获得的转化率分别为 89%和 42%, 产物
(R)-苯乙醇腈和(R)-对苯氧基苯乙醇腈的对映体
过量(ee)分别为 99%和 56%.
　　最近 ,我们首次发现来源于郁李仁的(R)-醇腈
酶能高效催化 2-三甲基硅-2-乙酮(ATMS)与 2-甲
基-2-羟基丙腈(ACH)立体选择性合成(R)-2-三甲
基硅-2-羟基丙腈[ 9] .本文系统探讨了酶促反应时
间 、酶粉颗粒大小 、底物浓度 、底物配比 、酶的添加量
和底物结构对该酶促反应的影响.
1　实验部分
1.1　醇腈酶的制备
　　(R)-醇腈酶为市售郁李仁(产地河北)粉碎后
经乙酸乙酯脱脂制得的粗制酶制剂.每批同一粒径
大小的郁李仁酶粉颗粒的醇腈酶比活力基本相同 ,
粒径为 0.3 ～ 0.45 mm 的酶粉颗粒的比活力为
1 009 U/g (一个酶活力单位定义为在 pH 5.4 和
25 ℃的条件下每分钟分解苯乙醇腈生成 1.0 μmol
苯甲醛所需的酶量)[ 10] .
1.2　醇腈酶催化含硅氰醇合成反应
　　在 50 ml的带塞三角瓶中装入 10 ml含有一定
量ATMS (Sigma 公司)和 ACH (Tokyo Kasei Ko-
gyo Co., Ltd)的异丙醚 , 再加入 20 μl 正十烷(内
标 ,Sigma公司)、1.5 ml pH 5.0柠檬酸缓冲液(0.1
mol/L)和一定量的酶制剂(粒径为 0.3 ～ 0.45 mm
的酶粉), 于 30 ℃和 150 r/min恒温振荡下开始反
应.定时从有机相中取样 0.1 ml (99%以上的
ATMS溶于有机相中)进行气相色谱分析.
　　气相色谱分析采用 Thermo Finnig an 型气相色
谱仪 ,配备 Auto Injector 3000 Thermo Finnig an 自
动进样器 , FID 检测器 , 手性柱为 β-Cyclodext rin
Column(柱径 0.32 mm , 柱长 30 m).分析条件为:
气化室温度 180 ℃, 检测室温度 250 ℃, 柱温 80 ℃
维持 2 min , 然后以 5 ℃/min升温至 125 ℃;氮气
为载气 ,流速 2.3 ml/min;分流比 1∶100;进样量
1 μl.在该分析条件下 , ATMS 、ACH 、内标 、产物
(S)-2-三甲基硅-2-羟基丙腈和(R)-2-三甲基硅-
2-羟基丙腈两对映体的保留时间分别为 1.722 ,
3.662 , 5.548 , 9.737和 9.843 min.气相色谱图中
产物 S 型和R 型两种对映体的保留时间依照相同
色谱条件下外消旋体 2-三甲基硅-2-羟基丙腈的保
留时间 ,并根据郁李醇腈酶已知的 R 构型推断酶催
化反应产物主要是 R 构型而确定.
　　采用内标法计算底物和产物的量.根据底物
ATMS 的减少计算转化率 , 以初始反应时间内
ATMS在单位时间内的减少或产物氰醇在单位时
间内的增加计算初始反应速率 ,根据产物氰醇两种
对映异构体的量计算光学纯度.产物的对映体过量
值定义为:
ee= cR -cS
cR +cS ×100%
其中 , cR 和 cS 分别表示反应后含硅氰醇 R 型和 S
型两种对映体的量.
2　结果与讨论
2.1　酶促反应的时间进程曲线
　　在 1.5 ml pH 5.0柠檬酸缓冲液和 10 ml异丙
醚的双相反应体系中 , 30 ℃和 150 r/min的反应条
件下 ,来源于郁李仁的(R)-醇腈酶催化 ATMS 与
ACH合成(R)-2-三甲基硅-2-羟基丙腈的反应进程
曲线如图 1所示.在反应的前 10 h , 转化率随反应
时间直线上升 , ee值高达 100%.此后 ,酶促反应速
率逐渐下降 ,至 96 h 时 ,反应达到平衡 ,转化率高达
99%.反应 20 h 以后 ,产物 ee值随反应时间的延长
而缓慢下降.这是由于酶促反应的同时存在一个生
成外消旋氰醇的竞争性非酶反应之故[ 4] .
26 催　化　学　报 第 27 卷
图 1　酶促反应的时间进程曲线
Fig 1　Time course of synthesi s of(R)-2-t rimethylsilyl-2-
hydroxyl-ethylcyanide catalyzed by (R)-oxynit ri-
lase f rom plum seeds
(Reaction conditions:1.5 ml pH 5.0 cit rate buf fer , 10 ml diiso-
propyl ether , 28 mmol/ L acetone cyanohydrin , 14 mmol/ L
acetylt rime-thylsi lane , 0.5 g(R)-oxyni trilase , 30 ℃, 150 r/min.)
2.2　酶粉颗粒大小对酶促反应的影响
　　酶粉颗粒大小对酶促反应初速率和产物的光学
纯度均有显著影响.由表 1可见 ,酶粉颗粒越小 ,酶
促反应初速率越大.这是由于颗粒越小 ,比表面积
越大 ,酶与底物接触的几率越大 ,故反应越快.同
时 ,酶粉颗粒越小 ,产物的光学纯度越高.这是因为
酶粉颗粒越小 ,具有对映选择性的酶促反应越快 ,而
非酶促反应速率基本不变 ,故产物的光学纯度越高.
但在本实验中 ,由于粒径小于 0.3 mm 的酶粉太细 ,
不易制备与操作 ,且反应振荡中有结团粘壁现象 ,导
致酶粉的比表面积随反应进行而逐渐减小 ,故产物
光学纯度有所下降.因此 ,选择粒径 0.3 ～ 0.45 mm
的酶粉为宜.
表 1　酶粉颗粒大小对酶促反应的影响
Table 1　Ef fect of the part icle size of crude enzyme on the plum
(R)-oxyni trilase-catalyzed reaction
Part icle size
(mm)
V 0
mmol/(L·h) t/ h
Conversion
(%)
ee
(%)
>0.9 0.30 122 96.7 97.5
0.45～ 0.9 1.24 96 97.8 98.5
0.3～ 0.45 1.34 96 99.0 99.0
<0.3 1.45 96 98.0 98.1
2.3　最适底物浓度的确定
　　从动力学角度看 ,底物浓度对酶促反应的影响
是显而易见的 ,因而无论在水相或水/有机溶剂双相
中研究底物浓度对酶促反应的影响都有重要意义.
在固定 ACH 与 ATMS 的摩尔比为 2∶1 的条件下 ,
考察了 ATMS浓度的变化对酶促反应的影响 ,结果
见表2.由表2可知 ,反应初速率随底物浓度的增大
而加快 ,但产物的光学纯度随底物浓度的增大而下
降.这是由于高浓度的底物在加速酶促反应的同时
也加速了非酶反应之故.综合考虑反应初速率 、底
物转化率和产物光学纯度 ,底物 ATMS的浓度以 14
mmol/ L为佳.
表 2　底物浓度对酶促反应的影响
Table 2　Effect of the substrate concent ration on the plum
(R)-oxynit rilase-catalyzed reaction
Acetyltrimethylsilane
concent rat ion(mmol/ L)
V0
mmol/(L·h) t/ h
Conversion
(%)
ee
(%)
7 0.70 96 99.0 99.0
14 1.34 96 99.0 99.0
28 2.56 96 96.8 98.5
42 2.80 96 83.6 93.6
56 3.05 75 76.7 86.6
70 4.49 75 71.0 81.7
2.4　底物配比对酶促反应的影响
　　醇腈酶催化 ATMS 与 ACH 合成 2-三甲基硅-
2-羟基丙腈是双底物反应 , ACH 作为氰基供体 ,其
浓度对反应必有重要影响.固定 A TMS 浓度为 14
mmol/L 不变 ,研究了底物摩尔比对酶促反应的影
响 ,结果见表 3.从表 3 可见 ,随着 ACH 与 ATMS
摩尔比的增大 ,反应初速率加快 ,产物 ee 值减小.
这主要是由于 ACH 浓度越高 ,释放出的 HCN 浓度
越高 ,从而极大地加快了竞争性非酶反应 ,故产物的
光学纯度降低.综合考虑酶促反应初速率 、底物转
化率和产物光学纯度 , ACH 与 ATMS 的摩尔比以
2∶1为宜.
表 3　两种底物的配比对酶促反应的影响
Table 3　Ef fect of the molar ratio of acetone cyanohydrin to
acetylt rimethylsilane on the plum (R)-oxynit ri-
lase-catalyzed reaction
Molar rat io of
acetone cyanohydrin
to acetylt rimethylsilane
V0
mmol/(L·h) t/ h
Conversion
(%)
ee
(%)
1∶1 0.68 122 67.1 99.0
2∶1 1.34 96 99.0 99.0
3∶1 1.99 96 99.2 96.2
4∶1 2.62 96 99.3 94.0
2.5　酶添加量对酶促反应的影响
　　从酶促反应动力学的角度来看 ,在一定范围内
单位反应介质中的酶添加量越大 ,酶促反应初速率
越大.从表 4的结果可以看出 ,提高单位反应介质
中的酶添加量可加速酶促反应 ,并提高产物的光学
27第 1 期 刘森林 等:水/有机溶剂双相中郁李醇腈酶催化含硅(R)-酮氰醇对映选择性合成
纯度.但单位反应介质中的酶添加量达到一定值
时 ,酶添加量的增加对酶促反应初速率的影响减小.
从经济角度考虑 ,选择单位反应介质中的酶添加量
为 43.5 g/L.
表 4　单位反应介质中的酶添加量对酶促反应的影响
Table 4　Ef fect of the crude enzyme amount on the plum
(R)-oxynitrilase-catalyzed reaction
Enzyme amount
(g/ L)
V 0
mmol/(L·h) t/ h
Conversion
(%)
ee
(%)
26.1 1.11 100 88.3 85.2
43.5 1.34 96 99.0 99.0
60.9 1.44 96 99.0 99.0
87.0 1.45 96 99.0 99.0
2.6　底物结构对酶促反应的影响
　　对比研究了郁李醇腈酶催化 ATMS 及其含碳
结构类似物 3 ,3-二甲基-2-丁酮与 ACH 反应合成相
应的(R)-氰醇 ,结果见表 5.
表 5　底物结构对酶促反应的影响
Table 5　Effect of substrate st ructure on the plum
(R)-oxynit rilase-catalyzed react ion
S ubst rate
V 0
mmol/(L·h) t/ h
Conversion
(%)
ee
(%)
(CH3)3SiCOCH3 1.34 24 50.2 99.9
96 99.0 99.0
(CH3)3CCOCH3 0.18 24 7.5 45.2
240 15.7 37.6
　　由表 5可见 ,郁李醇腈酶催化 ATMS 的反应在
反应初速率 、底物转化率和产物光学纯度等方面均
显著优于 3 , 3-二甲基-2-丁酮 ,表明与 3 , 3-二甲基-
2-丁酮相比 , ATMS 是郁李醇腈酶更合适的底物 ,
这与有关底物中硅原子对苦杏仁醇腈酶催化转氰反
应影响的研究结果类似[ 10] .郁李醇腈酶催化
ATMS 及其碳结构类似物转氰反应在酶促反应活
性方面的差异可能主要源于硅原子与碳原子的特性
不同.Kiljunen 等[ 8] 研究发现 ,杏仁醇腈酶催化羰
基化合物的酶促反应活性随与羰基碳原子相连基团
空间体积的增大而降低.由于(CH 3)3C-基团的空
间体积和空间位阻较大 ,故酶促反应活性较低.硅
原子的共价键半径(0.117 nm)几乎是碳原子共价
键半 径 (0.077 nm)的 1.5 倍 , 且 ATMS 中
Si-(C=O)键的键长(0.192 6 nm)也大于 3 ,3-二甲
基-2-丁酮中 C-(C=O)键的键长(0.151 nm), 使
(CH3)3Si-基团以及该基团上的三个甲基与羰基碳
原子之间具有较大的空间距离 ,空间位阻相对较小 ,
因而郁李醇腈酶催化 ATMS 反应具有相对较大的
反应活性.
3　结论
　　在来源于郁李仁的(R)-醇腈酶催化 2-三甲基
硅-2-乙酮与 2-甲基-2-羟基丙腈对映选择性合成
(R)-酮氰醇的反应中 ,酶促反应时间 、酶粉颗粒大
小 、底物浓度 、底物配比 、单位反应介质中的酶添加
量和底物结构均对酶活性有影响.本研究为酶法高
效合成具有重要应用价值的手性含硅氰醇提供了一
定的实验依据.今后还需进一步研究郁李醇腈酶的
酶学特性及更多含硅底物的酶催化反应 ,结合不同
含硅底物与其碳结构类似物在酶促反应行为上的差
异以及不同反应条件下酶分子构象的变化 ,深入研
究底物中的硅原子对酶促反应的影响机理.
参 考 文 献
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2　刘森林 , 宗敏华 , 余少文 , 张小云 , 邢苗.催化学报(Liu
S L , Zong M H , Yu Sh W , Zhang X Y , Xing M.Chin
J Catal), 2003 , 24(1):7
3　Solis A , Luna H , Manjar rez N , Perez H I.Tetrahedron ,
2004 , 60(46):10427
4　刘森林 , 宗敏华 , 涂然 , 周番.催化学报(Liu S L , Zong
M H , Tu R , Zhou F.Chin J Catal), 2001 , 22(1):67
5　Harada T , Hayashiy a T , Wada I , Iwa-ake N , Oku A.
J Am Chem Soc , 1987 , 109(2):527
6　Kawamoto T , Yamanaka H , Tanaka A.Appl Biochem
Biotechnol , 2000 , 88(1-3):17
7　Li N , Zong M-H , Peng H-S , Wu H-Ch , Liu Ch.J Mol
Catal B , 2003 , 22(1-2):7
8　Kiljunen E , Kanerva L T. Tetrahedron :Asymmetry ,
1996 , 7(4):1105
9　Liu S L , Zong M H , Huang Sh R.Chin Chem Lett ,
2005 , 16(10):1317
10　何俊 , 宗敏华 , 刘应瑾 , 张媛媛 , 吴虹.催化学报(He
J , Zong M H , Liu Y J , Zhang Y Y , Wu H.Chin
J Catal), 2005 , 26(4):335
(Ed LYX)
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