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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(1):213-219
收稿日期 ：2015-03-16
基金项目 ：国家自然科学基金项目（81460283），内蒙古自然科学基金项目（2014MS0810），自治区研究生科研创新项目［S201410127（Y02）］
作者简介 ：张柱霞，女，硕士研究生，研究方向 ：生物化学和分子生物学，E-mail ：836796250@qq.com ；孙明英同为本文第一作者
通讯作者 ：邵国，男，博士，教授，研究方向 ：低氧神经保护 ；E-mail ：shootshao@163.com
低氧预适应（Hypoxic preconditioning）是指一
次或多次短暂、非致死性低氧刺激后，可以增强
机体对致死性缺血 / 低氧的耐受性，是一种细胞内
源性保护机制的启动［1］。据流行病学研究显示临
床上各种心血管疾病都与缺血 / 低氧有着密切的联
系［2］，但是低氧预适应的应用却研究甚少。前期
的实验研究显示低氧预适应影响 DNA 的甲基化，
DNA 甲基化是表观遗传学中很重要的研究方向，
5-Aza-CdR 对低氧 NG108-15 细胞的影响机制研究
张柱霞  孙明英  杨洁  姜树原  闫少春  邵国
（包头医学院中心实验室生物医学研究中心，包头 014010）
摘 要 ： 通过使用 DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）抑制剂 5- 氮 -2 脱氧胞苷（5-aza-2deoxycytidine，
5-Aza-CdR）和低氧干预神经细胞系 NG108-15，旨为揭示 5-Aza-CdR、低氧、低氧预适应对 NG108-15 细胞增殖和细胞周期影响的
相关机制。利用 5-Aza-CdR（10.0 μmol/L）孵育 NG108-15 细胞后进行低氧与低氧预适应处理 ；使用倒置显微镜观察细胞形态的变
化 ；通过 RTCA 分析细胞增殖指数 ；收集细胞后使用流式细胞仪检测各组细胞周期和细胞凋亡的变化情况 ；利用 Real-time PCR 检
测甲基转移酶 DNMTs 和细胞周期相关基因在 mRNA 水平的表达变化情况。结果表明，5-Aza-CdR 和低氧抑制 NG108-15 细胞增殖，
促进细胞早期和晚期凋亡，低氧预适应促进细胞的增殖。然而，5-Aza-CdR 处理后再低氧与低氧预适应，DNMTs 和细胞相关周期
基因的 mRNA 转录增加（P<0.05）。10.0 μmol/L 的 5-Aza-CdR 联合低氧处理抑制细胞的增殖，低氧预适应对细胞的增殖有促进作用。
关键词 ： NG108-15 细胞 ；5- 氮 -2 脱氧胞苷 ；低氧 ；低氧预适应
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.01.034
The Affecting Mechanism of 5-aza-2-deoxycytidine on the NG108-15
Cells in Hypoxia
ZHANG Zhu-xia SUN Ming-ying YANG Jie JIANG Shu-yan YAN Shao-chun SHAO Guo
（Biomedical Research Center of Center Laboratory，Baotou Medical College，Baotou 014010）
Abstract: The aim of this study is to explore the mechanisms of 5-aza-2deoxycytidine（5-Aza-CdR）and/or hypoxia and/or hypoxic
preconditioning on the proliferation and cycle of NG108-15 cells while using the inhibitor（5-Aza-CdR）of DNA methyltransferases（DNMTs）
to interfere the nerve cell line NG108-15. The 10.0 μmol/L 5-Aza-CdR was added to cell culture medium, and then cells were treated in hypoxia
and/or hypoxic preconditioning. The cell morphology was observed under inverted microscope. The proliferation of NG108-15 was measured
using the RTCA. The cell apoptosis and cell cycle were analyzed through flow cytometry analysis. The mRNA levels of DNMTs and cell cycle-
associated gene were analyzed by real-time PCR. 5-Aza-CdR and hypoxia inhibited NG108-15 cells proliferation, promoted cell early and late
apoptosis, and hypoxic preconditioning promoted cell proliferation. However, as cells were treated by hypoxic or hypoxic preconditioning after
the cell treated with 5-Aza-CdR, DNMTs and mRNA transcription of cell cycle-associated genes increased. Conclusively, the jointed treatment of
10.0 μM 5-Aza-CdR with hypoxic inhibited the proliferation of nerve cell line NG108-15, and hypoxic preconditioning had a promoting effect on
the cell proliferation.
Key words: NG108-15 cell line ；5-aza-2-deoxycytidine ；hypoxic ；hypoxic preconditioning
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1214
对 DNA 进行甲基化修饰的酶是甲基转移酶（DNA
methyltransferases，DNMT），已发现了 3 种有催化活
性的转移酶［3］：DNMT1、DNMT3A 和 DNMT3B。
核苷酸类似物 5-Aza-CdR［4］作为去甲基化的试
剂，以其抑制 DNMTs 而广泛应用于表观遗传学的研
究［5］。由于 DNA 甲基化在正常细胞的周期中有重
要作用，5-Aza-CdR 对细胞的周期、分化和死亡产
生影响［6］。5-Aza-CdR 在肿瘤的治疗方面有广泛的
应用［7］，因其可掺入 DNA 中抑制 DNA 的复制。其
在神经发育和分化，突触可塑性、学习记忆，以及
维持神经元的生存等相关基因的表达方面具有重要
作用［8］。
NG108-15 细胞系由 Bernd Hamprecht 于 1971 年
建立，目前已在国内不少实验室传代和利用，并将
其作为生物模型［9］和药物作用靶点进行研究［10］。
NG108-15 细胞作为神经细胞模型，由于其细胞膜
上存在多种离子通道和受体［11］，在神经生物学相
关研究领域是一种优良的模型，并得到广泛地应
用。5-Aza-CdR 对肿瘤细胞系细胞周期的影响已有
报道［12-15］，但其对神经细胞周期的影响尚未见报道。
因此，本研究利用小鼠神经细胞系 NG108-15 为实
验材料，通过研究 5-Aza-CdR 和低氧预适应对细胞
的影响，旨为在体内研究 5-Aza-CdR 对神经系统的
影响奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
细胞 NG108-15 细胞购于上海细胞所。
Dulbecco，s Modified Eagle Medium（GIBCO 公司）；
5-Aza-CdR（Sigma 公司）；TRIzol（TaKaRa 公司）；
superscript III（Invitrogen 公 司 ）；2 X real-time PCR
Mix（南京凯基）；其余试剂为国产试剂。CO2 培养
箱（Therom）；三气培养箱（Therom）；xCELLigence
DP 系统（艾森生物公司提供）；流式细胞仪（BD
FACSCantoTM Ⅱ ）。Real-time PCR 仪（ABI 公 司
7900-HT）。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及 5-Aza-CdR 的配制 NG108-15 细
胞于含 10% 新生牛血清的 Dulbecco，s Modified Eagle
Medium 培养基，37℃、CO2 体积分数为 5% 的培养
箱内培养。5-Aza-CdR 粉末溶于 PBS 中配成浓度为 1.0
mmol/L 的贮存液，过滤后 -20℃保存。
1.2.2 NG108-15 细胞的 5-Aza-CdR 和低氧处理 当
细胞达到指数生长期时进行实验，实验分为 4 组 ：
C 组（空白组）、H 组（低氧组）、Ha 组（10 μmol/L
5-Aza-CdR+ 低氧组）、HP（低氧预适应组）。低氧预
适应组条件 ：低氧（1%O2 /5% CO2 /94% N2）30 min
和常氧（21% O2 /5% CO2 /75%N2）30 min 交替进行，
共 4 个循环，然后低氧 8 h，复氧 8 h ；低氧组是直
接低氧刺激 8 h，然后复氧 8 h。收集细胞。
1.2.3 RTCA 测定细胞的增殖 NG108-15 细胞株在
进行细胞毒性实验前一天进行细胞传代，当细胞融
合度在 60%-80% 之间，从培养箱中取出细胞，悬
浮细胞，调整细胞浓度达 8×104 个 /mL。E-plate 置
于仪器检测台上测试培养基的基线。上室孔中加入
细胞悬液，室温放置 30 min。测定 24 h 内细胞贴壁
生长情况。10 μmol/L 的 5-Aza-CdR 药物处理，24 h 后，
3 个 E-plate 分别进行不同条件的处理，对照、低氧、
低氧预适应处理。实时检测细胞增值指数。
1.2.4 NG108-15 细胞流式测定凋亡和周期 收集细
胞悬液，用 PBS 缓冲液洗 3 遍，加入预冷的 70% 的
乙醇固定 1 h，用 3 mL PBS 在流式管中洗一遍，用
1 mL PI 染色 4℃避光反应 30 min。测定细胞周期的
变化。
预 冷 的 PBS 洗 细 胞 悬 液 3 遍， 用 1 mL 的
Binding buffer 悬浮细胞，转移 100 μl 到流式管中，
染色，涡旋震荡，室温避光放置 15 min，补加 400
μL 的 Binding buffer。测定细胞凋亡的变化。
1.2.5 Real-time PCR 检 测 DNMT 各 亚 型 在 转 录 水
平的表达变化 TRIzol 法提取各组细胞的总 RNA，
Nondrop 2000 微量分光光度计检测总 RNA 的纯度和
含量。使用的 superscript III 试剂盒（Invitrogen 公司）
逆转录总 RNA 成为 cDNA，于 -20℃保存。引物由
Invitrogen 公司合成（表 1）。
Real-time PCR ：Real-time PCR 的条件与先前发
表 文 章 相 同［7］。Real-time 检 测 中 CCND1、CCND2
和 DNMTs 的 CT 值通过 β-actin 的 CT 值均一化，即
ΔCT= CT 目标基因 -CTbeta-actin，而 DNMTs mRNA 相对
丰度值以 ΔΔCT 值（DD value）表示，ΔΔCT=2-ΔCT。
1.2.6 统 计 学 处 理 用 SPSS 10.0 数 据 统 计 软 件
2016,32(1) 215张柱霞等：5-Aza-CdR 对低氧 NG108-15 细胞的影响机制研究
ANOVA 和 Tukey 对组间数据进行处理和分析，数值
以 x
-
±s 表示。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 倒置显微镜观察细胞形态图
NG108-15 细 胞 分 别 进 行 C、H、Ha、HP 四 种
不同的处理，24 h 后倒置显微镜下观察它们的形态
变化情况。图 1 可以看出，C 组细胞呈现上皮性贴
壁生长，细胞呈多角形，形状不规则，轮廓清楚，
细胞间结构紧密，细胞生长旺盛（图 1-C）；H 组有
少部分细胞形态出现了皱缩，多角形态趋于规则，
细胞密度降低，细胞间接触变松，部分细胞体积缩
小，胞核固缩，染色质凝集成块状，折光性及贴壁
能力减弱，增殖减慢，细胞存活数减少，生长状态
变差（图 -H）；Ha 和 HP 组细胞形态较 H 组有一定
程度的好转，不过 HP 组表现比较明显，表明低氧
预适应可以很明显增强细胞的耐受性。
2.2 RTCA监测加入5-Aza-CdR前后低氧预适应细
胞增值变化情况。
上一阶段实验已经证明 5-Aza-CdR 对细胞的抑
制浓度为 10 μmol/L［2］。通过 RTCA（实时定量细胞
动态监测）分析 C、H、Ha 和 HP 组对细胞增殖的
作用，如图 2 所示。与 C 组相比，H 组和 Ha 组都
抑制了细胞的增殖（P ≤ 0.05，n=6），HP 促进细胞
的增殖（P ≤ 0.05，n=6）。与 H 组相比，Ha 组进一
步抑制了细胞的增殖（P ≤ 0.05，n=6），可见低氧
和 5-Aza-CdR 都抑制细胞的增殖，而低氧预适应对
细胞增殖有一定的促进作用。
表 1 引物序列
引物名称 引物序列（5-3）
DNMT1F AACCTTCACCTAGCCCCAG
DNMT1R CTCATCCGATTTGGCTCTTTCA
DNMT3A F GACAAGAATGCCACCAAAGC
DNMT3A R CGTCTCCGAACCACATGAC
DNMT3B F AGGGAAGACTCGATCCTCGTC
DNMT3B R GTGTGTAGCTTAGCAGACTGG
CCND1 F GCGTACCCTGACACCAATCTC
CCND1 R GCGTACCCTGACACCAATCTC
CCND2 F GAGTGGGAACTGGTAGTGTTG
CCND2 R GCACAGAGCGATGAAGGTC
β-ACTIN F AGGTGAAGGTCGGAGTCA
β-ACTIN R GGTCATTGATGGCAACAA
C H
Ha HP
图 1 不同处理下的细胞显微形态图（100×）
0 50 100 150
0.0
0.5
1.0
1.5
C
H
Ha
HP
t/min
ce
ll
in
de
x
图 2 RTCA 测定 NG108-15 细胞在不同情况下的增长指数
2.3 5-aza-CdR对低氧预适应处理的NG108-15细胞
周期和凋亡的影响
10.0 μmol/L 的 5-Aza-CdR 处理 24 h 后，进行低
氧、低氧预适应处理，24 h 后，使用流式细胞仪测
定 C、H、Ha、HP 组细胞的周期和凋亡变化情况（图
3），单纯的低氧很明显的促进了细胞的早期和晚期
凋亡，低氧预适应对细胞凋亡有抑制作用。加入
5-Aza-CdR 后再低氧，与对照组相比促进细胞的凋亡，
但没有直接低氧组表现明显。细胞周期变化不是很
显著，但是可以观察到 5-Aza-CdR 联合低氧组细胞
G2 期表达增加（图 4）。
2.4 5-Aza-CdR对低氧预适应处理的NG108-15细
胞甲基转移酶和细胞相关周期基因的影响
收集细胞，提取 RNA，反转录为 cDNA。使用
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1216
Real-time PCR 检测它们的表达变化情况（图 5）。以
mRNA/beta-actin mRNA 的 相 对 丰 度 表 示，H 组 较
C 组， 其 DNMT1、DNMT3A 和 DNMT3B mRNA 表
达 显 著 降 低（0.1619±0.1157 VS 0.584 9±1.121 3，
1.433 7±1.027 2 VS 6.323 5±8.637 0，0.272 6±0.226
5 VS 0.910 2±1.499 1）；HP 组 较 H 组 其 DNMT1、
DNMT-3A 和 DNMT3B mRNA 表达显著升高（1.297 6
±1.347 1 VS 0.161 9±0.115 7，4.397 1±3.776 2
VS 1.433 7±1.027 2 和 0.781 2±0.778 5 VS 0.272
6±0.226 5，P≤0.05，n=9）；Ha 组 较 H 组 其
DNMT1、DNMT3A 和 DNMT3B mRNA 表 达 显 著 升
高（1.5236±1.9031 VS 0.161 9±0.115 7，18.690
2±19.326 3 VS 1.433 7±1.027 2 和 2.122 3±2.364 3
VS 0.272 6±0.226 5，P≤0.05，n=9），低氧很明显
地抑制了甲基转移酶的地转录水平。低氧预适应和
加入 5-Aza-CdR 后低氧同样会提高甲基转移酶转录
图 3 5-Aza-CdR 对低氧预适应的神经细胞 NG108-15 凋亡的影响
C H HP Ha
0
1
2
3
groups
㓶㜎ᲊᵏ߻ӑ
C H HP Ha
0
2
4
6
groups
㓶㜎ᰙᵏ߻ӑ
Q1 Q2
Q3
102
102
103
104
PI
-A
105
CK-P1
103
FITC-A
104 105
Q4
Q1 Q2
Q3
102
102
103
104
PI
-A
105
H-P1
103
FITC-A
104 105
Q4
Q1 Q2
Q3
102
102
103
104
PI
-A
105
Ha-P1
103
FITC-A
104 105
Q4
Q1 Q2
Q3
102
102
103
104
PI
-A
105
Hp-P1
103
FITC-A
104 105
Q4
0.025 3.9
0.775 7.12
0.825
4.85
0.3
0.9
2016,32(1) 217张柱霞等：5-Aza-CdR 对低氧 NG108-15 细胞的影响机制研究
水平，且表现为统计学意义。
细胞周期相关基因，以 mRNA/beta-actin mRNA
的相对丰度表示（图 5），H 组较 C 组，其 CCND1
和 CCND2 mRNA 表达显著降低（0.429 7±0.641 9 VS
0.696 6±0.906 4，0.169 2±0.170 2 VS 0.417 1±
0.674 4），HP 组较 H 组其 CCND1 和 CCND2 mRNA
表达显著升高（0.565 4±0.581 8 VS 0.429 7±0.641 9
P≤0.05，n=9，0.524 0±0.468 2 VS 0.169 2±0.170 2），
Ha 组 较 H 组 其 CCND1 和 CCND2 mRNA 表 达 显 著
升高（0.646 5±0.738 6 VS 0.429 7±0.641 9 P≤0.05，
0
20
40
60
80
100
HC㓶㜎ઘᵏਈॆ% HP Ha
G1 G S G1 G S G1 G S G1 G S
图 4 流式测定 NG108-15 细胞周期情况
C H HP Ha
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
*
*
groups
D
N
M
T1
re
la
tiv
e
m
R
N
A
le
ve
l beta-actin as control
C H HP Ha
0
10
20
30
*
*
groups
D
N
M
T3
A
re
la
tiv
e
m
R
N
A
le
ve
l beta-actin as control
C H HP Ha
0
1
2
3
4
*
groups
D
N
M
T3
b
re
la
tiv
e
m
R
N
A
le
ve
l beta-actin as control
C H HP Ha
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
groups
C
C
N
D
1
m
R
N
A
le
ve
l bate-actin as control
C H HP Ha
0.0
0.5
1.0
1.5
*
*
groups
C
C
N
D
2
m
R
N
A
le
ve
l bate-actin as control
H
C
HP
Ha
H
C
HP
Ha
H
C
HP
Ha
H
C
HP
Ha
H
C
HP
Ha
图 5 甲基转移酶 DNMTs 和细胞周期相关基因在空白组、低氧预适应组和加入 5-Aza-CdR 后低氧预适应
处理组的 RNA 转录水平的表达情况
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.1218
n=9，1.305 5±1.280 0 VS 0.169 2±0.170 2），低氧很
明显的抑制了细胞周期相关基因地转录水平。低氧
预适应和加入 5-Aza-CdR 后低氧同样会提高转录水
平，且表现为统计学意义。
3 讨论
本实验利用细胞模型进行研究 5-Aza-CdR 和低
氧预适应对细胞的影响。细胞形态学的变化告诉我
们，5-Aza-CdR 和低氧处理都会使细胞的形态、伸
展性、贴壁性变差，而低氧预适应处理细胞则会使
它们都有所好转。RTCA 细胞增值曲线显示，5-Aza-
CdR 和低氧抑制细胞的分裂增殖，低氧预适应很明
显地促进分裂增殖，其增殖速度甚至超过了空白对
照。我们猜测低氧和 5-Aza-CdR 抑制了细胞内部的
某种生长、分裂因子，使细胞的生长增殖信号传递
受到抑制，表现为低氧和 5-Aza-CdR 处理后细胞的
生长增殖受到抑制，而低氧预适应促进细胞的生长
增殖，为在临床上抑制肿瘤和促进正常细胞的增殖
提供了理论指导。因此我们可以通过使用一定浓度
的 5-Aza-CdR 和一定程度的低氧来抑制肿瘤细胞的
生长，而同样可以通过采用低氧预适应的方法来预
防或治疗临床上由于缺血缺氧造成的各种疾病，使
症状得到一定程度的改善。
细胞凋亡结果提示我们，加入 5-Aza-CdR 后再
进行低氧处理促进早期细胞的凋亡，但是对晚期细
胞的凋亡促进作用不是很明显，直接低氧处理对细
胞早期和晚期凋亡都有很明显的促进作用。而低氧
预适应对细胞的早期、晚期凋亡都表现为明显的抑
制作用。实时定量 PCR 结果显示低氧抑制甲基转移
酶和细胞周期相关基因的转录水平，而加入 5-Aza-
CdR 或是低氧预适应处理后，它们的转录水平都提
高，且都有显著性的统计学差异。
文 献 报 道 5-Aza-CdR 对 DNMT1 有 抑 制 作
用［15，16］，这与 5-Aza-CdR 对小鼠神经细胞 NG108-
15 的作用相似，同时看到低氧抑制了甲基转移酶的
转录，但是在低氧后加入 5-Aza-CdR 后却很大程度
的促进了甲基转移酶的转录水平。这与低氧预适应
有相同的表达。5-Aza-CdR 处理的细胞再进行低氧
处理后，却进一步抑制了细胞增殖。猜测 5-Aza-CdR
配合低氧提高甲基转移酶的活性，DNA 的甲基化表
达增加，能关闭某些基因的活性，从而达到抑制肿
瘤的目的。同样这种处理使细胞周期相关基因表达
提高，使细胞阻滞在 G2 期。低氧预适应对细胞增
殖具有促进作用，提高低氧条件下的耐受性。
5-Aza-CdR 联 合 低 氧 和 低 氧 预 适 应 条 件 下，
DNMTs 和细胞周期相关基因有相同的表达水平，但
是前者表现为抑制细胞增殖，而后者却表现为促进
细胞增殖作用。可见 5-Aza-CdR 联合低氧对细胞的
抑制作用还有其它的途径。而且报道 DNA 甲基化以
突触可塑性的机制在大脑中参与学习记忆［17-20］，但
是其具体机制尚不清楚。这两个问题需要我们更深
一步的探索。
4 结论
低氧抑制细胞的增殖，5-Aza-CdR 联合低氧抑
制细胞的增殖但是对 DNMTs 和细胞周期相关基因的
表达却有促进作用。低氧预适应对 DNMTs 和细胞周
期相关基因的表达却有促进作用，同时促进细胞的
增殖。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）