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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-02-29
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31171478）, 吉林省自然科学基金项目（20101573）
作者简介 : 田智蕊 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 植物分子生物学 ; E-mail: tzhr1987@163.com
通讯作者 : 杨美英 , 女 , 博士 , 副教授 , 研究方向 : 生物化学与分子生物学 ; E-mail: biochesola@yahoo.cn
病程相关蛋白（pathogenesis-related protein，PRP/
PRs）是指由寄主植物编码，在病理或病理相关的
环境下诱导产生的一类蛋白质 ［1］。PRs 最早由 Van
Loon 和 Van Kammen［2］于 1970 年在烟草花叶病毒
（TMV）诱发产生过敏性坏死反应的烟草叶片中检测
到。之后，病程相关蛋白的研究报道日渐增多。已
发现的病程相关蛋白被归类为 17 个家族［3］。
PR-5 蛋白是 PRs 蛋白家族中的一类，也被称为
类甜蛋白（thaumatin-like protein，TLP）［4］。PR-5 蛋
白包含了具有多种抗逆功能的渗调蛋白（osmotin）
和类渗调蛋白（OLP），可能使它在植物中具有不同
的生理生化功能。大量研究表明，PR-5 蛋白不仅能
诱导真菌类的细胞程序性死亡（PCD）［5］，保护植
物免受病害的侵染，还能通过诱导植物细胞的 PCD，
增强植株整体对冻害的抵抗［6］。冬黑麦叶片的质外
体内分泌的 PR-5 蛋白在低温诱导下，与抗冻蛋白有
着同样的抗冻功效［7］。目前，已经从大麦［8］、玉米［9］、
番茄［10］和小麦［11］等植物中发现了 PR-5 蛋白。
GmOLPa 蛋白是大豆在盐诱导下所产生的一类
蛋白，称为大豆类渗透蛋白，属于大豆 PR-5 家族。
前人研究表明，该蛋白具有抗盐功能，为更好的在
蛋白水平上研究 GmOLPa 的功能。本试验从盐处理
大豆 GmOLPa基因的蛋白序列分析及原核表达
田智蕊 韩红 武志海 李东哲 杨美英
（吉林农业大学，长春 130118）
摘 要： 以盐诱导后的大豆根为材料，提取总 RNA，RT-PCR得到 GmOLPa目的片段。对其蛋白序列分析表明，该蛋白
属于 GH64-TLP-SF同源超家族中的 PR-5蛋白，第 25-244位氨基酸是其保守结构域，与番茄中的 PR-5亲缘关系最为接近。构建
GmOLPa基因 ORF的原核表达载体 pET-28-GP，并对其在大肠杆菌 BL21中的表达条件进行优化。SDS-PAGE证实重组质粒能够在
大肠杆菌 BL21中表达，目的蛋白分子量约为 30 kD，最佳诱导时间为 4 h，最佳 IPTG诱导浓度为 1.0 mmol/L。
关键词： PR-5蛋白 GmOLPa蛋白 基因克隆 蛋白序列分析 原核表达
Protein Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of GmOLPa
Gene from Soybean
Tian Zhirui Han Hong Wu Zhihai Li Dongzhe Yang Meiying
（Jilin Agricultural University，Changchun 130118）
Abstract: In order to identify the function of GmOLPa gene from soybean，total RNA was extracted from the root of soybean induced by
salt stress and GmOLPa gene fragment was obtained by RT-PCR. GmOLPa protein sequence was analyzed and the results showed that GmOLPa
protein belonged to PR-5 of GH64-TLP-SF homologous superfamily and was the most closely genetic relationship with the PR-5 from tomato. The
25-244 amino acids in the GmOLPa protein sequence were the conservative domain. Prokaryotic expression vector pET-28-GP of GmOLPa gene
was constructed and expressive conditions of pET-28-GP in E. coli BL21 were optimized. SDS-PAGE was assayed and showed that recombinant
plasmid could be inducted and expressed in E. coli. The target protein molecular weight was approximately 30 kD，the optimal induction time of
4 h and the optimal IPTG induction concentration of 1.0 mmol/L.
Key words: PR-5 protein GmOLPa protein Gene cloning Protein sequence analysis Prokaryotic expression
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期70
的大豆根中克隆了大豆 GmOLPa 基因，对其蛋白序
列进行分析并构建原核表达载体，在大肠杆菌中得
到有效地表达。旨为下一步蛋白的纯化、活性分析、
抗体的制备的试验奠定基础，同时也为研究该蛋白
在植物抗盐诱导途径中的功能，以及探索 GmOLPa
蛋白可能具有的其他功能提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料、质粒和菌种 大豆种子（吉育
38）、 E. coli JM109、BL21（DE3）及质粒 pET-28a（+）
为本实验室保存。
1.1.2 主要试剂 DNA 凝胶回收试剂盒购自天根生
化科技有限公司。Ex Taq酶，T4 DNA 连接酶，核
酸限制性内切酶 Hind Ⅲ，XhoⅠ，λ-Hind Ⅲ DNA
Marker，蛋白分子量标准（14.3-97.2 kD），pMD18-T
载体，总 RNA 提取试剂盒和反转录试剂盒购自
TaKaRa 公司。PCR 引物由上海生物工程公司合成。
异丙基-β-D-硫代半乳糖甘（IPTG）、卡那霉素（Kan）、
100 bp DNA Marker 购自北京鼎国生物工程公司。
1.2 方法
1.2.1 GmOLPa 基因的克隆 当大豆幼苗长到六叶
时，用 300 mmol/L NaCl 浇灌，诱导 48 h，取根进行
RNA 的提取，具体操作参照文献［12］。
GmOLPa 基因的扩增引物序列如下：GmOLPa-F：
5-ATTTCGCCAAGCATCTAC-3；GmOLPa-R：5- AG-
AGCACATCCCGCCAGAG-3。扩增程序：94℃ 2 min；
94℃ 30 s，52.5℃ 30 s，72℃ 1 min 5 s，循环 30 次 ；
72℃ 10 min。将扩增的目的片段回收后克隆到 pM-
D18-T 载体上，转化 E. coli JM109 感受态细胞，37℃
过夜培养。从平板上挑取单菌落，进行 PCR 和双酶
切（Hind Ⅲ / XbaⅠ）鉴定，由上海生工生物工程公
司进行序列测定。将测序正确的质粒命名为 pMD18-
T-Gm。
1.2.2 GmOLPa 基因 ORF 的 PCR 扩增 以 pMD18-
T-Gm 质粒为模板，用以下引物扩增目的片段 ：
GP-S：5-CCCAAGCTTGTTCAACAAACGCCACA-
AT-3（下划线部分为 Hind III 位点）；GP-A：5-CCC-
TCGAGTAATTAAGGGCAAAACAC-3’（下划线部分
为 Xho I 位点）。扩增程序 ：94℃ 2 min ；94℃ 30 s，
53℃ 30 s，72℃ 45 s， 循 环 33 次 ；72℃，10 min。
扩增后的目的片段命名为 GP。
1.2.3 原核表达载体 pET-28-GP 的构建 将 PCR 扩
增后的目的片段 GP 利用凝胶回收试剂盒回收，用
T4 DNA 连接酶将同时经双酶切（Hind Ⅲ /XhoⅠ）
的 GP 片段与 pET-28a（+）进行连接，连接体系转
化 JM109 感受态细胞，37℃过夜培养。从平板上挑
取单菌落提取重组质粒进行 PCR 和酶切鉴定。阳性
质粒用于蛋白的诱导表达。
1.2.4 pET-28-GP 在大肠杆菌中的诱导表达 将重
组质粒 pET-28-GP 转入到受体菌 BL21 中诱导。待
菌液OD600 = 0.6-0.8时加入 IPTG使其终浓度达到1.0
mmol/L，分别诱导 1、2、3、4、5 和 6 h 离心收集菌体；
在 IPTG 浓度分别为 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2
mmol/L 7 个梯度下诱导 4 h，离心收集菌体，具体操
作详见参考文献［13］。 同时以含 pET-28a（+）的
大肠杆菌 BL21 为对照。
1.2.5 蛋白序列分析 GmOLPa 蛋白结构域采用
GenBank DNA 数据库进行 BLAST 同源性比较分析。
采用 DNAMAN 生物软件对 GmOLPa 蛋白和 Thaum-
atin-like 家族部分成员构建系统发育树，并对亲缘关
系较近的成员进行结构域的比较。
2 结果
2.1 GmOLPa基因的克隆
以经盐处理 48 h 的大豆根为材料提取总 RNA，
并以反转录后得到的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，
在约 1 000 bp 处有一条清晰地特异性片段（图 1-A），
大小与预测值相符。用 DNA 凝胶回收试剂盒将扩增
出的片段进行回收，并将回收片段克隆到 pMD18-T
A：1. 阴性对照（水）；2. GmOLPa基因的 PCR扩增； B：3. 阴性对照（水）；
4. 质粒 pMD18-T-Gm的 PCR鉴定；C：5. 质粒 pMD18-T-Gm的酶切鉴定
图 1 GmOLPa基因的扩增及 pMD18-T-Gm质粒的鉴定
2012年第9期 71田智蕊等 ：大豆 GmOLPa 基因的蛋白序列分析及原核表达
载体上。对构建的 pMD18-T-Gm 质粒分别进行 PCR
和酶切鉴定。从图 1-B 和图 1-C 看出，GmOLPa 基
因与 T 载体连接成功。用 DNAMAN 软件分析序列
测定结果，表明扩增的 DNA 序列与 GenBank 发表的
GmOLPa 基因的序列 （AB116251）达到 99% 相似性。
2.2 蛋白序列分析
通过 NCBI 在线软件对 GmOLPa 蛋白综合分析
表明，其保守结构域是从 25 个氨基酸到 244 个氨基
酸，属于 GH64-TLP-SF 超家族。GH64-TLP-SF 超家
族 又 分 为 TLP-PA、TLP-P、Thaumatin-like、GH64-
TLP-SF、THN 和 Thaumatin 几个家族，每个家族都
有其不同的特点，其中 Thaumatin-like 家族（PR-5 家
族）与宿主的防御有关。对 GmOLPa 蛋白和 Thaum-
atin-like 家族部分成员进行系统发育树的分析，结果
（图 2）显示，GmOLPa 蛋白与番茄中的逆渗透蛋白
（AAB41124）亲缘关系最为接近，而与 Thaumatin-
like 家族中其他成员亲缘关系相距较远。
将 GH64-TLP-SF 超家族的结构域与番茄 TLP-
NP24-Ⅰ（PDB：2I0W_A）蛋白的结构域［14］进行对比，
结果（图 3）发现，两者的结构与部分相似，两者
均具有 3 个结构域，而且 3 个结构域的组成成分相
同，即结构域 I 都是由多个 β-折叠形成一个 β 夹心，
但两者的 β-折叠数有所差别；结构域 II都是由1个 α-
螺旋、3α-螺旋区构成，不同的是 TLP-NP24-Ⅰ蛋白
结构域还有一个 β-折叠，而 GH64-TLP-SF 超家族结
构域则没有 β-折叠；两者的结构域 III 相同，均较短，
1 个长环结构和 1 个 β-折叠。
图 2 GmOLPa蛋白和 Thaumatin-like家族部分
成员系统发育树
2.3 原核表达质粒pET-28-GP的构建
以 pMD18-T-Gm 质粒为模板，PCR 扩增后得到
的 GP 为目的片段（图 4-A），大小为 700 bp，pET-
28a（+）-GP 的 PCR 和酶切鉴定结果，如图 4-B，
图 4-C。PCR 得到预期的目的片段，大小为 700 bp。
重组质粒 pET-28a（+）-GP 和质粒 pET-28a（+）分
别经 Hind Ⅲ /XhoⅠ双酶切后得到的 700 bp 左右的
片段及载体片段与预期的片段大小相符。
2.4 GP基因在大肠杆菌中的诱导表达及优化
将重组质粒 pET-28-GP 转化到表达菌 BL21 中，
利用 8% 的 SDS-PAGE 对经 IPTG 分别诱导 1、2、3、4、
5 和 6 h 的菌液进行分析。从图 5-A 中可以看出在约
A. GH64-TLP-SF超家族保守结构域；B. 番茄的 TLP-NP24-I 结构域
图 3 GH64-TLP-SF超家族结构域与番茄的 TLP-NP24-I结构域比较
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期72
30 kD 处发现一条目的条带。在分别诱导 1-6 h 后，
GP 蛋白均有表达，在 1-4 h 时，GP 蛋白的表达量
随着诱导时间的延长而有所增加，在诱导 5-6 h 时，
GP蛋白的表达量随着诱导时间的延长而减少。因此，
诱导 4 h 时更有利于 GP 蛋白的表达。
不同 IPTG 终浓度对目的蛋白的诱导表达结果
见图 5-B。从图中可以看出 GP 蛋白随着 IPTG 终
浓度的增加表达量有所增加，在 IPTG 终浓度为
1.2 mmol/L 时，GP 蛋白的表达量比 IPTG 终浓度为
1.0 mmol/L 时有所减少。因此在 IPTG 终浓度为 1.0
mmol/L 时更最有利于 GP 蛋白的表达。
长时间的诱导处理，有 60%-61% 的氨基酸和烟草
逆渗透蛋白 （S34794）、蕃茄 NP24（AF093743）相似。
大多 PR-5 蛋白链内具有二硫键是其固有的特
性［16］。PR-5 蛋白富含的二硫键很大程度上提高了
该蛋白的稳定性，使它能抵抗蛋白酶、热激、极端
pH 等的降解作用［17］。本研究利用 NaCl 处理的大豆
根为材料，成功克隆了大豆 GmOLPa 基因的序列。
对 GmOLPa 蛋白的保守序列进行分析，通过分析可
知从 25 个氨基酸到 244 个氨基酸是其保守结构域，
在该区域内存在 17 个 Cys，有利于二硫键的形成，
这一点与大多 PR-5 蛋白的固有特性相符。
大多数 PR-5 的分子量为 21-26 kD，也有一些
分子量较小，为 17.5 kD 左右［18］。本试验中原核表
达的目的片段仅是 GmOLPa 基因的 ORF，所以目
的蛋白收集自菌体。SDS-PAGE 表明目的蛋白的分
子量约为 30 kD，可能是因为 GmOLPa 蛋白与 pET-
28a（+） N 端 His 标签形成了融合蛋白的结果，单
一目的蛋白的分子量应为 25 kD，这与 PR-5 蛋白的
分子量基本符合，但这与前人的研究结果略有差异，
可能是由于试验方法等的不同造成的。对该蛋白表
达的条件进行优化，结果显示，在 IPTG 浓度为 1.0
mmol/L，诱导 4 h 时可获得最大的表达量。这将为
以后蛋白的纯化以及后续研究提供重要参考。
4 结论
本试验从盐诱导后的大豆根中克隆得到了大小
为 1 049 bp 的目的基因 GmOLPa。GmOLPa 蛋白保
守结构域是从 25 个氨基酸到 244 个氨基酸，属于
GH64-TLP-SF超家族。对GmOLPa蛋白和Thaumatin-
like 家族部分成员构建系统发育树，发现 GmOLPa
蛋白与番茄中的逆渗透蛋白（AAB41124）亲缘关系
最为接近。将 GH64-TLP-SF 超家族的结构域与番茄
TLP-NP24-Ⅰ（PDB ：2I0W_A）蛋白的结构域进行
对比，发现两者的结构域 III 相同，而结构域 I 和结
构域 II 略有差别。
以重组质粒 pMD18-T-Gm 为模板，扩增到 700
bp 的用目的片段 GP，构建原核表达载体 pET-28-
GP。并在大肠杆菌系统中进行了重组蛋白的诱导及
优化表达，结果目的蛋白分子量约为 30 kD，最佳
条件为 1.0 mmol/L IPTG 诱导 4 h。
图 4 原核表达质粒 pET-28-GP的构建及鉴定
A ：1. PCR 扩增 GmOLPa 基因的 ORF ；B ：2. 重组质粒 pET-
28-GP 的 PCR 鉴定；C：3. 重组质粒 pET-28-GP 的双酶切鉴定；
4. 质粒 pET-28a(+) 的双酶切
A：1. BL21(pET-28a)的诱导结果；2-7. 分别为BL21(pET-28-GP)诱导1-6
h的结果；B：1. BL21(pET-28a)的诱导结果；2-8. 分别为 BL21(pET-
28-GP) 在 IPTG终浓度为 0-1.2 mmol/L时的诱导结果
图 5 GP蛋白的表达优化
3 讨论
PR-5 蛋白与植物体内的甜蛋白在氨基酸序列上
有很高的同源性，因此又被称作类甜蛋白（TLP）。
Hu 等［15］从拟南芥中克隆了一个编码类甜蛋白的
cDNA 序列，能被病原菌和水杨酸诱导。GmOLPa 蛋
白是由 Onishi 等［12］于 2006 年在大豆盐诱导时发现
的。研究表明，GmOLPa 蛋白在根中可以通过改变
盐的压力条件来快速的诱导，而在茎和叶中需要更
2012年第9期 73田智蕊等 ：大豆 GmOLPa 基因的蛋白序列分析及原核表达
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）