全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
油菜为十字花科芸薹属越年生或一年生植物，
是世界四大油料作物之一，也是我国重要的油料作
物之一，它在人类的生活和农业生产上有着极其重
要的作用。油菜的茎可以食用，油菜种子不仅可用
来榨取食用油，还可用作饲料。同时油菜花具有一
定的观赏价值，可以用作旅游资源。另外，能源危
收稿日期 ：2012-07-26
基金项目 ：国家自然科学基金（31171588），重庆市自然科学基金（cstc2010BB5324，cstc2012jjA80010），重庆市教委科技项目（KJ100604）
作者简介 ：杨长友，男，硕士研究生，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：15823507359@126.com
通讯作者 ：张涛，男，教授，研究方向 ：植物遗传与细胞生物学 ；E-mail ：zht2188@126.com
甘蓝型油菜高效离体再生体系的建立
杨长友  袁中厚  郑小敏  张涛
（重庆师范大学生命科学学院，重庆 401331）
摘 要 ： 以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）HC8 为材料，从无菌苗苗龄、预培养基激素浓度、预培养天数、6-BA 及 NAA 的
浓度等方面对影响油菜组织培养的因素进行了分析研究，建立了甘蓝型油菜品系 HC8 的离体再生技术体系。结果表明，该油菜组
织培养的最佳苗龄为 5 d ；最佳预培养时间为 5 d，最佳 2，4-D 浓度为 1.0 mg/L ；子叶最佳诱导培养基为 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L
NAA+3.5 mg/L AgNO3 或 MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3，该条件下子叶愈伤组织诱导率最高可达 100%，再生频
率及分化频率分别可达 88.0% 和 108.33% ；下胚轴最佳诱导培养基为 MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3，子叶愈伤
组织诱导率最高可达 95.24%，再生频率及分化频率分别可达 81.82% 和 104.55% ；最佳生根培养基为 MS+0.5 mg/L NAA，生根率最
高为 90.0%。
关键词 ： 甘蓝型油菜 愈伤组织诱导 离体再生 芽分化
Establishment of Effective Regeneration System of
Brassica napus L. in vitro
Yang Changyou Yuan Zhonghou Zheng Xiaomin Zhang Tao
（College of Life Science，Chongqing Normal University，Chongqing 401331）
Abstract:  We examined the effect of the seedling age of sterile seedling, the days and concentrations of growth regulators in pre-
cultivation, the concentrations of 6-BA and NAA on rape tissue culture with HC8（Brassica napus L.）. We established the technical system
of regeneration of HC8 in vitro with high frequency. The results showed that the best seedling age and the optimal day of pre-cultivation was
five days for rape tissue culture with HC8, and the optimal concentration of 2, 4-D was 1.0 mg/L. The best medium for callus induction and
differentiation of cotyledons were MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3 or MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3.
With the medium, the ratios of the highest level of callus induction, regeneration and differentiation were 100%, 88% and 108.33%, respectively.
The best medium for callus induction and differentiation of hypocotyls were MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3. With the
medium, the ratios of the highest level of callus induction, regeneration and differentiation were 95.24%, 81.82% and 104.55%, respectively.
The best medium for rooting of regenerated plant was MS basal medium supplemented with 0.5 mg/L NAA with the ratio of the highest level of
rooting（90%）.
Key words:  Brassica napus L. Callus induction Regeneration in vitro Shoots differentiation
机是当前全球面临的重大难题之一，由于低芥酸菜
籽油中的脂肪酸碳链组成为 16-18 个碳，与柴油分
子碳数相近，且油菜种植范围广，属于可再生资源，
油菜被认为是生物柴油最理想的原料［1］。目前，转
基因技术在油菜育种中已获得了广泛的应用，并得
到了大量具有不同优良特性的油菜种质［2-6］。高效
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期112
的植株再生体系是植物转基因研究能否有效进行的
前提条件。经过多年研究，国内外许多机构已建立
了成熟的油菜离体再生体系［7-10］。然而，研究表明，
油菜不同基因型、不同外植体之间的最佳离体再生
条件存在差异［11-14］，这在一定程度上阻碍了油菜转
基因研究的发展。本研究以甘蓝型油菜 HC8 为材料，
从苗龄、预培养基激素浓度、预培养天数、6-BA 及
NAA 的浓度等方面探究该油菜品种的最佳离体再生
条件，建立并优化甘蓝型油菜 HC8 的高频率离体再
生体系，进一步丰富油菜离体高效再生体系的相关
试验数据，为油菜组织培养提供基础参考数据，并
为进一步通过植物转基因技术获得预期优良性状的
油菜新种质奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品系 HC8 由重
庆师范大学生命科学学院细胞与遗传学实验室提供。
1.2 方法
1.2.1 培育方法
1.2.1.1 油菜无菌苗培育 挑选饱满、大小均匀和
无病虫害的油菜种子，用无菌蒸馏水清洗种子，用
75% 乙醇消毒 30 s，用无菌蒸馏水冲洗 3-5 次，再
用 0.1% 升汞（HgCl2）消毒 8 min，之后再用无菌蒸
馏水冲洗 3-5 次，并将种子浸泡于无菌蒸馏水中 30
min 以上。消毒之后将其接种于 1/2 MS 培养基上，
于 25-28℃、12 h 光照 /12 h 黑暗条件下培养。
1.2.1.2 无菌苗苗龄对油菜外植体分化的影响 分
别取培育不同天数（4、5、6 和 7 d）的油菜无菌苗，
将子叶切成 0.5 cm2 左右的小块、下胚轴切成 0.5 cm
左右的小段，接种于 MS+1.0 mg/L 2，4-D 的预培养基
上预培育 5 d 后，将生长良好的子叶外植体转接入
MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3 的
分化培养基中、将生长良好的下胚轴外植体转接入
MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3 的
分化培养基中，30 d 后统计再生频率和分化频率。
1.2.1.3 预培养时间对油菜外植体分化的影响 取
培育 5 d 的油菜无菌苗，将子叶切成 0.5 cm2 左右
的小块、下胚轴切成 0.5 cm 左右的小段，接种于
MS+1.0 mg/L 2，4-D 的预培养基上，分别预培育 3、
4、5 和 6 d 后，取相应预培育天数生长良好的子叶
外植体转接入 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5
mg/L AgNO3 的分化培养基中、生长良好的下胚轴外
植 体 转 接 入 MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5
mg/L AgNO3 的分化培养基中，30 d 后统计再生频率
和分化频率。
1.2.1.4 预培养基中不同浓度 2，4-D 对油菜外植体
愈伤组织诱导及分化的影响 取培育 5 d 的油菜无
菌苗，将子叶切成 0.5 cm2 左右的小块、下胚轴切
成 0.5 cm 左右的小段，接种于含有不同浓度 2，4-D
的 MS 培养基上，预培育 5 d 后，将生长良好的子叶
外植体转接入 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5
mg/L AgNO3 的分化培养基中、生长良好的下胚轴外
植 体 转 接 入 MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5
mg/L AgNO3 的分化培养基中，15 d 后统计愈伤诱导
率，30 d 后统计再生频率和分化频率。
1.2.1.5 诱导培养基中不同浓度 6-BA 及 NAA 对油
菜外植体愈伤组织诱导及分化的影响 取培育 5 d
的油菜无菌苗，将子叶切成 0.5 cm2 左右的小块、下
胚轴切成 0.5 cm 左右的小段，接种于 MS+1.0 mg/L
2，4-D 的预培养基上预培育 5 d 后，将生长良好的外
植体（子叶、下胚轴）转接入含有不同浓度 6-BA 和
NAA 的分化培养基中，15 d 后统计愈伤诱导率，30
d 后统计再生频率和分化频率。
1.2.1.6 生根培养基中不同浓度 NAA 对油菜苗生根
的影响 取生长到 2-3 cm 的不定芽，接种到含不同
浓度 NAA 的培养基上诱导生根。20 d 后统计生根率
和平均得根数。
1.2.2 培养基成分与培养条件 无菌苗萌发培养基
为 1/2 MS ；预培养基为 MS+2，4-D（0.5、1.0 和 1.5
mg/L）；愈伤组织诱导培养基为 MS+6-BA（1.0、2.0、
3.0、4.0 和 5.0 mg/L）+NAA（0、0.05、0.1、0.2 和
0.3 mg/L）+3.5 mg/L AgNO3，共 25 个处理，芽诱导
培养基和愈伤组织诱导培养基成分相同 ；生根培养
基为 MS+NAA（0、0.1、0.2、0.5、1.0 和 2.0 mg/L）。
所有培养基中蔗糖浓度为 30 g/L、琼脂浓度为 7 g/L，
pH 为 5.8-6.0，培养温度为 25-28℃，光照条件为
12 h 光照 /12 h 黑暗。
1.2.3 试验数据的统计与分析方法 试验采用单因
素试验设计，每个处理重复 3 次，接种后每隔 2 d
2013年第1期 113杨长友等 ：甘蓝型油菜高效离体再生体系的建立
观察外植体的变化。试验数据应用 SPSS13.0 统计软
件进行相应的统计分析，平均数之间差异显著性比
较采用 LSD 法，柱形图和折线图均在 Excel2003 电
子表格下制作。
愈伤诱导率（%）= 形成愈伤组织的外植体数 /
接种外植体总数 ×100%
再生频率（%）= 长芽外植体数 / 接种外植体总
数 × 100%
分化频率（%）= 再生不定芽总数 / 接种外植体
总数 × 100%
生根率（%）= 长根的苗数 / 接种苗数 ×100％
2 结果
2.1 无菌苗苗龄对油菜外植体分化的影响
不同苗龄的油菜外植体（子叶、下胚轴）的再
生频率及分化频率存在一定差异。在油菜苗龄为 5 d
时，子叶、下胚轴的再生频率及分化频率均达到最
大，子叶的再生频率及分化频率分别为 85.26% 和
100% ；下胚轴的再生频率及分化频率分别为 80.85%
和 96.75%。
2.2 预培养时间对油菜外植体分化的影响
预培养时间对油菜外植体的再生频率及分化
频率均表现有不同程度的影响。预培养的子叶和下
胚轴的分化效果较好，分化频率分别为 80.20% 和
83.0%。方差分析结果表明，预培养 5 d 后子叶和下
胚轴的分化频率与其他预培养天数的相比差异显著，
而再生频率与其他天数的相差不大。因此预培养 5 d
有利于油菜外植体的分化。
2.3 预培养基中不同浓度2, 4-D对油菜外植体分化
的影响
油菜外植体经不同浓度 2，4-D 处理后的分化情
况存在显著差异。当 2，4-D 浓度为 1.0 mg/L-1 时，子
叶、下胚轴的再生频率均达到最大，分别为 87.52%
和 80.15% ；二者的分化频率也均为最大，分别为
120.50% 和 102.45%。
2.4 诱导培养基中不同浓度6-BA及NAA对油菜外
植体愈伤组织诱导及分化的影响
在不同激素组合处理条件下，油菜外植体愈伤
组织形成情况差异较大。子叶在 6-BA（1.0、2.0、3.0
和 4.0 mg/L） + NAA（0.05 和 0.1 mg/L）8 个 激 素 组
合处理条件下，愈伤组织形成情况较好，愈伤组织
生长较快（图 1-A）；下胚轴在 6-BA（1.0、2.0、3.0
和 4.0 mg/L）+NAA 0.05 mg/L 4 个激素组合处理条
件下，愈伤组织形成情况较好，愈伤组织生长较快
（图 1-B）。同时，从图 2 中可以看出，在 6-BA 浓度
为 1-4 mg/L、NAA 浓度为 0.05-0.1 mg/L 条件下，子
叶愈伤诱导率可达到 100% ；下胚轴在 6-BA 浓度为
1-4 mg/L、NAA 浓度为 0.05 mg/L 条件下，愈伤诱导
率在 90.0% 左右。因此，油菜子叶愈伤组织诱导的
适宜 6-BA 浓度为 1-4 mg/L，适宜 NAA 浓度为 0.05-0.1
mg/L ；下胚轴愈伤组织诱导的适宜 6-BA 浓度为 1-4
mg/L，适宜 NAA 浓度为 0.05 mg/L。
诱导培养基中不同浓度 6-BA 及 NAA 对油菜愈
伤组织分化的影响也较大。在本研究所设的激素条
件下，子叶愈伤组织在大多数激素组合条件下均可
分化出不定芽（图 1-C），下胚轴愈伤组织在部分激
素组合条件下也可分化出不定芽（图 1-D）。而在有
些激素组合条件下，虽可诱导愈伤组织形成，但不
能诱导芽的形成。
由图 3 可知，在 2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA
及 3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 的组合条件下子叶愈
伤组织的再生频率和分化频率均较高，两者的再生
频率分别为 88.0% 和 83.33%，两者的分化频率分别
A B C D E
A ：子叶愈伤组织诱导 ；B ：下胚轴愈伤组织诱导 ；C ：再生芽（子叶）；D ：再生芽（下胚轴）；E ：再生植株生根
图 1 油菜不同外植体的愈伤组织诱导及植株再生
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期114
为 104.0% 和 108.33%。方差分析结果表明，以上两
个激素组合条件下子叶愈伤组织的再生频率及分化
频率差异均不显著。从图 4 可以看出，在 4.0 mg/L
6-BA+0.05 mg/L NAA 的组合条件下下胚轴愈伤组织
的再生频率和分化频率均为最高，分别为 81.82%
和 104.55%， 且 与 其 他 组 合 差 异 较 大。 因 此， 油
菜子叶愈伤组织不定芽诱导的最佳激素组合为 2.0
mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA 及 3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L
NAA，油菜下胚轴愈伤组织不定芽诱导的最佳激素
组合为 4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA。
2.5 生根培养基中不同浓度NAA对油菜苗生根的
影响
不同浓度 NAA 条件下油菜苗的生根率及平均得
根数如图 5 所示。与不施加 NAA 的条件相比，施加
NAA 可以显著影响油菜苗的生根情况，而且不同
NAA 浓度下的油菜苗生根情况也存在差异，当 NAA
浓度为 0.5 mg/L 时油菜苗的生根率及平均得根数
均达到最大值，分别为 90.0% 和 21.6（根）。另外，
在 0.5 mg/L NAA 条件下，油菜苗生根较快，根较粗，
根系较发达（图 1-D）。因此，油菜苗生根的最佳培
养基为 MS+0.5 mg/L NAA。
图 2 不同浓度激素对油菜不同类型外植体愈伤组织的诱导效果
图 3 不同浓度激素对油菜子叶外植体分化的影响
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图 4 不同浓度激素对油菜下胚轴外植体分化的影响
图 5 不同浓度 NAA 对油菜再生苗生根的影响
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2013年第1期 115杨长友等 ：甘蓝型油菜高效离体再生体系的建立
3 讨论
本研究表明，较高的 6-BA 浓度及较低的 NAA
浓度有利于油菜愈伤组织的诱导及分化，这与前人
的研究结果类似［15］。然而通过比较发现，子叶和下
胚轴对不同浓度 6-BA 及 NAA 的敏感性存在一定差
异，下胚轴比子叶更为敏感。这可能是由于子叶和
下胚轴的内源激素含量存在差异以及两者对外源激
素的吸收能力不同，具体原因有待进一步研究。另外，
诱导培养基中加入 AgNO3 是为了促进油菜愈伤组织
形成不定芽。在愈伤组织形成过程中外植体会产生
大量乙烯，而乙烯对芽的形成有一定的抑制作用，
Ag+ 可与乙烯竞争作用部位，减弱乙烯的抑制作用，
从而间接地促进油菜愈伤组织形成不定芽，提高油
菜再生频率及分化频率［16，17］。已有研究表明［7， 8， 18］，
促进油菜愈伤组织形成不定芽的适宜 AgNO3 浓度为
5 mg/L。由于品种差异，本试验的 AgNO3 浓度选择
为 3.5 mg/L。
4 结论
本试验通过对甘蓝型油菜 HC8 的离体再生研
究，成功建立了油菜 HC8 的高效离体再生体系。其
组织培养最佳苗龄为 5 d ；最佳预培养时间为 5 d，
最适 2，4-D 浓度为 1.0 mg/L ；子叶最适诱导培养基
为 MS+2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3
或 MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3；
下胚轴最适诱导培养基为 MS+4.0 mg/L 6-BA+0.05
mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3 ；最佳生根培养基为 MS+
0.5 mg/L NAA。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）