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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第4期
作为一种环境污染物，高氯酸根（ClO4
-）最
早于 1997 年被美国加利福尼亚州饮用水卫生监测
部门发现，当地 278 个检测井的 109 口中有高氯酸
收稿日期 ：2013-10-31
基金项目 ： 国家自然科学基金项目（41272268），中国地质调查局项目（1212011121171），中央高校基本科研业务费专项资金（2652012071）
作者简介 ：谢宇轩，男，博士研究生，研究方向 ：地下水污染生物修复 ；E-mail ：yuxuanxie@163.com
通讯作者 ：关翔宇，女，博士，讲师，研究方向 ：环境微生物 ；E-mail ：guanxy@cugb.edu.cn
自养条件下高氯酸盐降解细菌群落研究
谢宇轩1  关翔宇2  于丽莎1  刘菲1 
（1. 中国地质大学水资源与环境学院，北京 100083 ；2. 中国地质大学海洋学院，北京 100083）
摘 要 ： 旨在研究自养条件下以氢气作为电子供体高氯酸根离子（ClO4
-）的微生物降解机制，利用 HiSeq 2000 对微生物群
落结构及多样性进行高通量测序及分析。结果表明，添加氢气的 HD（hydrogen degradation）体系将 10 mg/L ClO4
-降至检出限以下
共经历 71 d。ClO4
-完全降解后 HD 体系中总细菌的相对丰度为 84.96%，绝大多数降解细菌分布的变形菌门相对丰度为 68.11%，占
总细菌数的比例达到 80.16%。其中属于 β-变形杆菌纲的 ClO4
-代表性降解细菌（perchlorate-reducing bacteria，PRB）Dechloromonas
的相对丰度为 2.7%，另一种 Azospira 为 3.1%。通过 KEGG 注释对菌种功能进行分析。参与糖代谢的基因相对丰度为 4.75%，参与
能量代谢的基因相对丰度为 3.35%，其中参与氮循环的基因相对丰度为 0.72%，参与氯代物降解和氯循环的基因相对丰度为 0.83%，
补充氢气对反应体系内生物群落结构变化起到选择纯化作用，使优势菌群趋于单一。
关键词 ： 高氯酸根离子（ClO4
-） 电子供体 氢气 细菌群落结构 高通量测序
The Study of the Structure of Perchlorate（ClO4
-）-degrading Bacterial
Communities Under Autotrophic Conditions
Xie Yuxuan1 Guan Xiangyu2 Yu Lisha1 Liu Fei1
（1. School of Water Resources and Environment，China University of Geosciences，Beijing 100083 ；2. School of Ocean Sciences，
China University of Geosciences，Beijing 100083）
Abstract:  For the purpose of further investigating the biological degradation under an autotrophic condition and well understanding the
microbial community structures in a complex environment, hydrogen was used as an electron donor to completely reduce perchlorate（ClO4
-）in
this study. The composition of microbial communities after degradation was analyzed via the construction of a cloning library by using the High-
Throughput Sequencing method（HiSeq 2000）. 71 days were needed to completely degrade 10 mg/L ClO4
-. Microbial phylogenic analysis of
HD（hydrogen degradation）after degradation indicated that the relative abundance of total bacteria in the HD was 84.96% whereas the relative
abundance of Proteobacteria was 68.11%, whose percentage accounting for the total bacteria reached to 80.16%. The relative abundance of
Dechloromonas which is representative in PRB was 2.7% in the HD. Simultaneously, the relative abundance of Azospira was 3.1%. KEGG was
used to analyze the function of bacteria in HD. The relative abundance of genes which engaged in carbohydrate metabolism was 4.75%, and the
genes included in energy metabolism was 3.35%, whereas the genes participated in nitrogen cycle was 0.72%, and the genes involving chloride
transformation was 0.83%. It was demonstrated that degradation of ClO4
- in a complicated condition was achieved by various kinds of microbes
rather than a single one. Adding hydrogen as an electron donor to change microbial community played a role in the purification or selection
process in the system, which allowed the complex systems to have the specific capacity to remove given contaminates.
Key words:  Perchlorate（ClO4
-） Electron donor Hydrogen The composition of microbial communities High-Throughput
Sequencing
盐的检出（包括地下水和地表水）［1，2］。至 2007 年
美国已有超过 400 个位点的地下水，地表水，饮用
水和土壤中都有高氯酸盐污染的检出发现。目前已
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期170
有报道的高氯酸盐污染最大质量浓度，饮用水中为
811 μg/L ；地下水中为 3.7×106 μg/L，地表水中为
1.2×105 μg/L［3］。2011 年美国 EPA 制定的最新规划
将高氯酸盐正式纳入饮用水安全标准（http ：//water.
epa.gov/drink/contaminants/unregulated/perchlorate.
cfm）并将于随后的 24 个月内公布最大污染界限值
（MCL）［4］。
高氯酸盐的分子结构决定了其化学性质较稳
定，通常情况下很难去除［5-7］。目前常用的去除高
氯酸盐的方法有离子交换法（IX）和生物降解法。
生物降解作用的本质是由参与高氯酸盐降解细菌
（perchlorate reducing bacteria，PRB）的活性决定的。
添加无机电子供体实现自养条件下高氯酸盐降解的
研究及应用相对较多的是 H2，其理论依据是许多自
养型细菌可以利用氢作为电子供体满足自身生长需
求。自然界中的高氯酸盐去除往往并非单一菌种的
作用，而是多种细菌共同作用，而自养型细菌的种
群密度正是决定氢还原体系下高氯酸盐降解速率的
关键［8-10］。参与高氯酸盐降解的细菌可分为 4 类 ：
高氯酸盐降解细菌，如 Dechloromonas 和 Dechloroso-
ma（Azospira）；氯酸盐降解细菌（chlorate reducing
bacteria，CRB），如 Ideonella dechloratans ；高浓度氯
酸盐耐受条件下的高氯酸盐降解细菌（high chlorate
accumulating perchlorate reducing bacteria，HCAP），
如 Dechloromonas PC1 ；一些脱氮细菌（Denitrifying
bacteria），如 Pseudomonas［11］、Rhodobacter sphaeroid-
es［12］等。最常见的参与高氯酸盐降解作用的细菌是
Azospira［13］和 Dechloromonas［14］。以往的研究往往针
对单一菌种或在特定的培养条件下进行，少有对复
杂介质中生物降解高氯酸盐菌种及功能的分析。
本研究选用常见的厌氧生物反应器作为高氯
酸盐降解的培养基质，添加氢气作为电子供体支持
ClO4
-的完全降解，采用高通量测序的方法对该体系
内菌种的结构和功能进行分析。该方法可以更详尽
地把握环境中的微生物群落结构及其功能，进一步
反映电子供体的存在对反应基质的选择性影响，阐
释混合体系中高氯酸盐生物降解作用的本质，旨在
为原位或异位高氯酸盐生物修复技术的强化提供理
论支持和现实依据。
1 材料与方法
1.1 高氯酸盐降解试验体系的设置
用于高氯酸盐降解的厌氧生物反应器培养条件
为 pH 值 6.92-7.35，温度 30℃，测定溶解氧（DO）
质量浓度为 0.46 mg/L［15］。生物培养采用的基础营
养液成分参考王蕊等［16］研究内容。
高氯酸盐降解试验体系的设置如下所示 ：
5 mL৏࿻⍫ᙗ⊑⌕+ส⹰㩕ޫ⏢+䍘䟿⎃ᓖ10 mg/L ClO4-䘋㹼ࡍԓ䱽䀓ˈሶ10 mg/L ClO4-→0 mg/L ClO4-Ⲵ䗷〻䇑ѪањᆼᮤⲴ䱽䀓ઘᵏ
ClO4
-䍘䟿⎃ᓖѪ0 mg/Lᰦˈሶ5 mL㓿ݵ࠶␧ਸⲴ⊑⌕Րԓˈ㺕
ݵClO4-㠣10 mg/Lˈ޽⅑䘋㹼ᆼᮤ䱽䀓ઘᵏ䗷〻
ㅜҼ⅑ՐԓਾᵏˈClO4-н޽㔗㔝䱽䀓ᴰ㓸࢙։䍘䟿⎃ᓖ2 mg/L±1 mg/L
㺕ݵ䏣䟿H21.5psi֌Ѫ⭥ᆀ׋փ㠚ޫ䱽䀓փ㌫hydrogen degradationˈHD
䘋㹼10 mg/L ClO4-→0 mg/L ClO4-Ⲵ䱽䀓䗷〻
ClO4
- 10 mg/L→0 mg/LⲴ䱽䀓䗷〻ѝон਼ᰦ䰤⛩ཊ⅑ਆṧ࠶᷀⍻䈅ClO4-Ⲵ䍘䟿⎃ᓖ
ClO4
-Ⲵ䍘䟿⎃ᓖѪ0 mg/Lᰦˈᨀਆṧ૱ᙫDNA
䙊䗷儈䙊䟿⍻ᒿⲴᯩ⌅ᇎ⧠HDփ㌫㌫㔏ਁ㛢ṁⲴᶴᔪ
以上各反应体系的条件为 ：DO<2.0 mg/L，pH ：
7.0-8.0，温度 ：30℃。
1.2 微生物数据分析方法
1.2.1 样品总 DNA 的提取 使用细菌基因组提取试
剂盒（天根，TIANGEN，北京）对 HD 体系降解完
毕的样品进行总 DNA 提取，产物保存于 -20℃冰箱
以备后续生物群落分析研究。
1.2.2 高通量测序分析 通过高通量测序（High-
Throughput Sequencing）的方法获得生物群落的信息。
通过 Stratagene Mx3000P Real-time PCR Cycler（Agil-
ent，Santa Clara，CA，USA）分析仪进行定量分析
［Qubit Fluorometer（Invitrogen，Life Technologies，
Grand Island，NY，USA）作为染料］。使用 Illumina
HiSeq 2000 高通量测试仪上机测序（Sequencing），
所得的碱基对末端序列（PE）需进行筛选，排列
（6-40 bp）和拼接（Data Analysis）。整理所得序列与
BLASTX（Basic Local Alignment Search Tool）进行比
对和注释，并与 NCBI（National Center for Biotechn-
ology Information，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的 NR
2014年第4期 171谢宇轩等 ：自养条件下高氯酸盐降解细菌群落研究
（non-redundant）数据库进行比对，最后通过 MEG-
ANv4.0 软件构建 HD 体系系统发育树。
2 结果
2.1 HD体系ClO4
-降解与菌种多样性分析
研究中 HD 体系 ClO4
-初始质量浓度为 10 mg/L。
反应开始较长一段时间（约 15 d）内，排除仪器测
试误差等因素外，ClO4
-的质量浓度基本无变化。反
应进行至 20 d 后，经历了降解延滞期的 ClO4
-质量
浓度缓慢下降，至 ClO4
-质量浓度达到 2 mg/L 左右
时，如图 1 所示，60 d 后 ClO4
-的降解出现加速的过
程，并于 70 d 时降至检出限以下。ClO4
-降解完全后，
对体系内生物群落构成进行系统发育树的构建分析，
高通量测序所得数据大小为 1.13 GB。MEGAN（ver-
sion 4.70.4） 软 件 比 对 结 果 表 明，HD 体 系 中 总 细
菌相对丰度为 84.96%，HD 体系系统发育树如图 2
所示。
变形杆菌门细菌在总细菌群落中所占比例最大，
达到 80.16%。属于变形杆菌门的细菌结构比例如图
3 所示。
该体系内主要以 β-变形杆菌纲的细菌为主。
2.2 HD体系基因功能性分析
HD 体系降解完毕后，通过高通量测序和 KEGG
注释的功能分析可知，HD 体系中参与物质代谢过程
的基因总相对丰度为 17.67%。维持生物体正常生命
活动和能量代谢常见的几种重要功能基因的相对丰
度较大，如参与氨基酸类物质代谢的基因相对丰度
最大为 5.46%，其次为参与生物体内糖代谢的基因，
其相对丰度为 4.75%，参与能量代谢的基因相对丰
度为 3.35%。对于环境中能够降解某些特定污染物
的功能基因分析结果表明，可参与氮循环的基因相
对丰度为 0.72%，参与氯循环的基因丰度为 0.83%。
部分基因 KEGG 功能分析结果如图 4 所示。
3 讨论
研究所选用的降解基质本身经传代过程验证，
具有降解 ClO4
-的潜在能力，说明该厌氧反应器自身
的细菌群落组成中即有高氯酸盐降解细菌的存在。
添加氢气作为电子供体支持高氯酸盐降解的生
物修复过程较缓慢，整个反应周期共需要约 71 d。
王蕊等［16］研究表明，降解初始质量浓度为 9 mg/L
的 ClO4
-，ClO4
-初 期 的 降 解 速 率 低， 当 ClO4
-降 至
2 mg/L 时，降解过程可提速 2 倍，延滞期的时长占
整个降解周期的约 1/4，此现象与 Nozawa-Inoue 等［21］
利用氢气作为电子供体降解高氯酸盐反应初期延滞
期较长（41 d）的特点一致。造成 HD 体系延滞期
较长的原因 ：（1）由于 H2 本身在水中的溶解度很低
（0.08 mg/L at 5% H2）。根据亨利定律，在等温等压
的条件下，某种气体在溶液中的溶解度与液面上该
气体的平衡压力成正比。本研究中当通入气体流量
一致时，H2 在溶液中的溶解度应与液面上该气体的
平衡压力成正比。因此，通入 H2 的时间越长，则
H2 的溶解度应当越高，故反应初期 H2 在反应溶液
中的低溶解度会影响自养型降解细菌的适应和发
育 ；（2）由于 HD 体系的培养基质是由原始厌氧生
物反应器传代而来，整个反应体系内的细菌相当于
经历了一次异养降解过程，导致系统初始细菌种群
密度有所变化，故将此体系转为由 H2 提供电子供
体的自养降解环境时，细菌的适应期会更长，从而
对后续的试验研究造成影响 ；（3）当 H2 存在时，反
0
0
4
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C
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4-
c
on
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12
15 30 45 60
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图 1 HD 体系高氯酸盐降解图
属于 α-变形杆菌纲的细菌占体系内总细菌数
的比例为 18.62%，β-变形杆菌纲的细菌相对丰度
为 34.17%，占总细菌数的比例为 40.22%，而 γ-变
形杆菌纲的细菌占总细菌数的比例为 11.12%。除
δ-proteobacteria 变 形 杆 菌 纲 所 占 比 例 极 少 外，HD
体系中的 α-变形杆菌纲、β-变形杆菌纲和 γ-变形
杆菌纲的细菌分布相对较均匀。其中代表性的高
氯 酸 盐（ 氯 酸 盐 ） 降 解 细 菌， 如 Dechloromonas，
Azospira 和一部分可以参与 ClO4
-降解的反硝化细菌
如 Pseudomonas［17-20］等均有检出，且相对丰度较大。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期172
Spirochaetia 19
Gammaproteobacteria 9450
Epsilonproteobacteria 28
Deltaproteobacteria 168
Betaproteobacteria 34171
Alphaproteobacteria 15819
Planctomycetia 23
Nitrospira 9
Gemmatimonadetes 278
Negativicutes 7
Clostridia 46
Bacilli 47
unclassified Acidobacteria 15
Solibacteres 25
Acidobacteriia 18
environmental samples 187
Deinococci 14
Oscillatoriales 8
Nostocales 16
Gloeobacteria 5
Chroococcales 44
Chloroflexi 10
Caldilineae 8
Verrucomicrobiae 7
Opitutae 29
Ignavibacteria 23
Chlorobia 24
Sphingobacteriia 4631
Flavobacteriia 3161
Cytophagia 519
Bacteroidia 167
Bacteroidetes Order II. Incertae sedis 7
Actinobacteria 112
Bacteroidetes 11601
Bacteroidetes/Chlorobi group 11761
Verrucomicrobia 40
Chloroflexi 32
Cyanobacteria 106
Bacteria 84961
Acidobacteria 80
Firmicutes 133
Proteobacteria 68105
delta/epslon subdivisions 197
Ounclassified Bacteria 16
图 2 HD 体系基于 reads 序列的系统发育树
0.28%
15.85%
57.33%
26.54%
α-变形杆菌纲
β-变形杆菌纲
γ-变形杆菌纲
σ-变形杆菌纲
图 3 HD 降解体系中变形杆菌门细菌分布比例图
应体系内同时发生电子供体的竞争作用。NO3
-、O2、
ClO4
-三者间电子利用的优先级顺序为 ：O2>NO3
->
ClO4
-［22，23］。综合以上 3 点，HD 体系中 ClO4
-降解
初期反应速率很低。随着反应的进行，经历延滞期
的细菌开始加速高氯酸盐的降解。也有相关研究表
明， 用 Dechloromonas sp. PC1 细 菌 降 解 高 氯 酸 盐，
反应后期高氯酸盐降解速率增加，有一部分原因是
当体系内的 ClO4
-质量浓度变低时，高氯酸盐降解细
菌在整个生物群落中所占的比例增加，并逐渐成为
体系内的优势种群［18，24］。该降解过程最终降解周期
为 65 d。2000 年 Miller 等［8］利用污水处理厂的污泥
作为菌源和反应基质，同样通过通入 H2 作为电子供
体，进行高氯酸盐的降解柱试验研究。145 d 的时间
内，高氯酸盐降解率达 45%。当利用 H2 作为电子供
体进行高氯酸盐的降解研究时，其反应时间往往较
2014年第4期 173谢宇轩等 ：自养条件下高氯酸盐降解细菌群落研究
长，是由于自养细菌本身对能量的利用方式在与异
养型细菌共存竞争时往往处于劣势。
HD 体系中总细菌相对丰度为 84.96%，导致该
体系内菌种丰度较大的两个因素 ：一是由于添加氢
气促进了反应体系内所有可利用氢气作为电子供体
的细菌生长，另一方面则是由于该反应的降解周期
较长且用于生物多样性分析的样品取自 ClO4
-刚刚降
解完毕，培养时长会导致该体系内菌种数量明显增
加。大部分的高氯酸盐降解细菌（PRB）分布于 β-
变形杆菌纲，而氯酸盐降解细菌（CRB）则主要分
布 于 γ-变 形 杆 菌 纲［12］。HD 体 系 中 Dechloromonas
的相对丰度为 2.7%，证明了作为高氯酸盐降解最
具代表性的细菌，Dechloromonas 广泛存在于自养
条件下的高氯酸盐降解体系中［7，17，18，25，26］。另一
种常见的高氯酸盐降解细菌 Azospira 的相对丰度也
有 3.1%。有文献［27-29］表明，许多已经分离得到的
高氯酸盐降解菌都同时具有脱氮作用。本研究 HD
体系中也有较多既参与高氯酸盐还原又可以参与反
Carbohydrate Metabolism 4680
Energy Metabolism 3307
Lipid Metabolism 2086
Nucleotide Metabolism 1967
Amino Acid Metabolism 5383
Metabolism of Other Amino Acids 1632
Glycan Biosynthesis and Metabolism 858
Metabolism of Cofactors and Vitamins 2698
Biosynthesis of Polyketides and Terpenoids 1139
Biosynthesis of Other Secondary Metabolites 536
Xenobiotics Biodegradation and Metabolism 2271
Metabolism 17441
Caprolactam degradation 273
Biphenyl degradation 12
Toluene and xylene degradation 114
gamma-Hexachlorocyclohexane degradation 226
3-Chloroacrylic acid degradation 140
1,1,1-Trichloro-2,2-bis4-chlorophenylethane degradation 10
2,4-Dichlorobenzoate degradation 112
1,2-Dichlorobenzoate degradation 120
1,4-Dichlorobenzoate degradation 129
Tetrachloroethene degradation 79
Styrene degradation 128
Naphthalene and anthracene degradation 154
Ethylbenzene degradation 69
Fluorene degradation 53
Carbazole degradation 42
Benzoate degradation via CoA ligation 643
Benzoate degradation via hydroxylation 328
Atrazine degradation 47
Bisphenol A degradation 102
1-and 2-Methylnaphthalene degradation 281
Trinitr otoluene degradation 103
Geraniol degradation 436
Fluorobenzoate degradation 114
Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450 174
Drug metabolism-cytochrome P450 189
Drug metabolism-other enzymes 141
Xenobiotics Biodegradation Metabolism 2271
图 4 KEGG 注释功能分析图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期174
硝化过程的细菌，如 Pseudomonas［11］、Rhodobacter
sphaeroides［12］和 Acinetobacter［29］的检出，其相对丰
度分别 0.01%、4.4% 和 3.5%，证明 HD 体系由于电
子供体氢气的加入，不仅促进了反应体系内某些代
表性的高氯酸盐降解细菌的生长，同时也促进了其
他一些可以参与高氯酸盐（或氯酸盐）还原过程的
细菌发育。对 HD 体系内检出基因的功能分析结果
证明参与氮循环的基因丰度和参与降解氯代物的基
因相对丰度比例较为相似，推测这些参与氮类物质
和氯循环的细菌共同作用实现了 HD 体系中 ClO4
-的
还原降解。虽然通过 KEGG 注释分析功能基因具有
一定的局限性，但亦能说明复杂条件下高氯酸盐污
染的降解是多种细菌共同作用的结果。并且由于添
加了氢气使得厌氧生物反应器本身的菌种结构发生
改变，成为适合高氯酸盐降解的体系。
4 结论
高氯酸盐污染在添加了电子供体氢气后可以实
现完全降解。10 mg/L ClO4
-降至检出限以下共经历
71 d，降解速率较慢。ClO4
-降解完全后，HD 体系
中总细菌相对丰度为 84.96%，大多高氯酸盐降解细
菌分布的变形杆菌门细菌占总细菌的比例较大，达
到 80.16%。如 Azospira 和 Dechloromonas 等代表性的
高氯酸盐降解细菌相对丰度也有一定的检出。此外，
可同时参与高氯酸盐降解和反硝化作用的细菌如
Pseudomonas 相对丰度为 4.4%。功能分析表明高氯
酸盐的降解是多种细菌共同作用的结果。额外添加
电子供体使 HD 体系内的细菌种群结构简单化，参
与某种特定污染物降解的细菌所占比例增加，从而
使混合降解基质本身的功能趋于专一。
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（责任编辑 马鑫）