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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第4期
收稿日期 : 2011-08-31
基金项目 : 国家“863”计划项目（2006AA100109）, 国家林业局公益性行业科研专项（200904050）
作者简介 : 牛雅静 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 植物抗逆性育种 ; E-mail: niuyajing05@126.com
通讯作者 : 戴思兰 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 观赏植物遗传育种 ; E-mail: silandai@gmail.com
甘菊 CMO同源基因的分离与表达分析
牛雅静 王淑慧 黄河 戴思兰
（北京林业大学园林学院，北京 100083）
摘 要： 利用半嵌套巢式 PCR结合 RACE技术从菊科植物甘菊［Chrysanthemum lavandulifolium （Fisch. ex Trautv.） Makino］
中分离得到了一个长度为 1 450 bp的片段。序列分析结果表明，其开放阅读框全长 1 140 bp，编码 379个氨基酸残基；在 GenBank
比对并进行系统进化分析可知，该片段为 CMO同源基因，命名为 ClCMO。利用不同胁迫处理进行分析发现，在非胁迫条件下
ClCMO基因在甘菊茎、叶、花叶中均有表达信号，在根中没有表达；其可以响应干旱、高盐胁迫和脱落酸（ABA）的诱导，不响
应冷热胁迫，并且其表达在水杨酸（SA）诱导下受抑制。这些结果表明，ClCMO基因是提高植物耐干旱、高盐能力的有效基因资源。
关键词： 胆碱单加氧酶（CMO） 甘氨酸甜菜碱（GB） 非生物胁迫 表达 甘菊
Cloning and Expression Analysis of CMO Homologue Gene from
Chrysanthemum lavandulifolium
Niu Yajing Wang Shuhui Huang He Dai Silan
（College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, Beijing 100083）
Abstract: Integrating heminested PCR with RACE （rapid-amplification of cDNA ends）, a 1 140 bp segment was isolated from
Chrysanthemum lavadulifolium. The sequence analysis showed that the gene consisted of an 1 140 bp ORF （open reading frame） which coded
a protein with 379 amino acid residues. Based on Blast on GenBank and phylogenetic tree, the segment was found to be CMO homologue gene,
and named as ClCMO. Under normal conditions, ClCMO expresses constitutively in leaves, stems, flowers, but not in root. After stress treatments,
ClCMO can respond to drought, salt and ABA （abscisic acid） induction, and do not response to low or high temperature, in addition, it was
inhibited by SA （salicylic acid）. The results indicate that ClCMO can be regarded as one of an effective gene resource to improve the ability to
resist drought and salinity.
Key words: Choline monooxygenase （CMO） Glycine betaine（GB） Abiotic stress Expression Chrysanthemum lavandifolium
渗透胁迫（osmotic stress）是植物生长发育过
程中所面临的最主要胁迫之一，脯氨酸、山梨醇、
海藻糖和甜菜碱等渗透调节物质在植物抵御渗透
胁迫中起到了重要的作用。甘氨酸甜菜碱（glycine
betaine，GB）是甜菜碱的一种，是植物中广泛存在
的一类渗透调节物质，它主要通过两步酶促反应合
成：首先是由胆碱（choline）在胆碱单加氧酶（choline
monooxygenase，CMO）的催化下生成甜菜碱醛（betaine
aldehyde）［1］，随后甜菜碱醛在甜菜碱醛脱氢酶
（betaine aldehyde dehydragensase，BADH）的催化下
合成甘氨酸甜菜碱［2］。CMO 是一种依赖铁氧还蛋白
（ferredoxin，FD）的酶，它的活性强烈依赖光，并
定位于叶绿体基质中［3］。由于其催化产物甜菜碱醛
对生物体有伤害，因而 CMO 基因还被认为具有限速、
平衡甜菜碱通路的功能［4］。目前 GenBank 上公布的
植物 CMO 蛋白多属于藜科、苋科和禾本科植物，百
合科、杨柳科、十字花科、茄科以及葡萄科中也有
分布。试验证实，使用菠菜或山菠菜 CMO 基因转化
拟南芥、烟草、水稻和棉花等，可以增强转基因植
株的植株耐盐、耐旱能力［1, 3, 5-7］。
甘菊［Chrysanthemum lavandulifolium （Fisch. ex
Trautv.） Makino］是菊科菊属的二倍体植物，为栽培
2012年第4期 59牛雅静等 ：甘菊 CMO 同源基因的分离与表达分析
菊花近缘种［8］。其分布广泛，抗逆性强，是近年来
新引入园林的一种优良的盐碱地绿化的地被植物。
课题组前期研究结果表明，甘菊为典型的盐生植物，
使用 300 mmol/L NaCl 胁迫处理 7 d，其内源甜菜碱
积累量可达 151.39 μmol/g （DW） ，是正常条件下的
16.67 倍［9］。前人已经克隆到了甘菊甜菜碱合成
通 路 中 的 DlBADH 基 因 的 cDNA 全 长（ 登 录 号
DQ011151）［10］，但在菊科中尚无 CMO 基因的克隆
及功能研究方 面的报道。本研究旨在获得甘菊甜菜
碱通路第一步的关键基因 CMO，并对其表达进行初
步分析，以期进一步解析菊科植物甜菜碱合成通路
的分子机理，并为提高植物抗逆性提供基因资源。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用植物材料甘菊的种子采摘于北京林业大
学校园，灭菌后在 1/2MS 培养基上播种，待种子萌
发后移栽到草炭 / 蛭石为 1 1 的基质中进行培养。
待植株生长至 8-10 片真叶时，进行各种胁迫处理 ：
将植株从土中取出，小心洗去基质，用吸水纸迅
速吸干，进行自然干旱胁迫处理 ；使用 300 mmol/L
的 NaCl 溶液浇灌植株，进行盐胁迫处理 ；将小苗
分别放置在 4℃和 40℃培养箱中，进行冷胁迫和热
胁迫处理 ；使用 3 mmol/L 水杨酸（SA）溶液和 200
μmol/L 脱落酸溶液（ABA）喷施幼苗叶片，进行 SA
和 ABA 诱导。以上各项在处理每 6 h 重新喷施一次，
处理后 24 h 取植株第 3-7 枚叶片，并迅速使用液氮
速冻，-80℃保存。各器官样本为甘菊植株中部叶片、
茎段、根系以及开放的花序。取材后迅速使用液氮
速冻，-80℃保存。
1.2 方法
1.2.1 总 RNA 提取和反转录 总 RNA 的提取采用
改良 TRIzol 法［11］，合格样品（OD260/OD280 ≥ 1.8）
按照 Promega 公司的 M-MLV 反转录酶说明书进行
cDNA 第一链合成。
1.2.2 ClCMO 基因全长的获得 利用 GenBank 上已
经发表的序列（菠菜，登录号 AAB52509.1；三色苋，
登录号 AAK82768.1 ；甜菜，登录号 AAB80954.1 ；
山菠菜，登录号 AAF76895.1），设计简并引物，使
用半嵌套 RT-PR 进行保守域扩增。首先使用引物
CP1 与 CP3 进行第一次 PCR 扩增，扩增产物稀释 50
倍作为模板，分别以引物组合 CP2 与 CP3、CP1 与
CP4 进行巢式 PCR 扩增。扩增产物进行 1% 琼脂糖
凝胶电泳检测，测序。
根据获得的同源片段碱基序列设计特异性引物，
扩增其 5端和 3端。3端扩增参照刘振林等［10］方
法进行，5端扩增参照英俊公司 5RACE 试剂盒说
明书进行。试验引物序列见表 1，扩增产物连接到
pACK-Ts 载体上，转化感受态大肠杆菌 TOP10，蓝
白斑筛选后选取阳性克隆送至上海生工公司测序。
1.2.3 生物信息学分析 使用DNAMAN进行ClCMO
基因的全序列拼装。全长序列提交至 NCBI 比对，
下载所有已知 CMO 基因全长的高等植物和部分菌类
的序列，采用 MEGA5.0 程序进行各基因多序列比对，
并将比对结果使用 Neighbor-Joining 法生成系统进
化树。
1.2.4 ClCMO 基因在逆境、激素处理及甘菊各器官
中的表达分析 以本课题组已获得的甘菊 а-tubulin
（ClTUA）为内参基因，进行 ClCMO 基因在各种胁
迫处理下及器官组织特异性的 RT-PCR 表达分析，3
次重复试验。
ClCMO 基因表达使用 2 μL cDNA 模板，PCR 程
序为 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性 50 s，56℃退火
30 s，72℃延伸 45 s，35 循环 ；72℃延伸 10 min ；
10℃停止 ；表达分析所用引物序列见表 1。
2 结果
2.1 ClCMO基因cDNA全长扩增
利用半嵌套巢式 PCR，使用引物 CP2 与 CP3 组
合扩增出 500 bp 左右片段，CP1 与 CP4 扩增出 350
bp左右片段（图1-A）。将扩增出来的片段测序、拼接，
并对测序峰形图进行校正后，得到长度为 603 bp 的
核苷酸序列。将该序列与 GenBank 上的同源序列进
行比对，证明其为植物 CMO 同源基因片段。
在此基础上，对其 3-末端和 5-末端进行扩增
（图 1-B，图 1-C）。测序得到 486 bp 的 3-末端和
384 bp 的 5-末端。使用 DNAMAN 进行序列组装，
最终得到 1 450 bp 的 cDNA 全长序列，编码区为
1 140 bp，编码 379 个氨基酸残基，并含有 195 bp
的 3UTR 和 115 bp 的 5UTR 区域，命名为 ClCMO。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期60
表 1 引物信息
引物名称 引物序列（5-3） 用途
CP1 GCHTTYCAYAAYGTDTG 半嵌套巢式PCR上游引物
CP2 TGCCYTTAYATGGMTGG
CP3 CATCCAWKDCCATACCT 半嵌套巢式PCR下游引物
CP4 RTCRCWRAANAYCTTCC
CMO-3-1 AGGCAACCAGGATAACAGGG 3RACE特异性引物
CMO-3-cs CAATTATTTGGATGGCGGGTAT 3RACE巢式引物
AP GGCCACGCGTCGACTAGTAC（T）16 3RACE中的cDNA反转录
AUAP GGCCACGCGTCGACTAGTA 3RACE的锚定引物
CMO-5-1 ATACGAGTCAAGCTTGAGAC 供5RACE反转录的引物
CMO-5-2 TCATCATCATCATGTTGCTGAAC 5RACE的特异性引物
CMO-5-3 CCTGTTATCCTGGTTGCCTTCAG 3RACE的巢式引物
AAP GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG 5RACE的锚定引物
CMOs AAAGATGGCAGGCTGTTGG ClCMO基因的表达分析
CMOx TGGCCCGTACCTATTGACC
TUAs TTTCGTCATACGCTCCTGTA 表达分析中的内参基因
TUAx TGGATGGTTCTCTTGGTCTT
A. 半嵌套巢式 PCR 扩增结果，1, 3. 引物组合 CP1 与 CP4 结果 , 2. 引物组合 CP2 与 CP3 结果 ；
B. 3RACE 结果 ；C. 5RACE 结果 ; M. Marker DL2000
图 1 ClCMO扩增结果
2.2 ClCMO蛋白的系统进化关系分析
利用检索到的 21 个高等植物 CMO 全长氨基酸
序列、5 个菌类序列以及 ClCMO 基因推测氨基酸序
列构建系统进化树（图 2）。从图 2 中可以看出，整
个进化树明显的分为 3 个主枝。5 个菌类的 CMO 蛋
白聚为一枝，与另外两枝亲缘关系较远 ；藜科和苋
科植物聚为一枝，其中滨藜属、碱蓬属等同属植物
间亲缘关系最近 ；禾本科植物及其他植物聚在另一
分枝。我们分离得到的甘菊 CMO 蛋白在上述的第 3
个分枝，它和茄科枸杞属的宁夏枸杞亲缘关系最近，
随后与毛果杨、葡萄、蓖麻的 CMO 蛋白聚为一小分
枝。这一结果说明，菊科与藜科、苋科的 CMO 蛋白
存在一定差异，与单子叶植物 CMO 蛋白也有差别。
2.3 ClCMO在甘菊不同器官中的表达
在非胁迫条件下提取甘菊叶片、茎段、花和根
系中的 RNA，利用 RT-PCR 技术分析（图 3）发现，
ClCMO 基因叶片和花中的表达量较高，在茎段中表
达量较低，该基因在根系中没有表达信号。这一结
果暗示该基因可能与植物花发育有一定关系，同时
也可能与叶绿体有密切关系。
2.4 ClCMO基因在胁迫和激素处理下的表达分析
在各种胁迫条件下处理 24 h 后，提取甘菊叶片
2012年第4期 61牛雅静等 ：甘菊 CMO 同源基因的分离与表达分析
总 RNA，利用 RT-PCR 技术分析发现，与正常状态
下生长的植株（对照）相比，ClCMO 基因在 ABA 诱
导的条件下表达量增高，而在 SA 诱导条件下表达量
降低 ；在干旱和盐胁迫的条件下，ClCMO 基因表达
量升高 ；而在冷热胁迫条件下表达量基本保持不变
（图 4）。 由此可推测，ClCMO 基因响应 ABA 诱导和
盐、干旱胁迫，不响应冷热胁迫，且受到 SA 的抑制。
3 讨论
胆碱单加氧酶（CMO）是植物甜菜碱合成通路
的关键酶之一，它的缺失或被不正常剪切会导致植
物甜菜碱通路的中断［12］，直接影响植物体内甜菜碱
的积累及其对渗透胁迫的抵御。
前人研究发现，三色苋 CMO 基因响应干旱和
盐诱导，并且叶片中的表达量显著高于根系中［13］；
菠菜叶片中的 CMO 表达量在盐胁迫下被高丰度诱导
表达［14］；在高浓度盐胁迫下，甜菜叶片中的 CMO
含量是正常条件下的 8 倍以上［6］；青稞在盐胁迫下，
叶片和根系中 HvCMO1 基因表达量大幅增加［15］。这
些均与本研究结果一致。田跃胜等［16］在枸杞中发现，
LbCMO 基因响应高盐和低温胁迫，并且随胁迫时间
的延长积累量逐渐增加，与本研究中 ClCMO 不响应
温度诱导不同。尽管在一些植物中过表达 CMO 基因
会增强该植物对低温胁迫的抵抗能力［17］，但除枸杞
外并无其他关于 CMO 基因响应温度胁迫的报道。
在对甜菜碱合成的研究中发现，正常条件下
CMO 在老叶中积累量高于嫩叶中，盐胁迫下老叶中
CMO 的生成量增长远高于嫩叶中，但嫩叶中甜菜碱
图 2 CMO推定氨基酸序列的系统进化关系
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第4期62
的积累量更高 ；甜菜碱在老叶中生成并运输至嫩叶
中发挥作用［18］。甘菊 CMO 含量、ClCMO 表达量［19］
与甜菜碱含量之间是否有相似的关系，可深入探讨。
4 结论
本研究从耐盐、耐干旱能力较强的菊科植物甘
菊中分离得到了 CMO 同源基因，命名为 ClCMO ；
其开放阅读框全长 1 140 bp，编码 379 个氨基酸残
基。该基因在甘菊叶片、茎段和花中低丰度组成型
表达，在根系中没有表达。此外，ClCMO 基因响应
高盐、干旱胁迫，不响应高温、低温胁迫 ；该基因
受到 ABA 诱导表达、SA 抑制其表达。
参 考 文 献
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（责任编辑 狄艳红）
图 4 ClCMO基因在不同处理条件下的表达