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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-03-02
作者简介 : 刘大和 , 男 , 硕士研究生 , 研究方向 : 微生物与生化药学 ; E-mail: liudahelc@gmail.com
通讯作者 : 陈劲春 , 男 , 教授 , 博士生导师 , 研究方向 : 基因工程药物 ; E-mail: jinchunchen@hotmail.com
随着基因工程技术的发展，大肠杆菌被广泛用
于高水平表达有重要价值的外源性蛋白质，但是使
用大肠杆菌高水平表达的产物大多数是没有活性的
包涵体［1］，这就需要一个有效的手段把非活性状态
的包涵体蛋白转化为有活性的天然状态。因疏水作
用而引起的蛋白聚集是包涵体正确复性率极低的根
本原因。传统的稀释复性和透析复性能通过控制蛋
白质的起始浓度（10-50 μg/mL）防止聚集，获得相
对较高的复性产率，但是这两种方法耗时长，操作
繁琐，不适合工业化大规模复性［2］。凝胶过滤色谱
法复性是近年来发展较快的一种蛋白复性方法，具
有抑制聚集，活性回收率高，可以在较高蛋白浓度
下复性，并且同时可以使蛋白质得到纯化的优点。
尿素梯度凝胶过滤色谱是在装柱过程中引入了一个
尿素梯度，当变性液流经色谱柱时缓慢的降低变性
液浓度，进一步抑制了聚集体的产生［3］。Gu 等［4］
使用尿素梯度凝胶过滤成功的复性了溶菌酶，活性
回收率高达 90%，蛋白起始浓度也高达 17 mg/mL。
重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ（rhDNaseⅠ） 是特
异性 DNA 水解酶［5］，它是由 260 个氨基酸组成的
单体糖蛋白包含 2 个二硫键和 2 个潜在的 N-连接糖
基化位点［6］。DNaseⅠ与系统性红斑狼疮、胃肠道
重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的复性及活性鉴定
刘大和 张允 郭雄军 郭平川 Sorajo Umar 李锦秀 陈劲春
（北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029）
摘 要： 建立尿素梯度凝胶过滤复性重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的方法。将诱导表达的重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ包涵体通过
初步纯化后变性，然后在尿素梯度凝胶过滤色谱柱 Sephadex G-75中复性，洗脱流速 0.4 mL/min，复性完毕后透析除去小分子复性剂，
使用琼脂糖电泳法检验其有活性后，再用单向酶扩散法测定其酶活力为 655.8 U/mg，复性得率为 83.7%。最后通过 LC-ESI-MS/MS
从氨基酸序列组成上证明复性产物是重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ。结果表明，建立的方法能成功用于复性变性的重组人脱氧核糖核
酸酶Ⅰ包涵体蛋白，获得了可用于结构和功能研究的具有生物学活性的重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ。
关键词： 重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ 尿素梯度 凝胶过滤 包涵体 复性 酶活
Refolding and Biological Activity Determination of Recombinant
Human DNaseⅠ
Liu Dahe Zhang Yun Guo Xiongjun Guo Pingchuan Sorajo Umar Li Jinxiu Chen Jinchun
（College of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029）
Abstract: The on-column refolding of recombinant human DNaseⅠwas developed by urea gradient gelchromatography. After
purification，recombinant human DNaseⅠinclusion body was renatured by the urea gradient gel chromatography with 0.4 mL/min elution
speed. Collect the target and then remove the small molecules by dialysis. Test by agarose electrophoresis and biological activity was 655.8 U/mg
by the single-phase enzymes spread determining. The fragments from the target protein were sequenced by LC-ESI-MS/MS. The amino acid
sequences of the fragments tested were matching well with the sequence of human DNase Ⅰ from the database，by which the target protein was
determined. These results demonstrated that the developed strategy here can be used successfully to produce biologically active recombinant
human DNase Ⅰ for the investigation of structure and function.
Key words: Recombinant human DNaseⅠ Urea gradient Gel chromatography Inclusion body Renature Biological activity
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肿瘤和心肌梗死的发生密切相关［7］。目前商品化的
rhDNase Ⅰ已用于治疗系统性红斑狼疮和囊性纤维
化病。虽然人 DNase Ⅰ可以从尿液中获得，但尿液
中人 DNase Ⅰ质量浓度很低，因此采用基因工程法
制备 rhDNase Ⅰ将具有很大的优势。
本实验室构建人 DNase Ⅰ融合表达载体 pETD-
NASE 在大肠杆菌 Rosetta（DE3）表达为包涵体，
研究尿素梯度凝胶过滤对包涵体的复性，并验证复
性蛋白的生物活性，旨在为基因工程法大规模制备
rhDNase Ⅰ奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
含人 DNase Ⅰ基因质粒 pETDNASE 的大肠杆菌
工程菌 Rosetta（DE3），由本实验室保存。琼脂糖
V3121 超纯 ：Promega 公司 ；Golden view ：华美生物
工程公司 ；IPTG ：Amresco 进口分装 ；Tris、DTT、
GSH、GSSH ：北京欣经科生物技术有限公司 ；其余
试剂均为市售分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 rhDNaseⅠ的诱导表达 将实验室保存的质粒
pETDNASE 的大肠杆菌工程菌 Rosetta（DE3）接种于
LB 液体培养基中（含 50 mg/L 氨苄青霉素，33 mg/L
氯霉素），于 37℃，160 r/min 摇床培养过夜。将培
养好的种子液接种于 2×YT 发酵培养基，培养至
OD600=0.8 左 右 加 入 诱 导 剂 IPTG 至 终 浓 度 0.5
mmol/L，诱导 4 h 后收集菌体。
1.2.2 包涵体的制备 将菌体称重后按质量体积
比（W/V，1 2） 悬于细胞洗涤液（100 mmol/L Tris-
HCl，10 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA），100 mmol/L
NaCl，pH8.0）中洗涤，离心收集沉淀。用 10 倍
体积细胞洗涤液重新悬浮菌体，超声波破碎细胞，
镜检无完整的大肠杆菌后离心收集沉淀，即得到
rhDNase Ⅰ的包涵体粗品。将包涵体粗品分别用包
涵体洗涤缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，2 mol/L 尿素，
pH8.0）和去离子水分别洗涤两次和一次后离心，离
心收集沉淀即获得精制的包涵体。
1.2.3 尿素梯度凝胶过滤复性［3，4］ 将精制包涵体
加入包涵体裂解液（8 mol/L 尿素，100 mmol/L Tris-
HCl，0.2 mol/L DTT，pH8.0）中，冰浴磁力缓慢搅拌
使其溶解。然后 4℃离心，取上清。配置 Buffer A
（0.1 mol/L Tris，1 mmol/L EDTA，0.9 mmol/L GSH，
0.18 mmol/L GSSH，pH8.0）和 Buffer B（0.1 mol/L Tris，
1 mmol/L EDTA，8 mol/L Urea，0.9 mmol/L GSH，0.18
mmol/L GSSH，pH8.0）。首先使用混合液（Buffer A
Buffer B=75 25）平衡色谱柱，然后逐渐增加 Buffer
B 至 100%，在色谱柱上层形成一个 2-8 mol/L 的尿
素梯度，将变性蛋白过 0.45 μm 滤膜 3 次后上样，
上样完毕后使用 Buffer B 洗脱。装置如图 1 所示。
图 1 尿素梯度凝胶过滤色谱复性装置
1.2.4 重组蛋白质量浓度及酶活力测定
1.2.4.1 蛋白质量浓度测定 按照 Bradford 法［8］，
测定蛋白质量浓度。
1.2.4.2 琼脂糖电泳法检验酶活 取 1% 大肠杆菌
基因组 DNA 按 1 10（V/V）加入酶反应缓冲液
（1 mmol/L CaCl2，0.2 mol/L 乙酸 - 乙酸钠缓冲液，pH
8.0）充分混合，然后在其中加入复性蛋白，37℃酶切。
酶切完毕后反应液做胶浓度 0.8% 的琼脂糖电泳。
1.2.4.3 单向酶扩散法测定酶活［9，10］ 在 11 mL 的
反 应 缓 冲 液（100 mmol/L MES，20 mmol/L MgCl2，
2 mmol/L CaCl2，pH6.5）中加入 350 μL 1% 鲑鱼精
DNA，4 μL Golden view，充分搅拌，50℃水浴 10
min ，再将其倒入溶液（11 mL 2% 融化琼脂糖），搅
拌均匀立即倒入凝胶盘中制成厚度约 2 mm 的凝胶，
冷却后在凝胶上打孔（r0=1.0 mm），间隔 15 mm。取
制备好的不同稀释度的 DNase Ⅰ标准溶液及其它
2012年第9期 157刘大和等 ：重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的复性及活性鉴定
样品点样于孔中，在 37℃恒温湿度箱中孵育 16 h，
在紫外线下测量 DNA 溶圈直径 3 次取平均值。DN-
ase Ⅰ酶活的对数值与溶圈半径（r-r0）成线性关系。
1.2.5 LC-ESI-MS/MS鉴定 rhDNaseⅠ SDS-PAGE后
切下目标蛋白，经脱色、Trypsin 酶切、肽提取等步骤，
使用 LC-ESI-MS/MS 系统对蛋白进行测序，得到的肽
谱图与 rhDNase Ⅰ蛋白序列用 SEQUEST 检索软件进
行比对。
2 结果
2.1 蛋白表达与包涵体的制备
工程菌 Rosetta（DE3）经 IPTG 诱导后表达出目
标蛋白，经 SDS-PAGE 分析，出现明显的重组蛋白
质条带，其相对分子质量为 33 kD 与 rhDNase Ⅰ理
论分子量相一致（图 2），并且该条带也存在于胞内
的不溶组分中，胞内的可溶组分中较少。对电泳图
片条带 2 做 BandScan 分析，表达的融合蛋白占细胞
总蛋白的 18.9%。
2.3 重组蛋白的尿素梯度凝胶过滤复性
将包涵体变性液上清过 0.45 μm 膜后直接上
Sephadex G-75 柱，使用 buffer B 洗脱，通过测定洗
脱液在 280 nm 的吸收获得洗脱曲线（图 4）。以 0.4
mL/min 的流速进行洗脱，280 nm 主要有两个吸收峰，
分别收集，后经酶活检验确认主峰为 rhDNase Ⅰ吸
收峰，小峰为 DTT 吸收峰。
图 4 rhDNaseⅠ尿素梯度凝胶过滤复性色谱图M. 蛋白质 Marker ；1. 诱导前全菌液 ；2. 诱导后全菌液 ；3. 胞内不溶组分
图 2 rhDNaseⅠ在大肠杆菌中的表达
2.2 包涵体的初步纯化
使用洗涤缓冲液（50 mmol/L Tris-HCl，2 mol/L
尿素，pH8.0）对 rhDNase Ⅰ包涵体进行洗涤，使目
标蛋白得到初步纯化。图 3 可以看出超声破碎细胞
后收集的沉淀中含有大量的杂蛋白，使用含 2 mol/L
尿素的包涵体洗涤液洗涤包涵体后杂蛋白的种类和
数量都有了明显的减少。最后通过双蒸水的洗涤尿
素被除去，杂蛋白进一步减少，包涵体得到了初步
的纯化。酵结束后，500 mL 发酵液可得到湿菌体
2.54 g，经超声破碎，洗涤离心后得到湿包涵体 1.53 g，
冷冻干燥后得到包涵体 0.08 g。
M. 蛋白质 Marker ；1. 超声后离心收集 ；2. 包涵体洗涤液洗涤后离心
收集 ；3， 4. 分别是双蒸水洗涤第一次和第二次后离心收集
图 3 包涵体的洗涤
2.4 重组蛋白的酶活力测定
尿素梯度凝胶过滤复性得到的蛋白经透析除去
小分子复性剂后，酶切大肠杆菌基因组 DNA，并用
琼脂糖电泳法定性检验酶活（图 5）。对照条带为未
酶切的基因组 DNA，条带 1-7 为经过复性蛋白酶切
的基因组 DNA，酶切 2 h DNA 条带明显变暗，酶切
8 h DNA基本被完全降解。经尿素梯度凝胶过滤复性，
重组蛋白具有了生物活性。
图 6 是利用单向酶扩散法定量测定 rhDNase Ⅰ
的酶活力的图片。DNA 与 Golden view 结合在紫外光
照射下产生荧光，而 DNA 被酶降解的部位形成暗色
区域，在图像上表现为形成溶解圈。A 组和 B 组为
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重复试验组，可以明显看到随着酶浓度的提高，溶
解圈的半径逐渐变大。在紫外光下测量 DNA 溶解圈
直径 3 次取平均值，对照标准酶活与溶解圈半径的
对数关系（图 7），并结合 Bradford 法测得的复性蛋
白浓度，计算得出 rhDNase Ⅰ酶活为 655.8 U/mg。
编号 1，2，3 肽段裂解的 b、y 型离子峰图，图下方
有其相应的氨基酸序列。
M. 未加复性蛋白 ；1-5. 分别为 20, 40, 60, 80, 100 μg/mL 复性蛋白
图 6 单向酶扩散法测 rhDNaseⅠ酶活
M. DNA ladder ；对照 . 未酶切的基因组 DNA ；1-7. 分别是酶切 2-8 h
图 5 琼脂糖电泳法测 rhDNaseⅠ酶活
图 7 标准 DNaseⅠ酶活与溶解圈半径的对数关系
2.5 LC-ESI-MS/MS鉴定rhDNaseⅠ
将复性蛋白进行 SDS-PAGE 后，切下目标蛋白，
经脱色，trypsin 酶切，肽提取等步骤，使用 LC-ESI-
MS/MS 系统对蛋白进行测序，检测到了 rhDNase Ⅰ
经酶切的 5 个特异性肽段（表 1），氨基酸覆盖率达
到了 25.38%，得分 680.23，远大于 30，基于此可以
判断该蛋白为 rhDNase Ⅰ。图 8 中 a，b，c 分别为
表 1 LC-ESI-MS/MS检测到的肽段
编号 肽段序列 MH+ 位置
1 DSHLTAVGK 927.49 42-50
2 YDIALVQEVR 1205.65 32-41
3 IVVAGMLLR 971.61 214-222
4 IAAFNIQTFGETK 1439.75 3-15
5 LLDNLNQDAPDTYHYVVSEPLGR 2629.29 51-73
图 8 肽段质谱图
a-c. 肽段 1-3 的裂解离子峰
3 讨论
工程菌诱导表达时，虽然胞内存在少量可溶重
组蛋白，但是经酶切反应证明这些蛋白不具有生物
活性，表达获得 rhDNase Ⅰ主要存在于包涵体中，
必须通过变性、复性等工序使包涵体恢复生物活
性。由于包涵体在制备过程中可能混有少量细胞碎
片，所以在包涵体变性前需进行初步纯化，使用低
浓度的变性剂进行洗涤可以除去脂类、脂多糖、核
酸和杂蛋白等非目标产物。常用的洗涤剂有尿素、
TritonX-100 等，洗涤后包涵体的主要成分为聚合
态重组蛋白。王国华等［12］研究表明，2 mol/L 尿素
2012年第9期 159刘大和等 ：重组人脱氧核糖核酸酶Ⅰ的复性及活性鉴定
可以在不破坏包涵体的前提下溶解非包涵体形式的
蛋白。本试验使用包涵体洗涤液对包涵体进行的洗
涤初步纯化了包涵体蛋白，这可以由包涵体洗涤后
上清蛋白的电泳和尿素梯度复性的单个蛋白峰得到
证明。
包涵体纯化后进行尿素梯度凝胶过滤色谱复性，
当变性蛋白通过带有尿素梯度的色谱柱时，变性剂
浓度降低，促使蛋白折叠，伸展状态的蛋白转化为
中间体结构，其 Stokes 半径变小，复性蛋白分子进
入凝胶颗粒内部，扩散速度变慢，可以抑制中间体
分子的聚集［13］。变性液蛋白的浓度，洗脱速度和进
样体积对尿素梯度凝胶过滤复性有很大的影响。随
着洗脱流速的加快，柱压增大色谱柱可能被堵塞，
导致复性收率下降，对于凝胶过滤色谱复性来说，
较长的保留时间有助于变性蛋白的复性。同样，随
着蛋白起始浓度的增加，色谱柱的复性效率也有了
不同程度的降低，说明蛋白的起始浓度增加会导致
聚集体的增加，更有甚者有可能堵塞色谱柱。上样
体积的增大也会引起复性率下降的状况，导致这种
情况的原因与前者类似，因为流动相中蛋白浓度增
大，蛋白分子之间的间距缩短，加剧了聚集体的产生。
尿素梯度凝胶过滤复性收集的复性蛋白经透析
除去变性液，冷冻干燥进行浓缩。使用 Bradford 法
测定复性蛋白的浓度，结合复性液体积可以得出最
终具有生物活性的蛋白质量。用这个质量与最初得
到的包涵体质量对比就可以计算出复性回收率。通
过对比，当洗脱流速 0.4 mL/min，变性液蛋白浓
度 10 mg/mL，上样体积 3 mL，复性回收率最大为
83.7%。使用单向酶扩散法测定酶活性，rhDNase Ⅰ
酶活力为 655.8 U/mg。最后通过 LC-ESI-MS/MS 分析
复性产物氨基酸的组成进一步证明了具有生物活性
的复性产物为 rhDNase Ⅰ。
4 结论
37℃培养的工程菌 Rosetta（DE3）经 IPTG 诱导
后表达的 rhDNase Ⅰ主要以包涵体形式存在。尿素
梯度凝胶过滤色谱复性方法能成功用于 rhDNase Ⅰ
包涵体的复性，该方法简单可行，复性回收率高，
能获得可用于结构和功能研究的具有生物学活性的
rhDNase Ⅰ。
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（责任编辑 马鑫）