全 文 ：收稿　2003-01-09　　　　修定　2003-03-28
资助　国家科技攻关西部科技行动项目(No.2001BA901A32)。
　＊　通讯作者(E-mail:zfc@xju.edu.cn , Tel:86-991-8583517 ,
Fax:86-991-8583259)。
采用 RT-PCR扩增方法从犁苞滨藜中扩增 NHX 基因
李金耀 　张富春＊　马　纪　蔡　伦　鲍勇刚　王　宾(新疆大学生命科学与技术学院分子生物学重点实验室 ,
新疆生物资源基因工程重点实验室 , 乌鲁木齐 830046)
提要　采用 RT-PCR扩增的方法 , 从新疆野生植物犁苞滨藜中克隆获得 1.7 kb 的 cDNA片段 , 测序和序列分析表明该基因
片段包含 NHX 基因完整的读码框架。序列同源性分析结果显示犁苞滨藜 NHX 基因与滨藜 NHX 基因同源性高达 95%,
与碱蓬同源性达到 86%,与柑桔同源性为 88%,与拟南芥同源性为 84%, 表明它是植物中高度保守的一种基因 , 同时说明
野生植物犁苞滨藜中也存在与拟南芥相似的植物耐盐相关基因。
关键词　犁苞滨藜;NHX 基因;RT-PCR;植物耐盐
Using RT-PCR to Amplify the NHX Gene Fragment in Atriplex dimorphostegia
LI Jin-Yao , ZHANG Fu-Chun＊, MA Ji , CAI Lun , BAO Yong-Gang , WANG Bin(Key Laboratory of Molecular Biology , Col-
legeof Life Science and Technology , Xinjiang University , Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engi-
neering , Urumqi 830046)
Abstract　The NHX gene encodes functional protein that may play an important role in plant salt tolerance.
To clone the NHX f rom the w ild plant Atriplex dimorphostegia in Xinjiang into a T-vecto r , designed
primers were used to amplify 1.7 kb NHX cDNA fragment by RT-PCR.Sequence analy sis revealed that the
cloned NHX fragment of Atriplex dimorphostegia contained entire NHX coding region with 95%, 86%,
88% and 84% identity comparing wi th Atriplex gemelini , Suaeda marit ima , Citrus×paradisi and Ara-
bidopsis thal iana , respectively.This analysis suggested that NHX gene was highly conserved in terms of evo-
lution in plant;and i t also suggested that the NHX gene of Atriplex dimorphostegia was similar to that of
Arabidopsis.It may be of great importance in improvement of the plant salt tolerance and breeding of crop.
Key words　Atriplex dimorphostegia;NHX gene;RT-PCR;salt tolerance
　　土壤盐分是制约作物产量的因素之一 ,世界耕
种土地的大约 20%和接近一半的灌溉土地都遭到
盐胁迫的伤害[ 1] 。高浓度盐会导致植物体离子的
紊乱 ,造成高渗胁迫 ,并抑制植物组织和器官的生
长和分化 ,提早植物的发育进程。
随着分子遗传学和植物转基因技术的发展 ,采
用生物技术提高作物的耐盐性 ,使作物在盐胁迫环
境中能正常生长并提高产量 ,正受到越来越多的关
注 ,并取得了一定的成果 。提高作物耐盐性的方法
很多 ,如操纵生物合成途径 ,在作物体内表达耐盐
相关基因或蛋白 , 改变基因的胁迫反应特性
等[ 2 ,3] 。目前 ,已经证实 SOS盐胁迫信号途径在植
物耐盐中起关键的调控作用 ,同时也控制着离子的
自身稳定(homeostasis)[ 2 ,4 ,5] 。
犁苞滨藜为藜科(Chenopodiaceae)滨藜属(A-
triplex)植物 ,生长于新疆准噶尔盆地流动和半固
定沙丘和盐碱土上 ,耐盐碱 ,其对于利用野生耐盐
碱植物来改良作物性状 ,培育作物新品种 ,改良盐
碱土壤和退沙还耕均有重要意义 。 NHX 基因是
一类与植物耐盐性密切相关的基因。本文运用
RT-PCR技术从犁苞滨藜 mRNA 中扩增出 NHX
基因片段 ,以期为探讨植物的耐盐机制和作物优良
品种的培育提供参考 。
材料与方法
1　材料和试剂
　　犁苞滨藜(Atriplex dimorphostegia)采自新疆
五家渠准噶尔盆地干旱盐碱地区 。pMD18-T 测序
载体购自 Takara公司 。大肠杆菌 DH5α菌株为本
实验室保藏菌种。RNA提取试剂盒 、PCR产物回
收试剂盒 、DNA 标准分子量 、BamH Ⅰ和 Hin d Ⅲ
限制性内切酶 、exTaq酶以及 RT-PCR和 PCR引
物均购自 Takara 公司 ,测序试剂盒购自美国PE 公
司 ,其它试剂均为分析纯 。
2　犁苞滨藜总 RNA的提取
　　依据操作试剂盒进行。
3　RT-PCR反应
　　根 据已 发 表 的 滨藜 NHX 基 因 序 列
(9857313),设计 PCR 引物序列为:P1:ATGTG-
GTCACAG TTAAGCTCTT T;P2:CTATGTTCT-
GTCTACCAAATTGT TGGTGC 。 依 照 TaKaRa
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DOI :10.13592/j.cnki.ppj.2003.06.007
RNA PCR Kit操作指南进行 。反转录用寡聚脱氧
胸腺嘧啶作下游引物 , 反应条件:42℃ 30 min ,
99℃5 min , 5℃5 min。PCR反应用 NHX 基因序
列设计特异性引物。扩增参数:94℃5 min;94℃
30 s , 52.5℃ 30 s , 72℃2 min , 35个循环;72℃
10 min。反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测 。
4　NHX基因 cDNA的克隆
　　按 Takara公司 PCR 产物回收试剂盒说明书
进行 PCR产物的回收。回收的 NHX cDNA 片段
与pMD18-T 载体在 T4 DNA 连接酶的作用下
16℃过夜 ,使 NHX cDNA 连接到 pMD18-T 的载
体上 。连接产物转化感受态细胞 ,感受态的制备及
转化按参考文献 6。
5　重组质粒的鉴定
　　按参考文献 6 进行质粒 DNA 的小量提取 。
提取后质粒分别用 K pn Ⅰ 、EcoRⅠ和 HindⅢ双酶
切进行重组质粒的鉴定 ,酶切反应结束后进行琼脂
糖凝胶电泳鉴定。正确的克隆进行质粒的大量提
取。
6　犁苞滨藜 NHX cDNA的序列测定及分析
　　为鉴定克隆的 cDNA 序列 , 对 pMD18-T/
NHX重组质粒进行纯化 , 并用 BcaBEST primer
RV-M 和 BcaBEST primer M 13-47 对犁苞滨藜
NHX cDNA 在 PE377 全自动测序仪进行双向
DNA序列测定 , 所得序列用 PE公司 SeqEd v1.0.
3软件进行分析。
实验结果
1　RT-PCR产物
　　采用提取的总 RNA ,以寡聚脱氧胸腺嘧啶为
引物进行反转录得到单链cDNA ,再以设计的PCR
图 1　犁苞滨藜 NHX cDNA RT-PCR扩增
Fig.1　Amplification of NHX cDNA by RT-PCR
from Atriplex dimorphostegia
1.DL2 000分子量标记;2.NHX cDNA。
图 2　重组质粒 pMD18-T/ NHX酶切分析
Fig.2　Identification of the recombinant plasmid
pMD18-T/NHX
　　1.DL2000 分子量标记;2.pM D18-T/NHX 用 BamH Ⅰ 和
HindⅢ酶切。
图 3　犁苞滨藜 NHX 基因 cDNA 序列
Fig.3　The sequence of NHX cDNA in Atriplex dimorphostegia
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图 4　犁苞滨藜 NHX 基因与滨藜 、碱蓬 、柑桔 、拟南芥 NHX 基因的同源性比较
F ig.4　Homology analysis of the NHX cDNA of Atriplex dimorphostegia with Atriplex gemelini ,
S uaeda maritima , Citrus×paradisi and Arabidopsis thaliana
引物进行扩增得到 NHX 基因片段。 RT-PCR产
物经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定(图 1),可见一条约
1 700 bp的条带 ,与我们预计的一致。
2　测序载体
　　RT-PCR产物与克隆载体 pMD18-T 连接 ,构
建了重组质粒 pMD18-T/NHX 。重组质粒用
BamH Ⅰ和 Hin dⅢ酶切 ,切出约 1 700 bp DNA 片
段(图 2),与预计的连接片段大小相同。
3　犁苞滨藜 NHX cDNA序列
　　对 pMD18-T/NHX 重组质粒用 BcaBEST
primer RV-M 和 BcaBEST primer M13-47 进行双
向测序 ,测序结果如图 3。
4　所测序列的同源性
　　用 DNAMAN对犁苞滨藜 NHX 基因与滨藜 、
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碱蓬 、柑桔 、拟南芥 NHX 基因进行同源性分析 ,其
同源性分别为 95%、86%、 88%和 84%(图 4),表
明所克隆的 cDNA 为 NHX 基因。测定序列区间
包含了 NHX 的完整读码框架。
讨　　论
　　本文通过 RT-PCR技术扩增犁苞滨藜 NHX
基因。 根据已发表 的滨藜 NHX 基因序列
(9857313)设计引物 , 从犁苞滨藜总 RNA 中扩增
出目的片段 , 该片段与滨藜 NHX 基因同源性高
达 95%, 与碱蓬同源性达到 86%, 与柑桔同源性
为88%, 与拟南芥同源性为 84%。NHX 基因可
能编码了一种功能性蛋白产物 , 其功能在于提高
植物的耐盐水平 。虽然不同植物 NHX蛋白质的氨
基酸组成成分有一定差异 , 但其疏水性和跨膜结
构是非常保守的 , 推测其跨膜结构与 NHX的功能
有着密切的关系 。
液泡膜中的 Na+/H+反向运输体可促进离子
在液泡中的区隔效应 ,跨液泡膜的 pH 为其提供能
量。前人通过功能上恢复 Na+/H+反向运输体
(ScNHX1)缺陷型酵母突变体 ,已从拟南芥中分离
出了 AtNHX 1基因 ,并且与哺乳动物 NHE反向运
输体具有序列相似性[ 7～ 9] 。在转基因拟南芥和转
基因番茄中过量表达 AtNHX 1 ,可在液泡膜中积
累大量的运输体 ,并且极大地提高它们的耐盐
性[ 7 ,9 ,10] 。这些结果显示 AtNHX 家族在钠离子
的液泡区隔效应中起关键的作用。
钠离子和氯离子区隔在液泡中 ,不仅可作为有
效的渗透调节剂 , 同时还可减小对细胞产生的毒
性[ 11 , 12] 。植物细胞的生长主要是由液泡体积膨胀
调控的 ,钠离子和氯离子的区隔不仅有利于渗透调
节 ,而且对于细胞的发育也是必须的。
总之 , NHX 基因在植物中是非常保守的 ,而
且在植物耐盐水平方面起重要作用。这为进一步
研究滨藜属植物 NHX 基因的功能 ,以及为采用该
基因提高植物耐盐水平 ,改良农作物品种方面奠定
了基础。
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