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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(6):60-66
多种生物全基因组测序工作已经完成，相关测
序结果已在基础科学研究中广泛应用，大量用于基
因组工程（genome engineering）研究的新技术应运
而生。基因组工程是指为了实现某一目标对生物体
中特定的基因进行有针对性遗传修饰的技术［1］，它
开启了科学研究新的一页。基因组工程应用广泛，
可被用于敲除或失活一个基因，修复不利突变［2，3］，
或增加生物种群的多样性，如农药抗性植物技术的
发展［4，5］，或作为科学研究的工具如通过观察基因
失活导致的异常现象来阐述该基因的功能。
将一个 DNA 片段插入活细胞基因组的技术，如
转座子失活技术，具有一定的随机性。DNA 片段被
随机放置在染色体上，可能会干扰其他基因功能的
行使或灭活基因，甚至会造成比较严重的副作用，
如触发细胞癌变。更重要的是，这些技术没有可重
复性，不能保证同一序列插入不同细胞的同一位
置［6，7］。近年来基因组工程研究最大的突破是能够
特定地修饰生物染色体中某一区域的 DNA 序列，从
而提高基因组修饰的精度，防止细胞毒性的产生，
同时也增加了基因组操作的可重复性。近期发展起
来的基因组编辑技术（genome editing）很好地诠释
了这一点［8，9］。采用基因组编辑技术可以对几乎任
意基因进行修饰、编辑。位点特异性核酸酶编辑的
技术［10］以及最近刚兴起的由成簇的、规律间隔的
短回文重复序列（clustered regularly interspaced short
palindromic repeats，CRISPR）/Cas（CRISPR-associa-
收稿日期 ：2014-09-22
基金项目 ：国家重大科学仪器设备开发专项项目（2012YQ0401400802）
作者简介 ：李丹，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：ld_bit@126.com
通讯作者 ：高海军，男，博士，副教授，研究方向 ：微生物学 ；E-mail ：hj_gao@aliyun.com
多元自动化基因组工程
李丹  高海军
（北京理工大学生命学院，北京 100081）
摘 要 ： 基因组编辑技术在基因组工程研究中应用广泛，其中位点特异性核酸酶编辑技术和 CRISPR/Cas 系统在单基因编辑
方面贡献卓越，但由于基因组的庞大，这些技术又有一定的局限性。多元自动化基因组工程（MAGE）是一种新型基因组编辑技术，
可同时作用于多个基因，具有快速、高效的特点，已被用于大肠杆菌的基因敲除和基因替换。主要介绍了 MAGE 的原理、具体操
作流程及技术进展，并结合 MAGE 技术的应用，讨论其发展趋势。
关键词 ： 多元自动化基因组工程 ；基因组编辑技术 ；基因组工程 ；大肠杆菌
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.06.009
Multiplex Automated Genome Engineering
Li Dan Gao Haijun
（School of Life Sciences，Beijing Institute of Technology，Beijing 100081）
Abstract: Genome editing is widely used in genome engineering research and site-specific nuclease technologies and CRISPR/Cas
system focus on single gene editing. Owing to the huge size of genome, there are some limitations on the applications of these technologies.
Multiplex Automated Genome Engineering（MAGE）is a new, fast and efficient genome editing technology, which can operate multiple genes
simultaneously, and be used in knockout and replacement of Escherichia coli genes. This review illustrates the recent advances in the theory,
operation protocol and technological innovation of MAGE, its application and development trend were also discussed.
Key words: multiplex automated genome engineering ；genome editing ；genome engineering ；Escherichia coli
2015,31(6) 61李丹等：多元自动化基因组工程
ted）系统介导的基因组靶向修饰技术［11］是其中较重
要的两种。
1 基因组编辑技术（genome editing）
基因组编辑技术中用到的位点特异性核酸酶主
要包括锌指核酸酶（zinc-finger nucleases， ZFN）［12-14］
和转录激活因子样效应因子核酸酶（transcription ac-
tivator-like effector nucleases，TALEN）［8，9，15-17］，它
们 是 由 序 列 特 异 性 DNA 结 合 结 构 域（ 锌 指 蛋 白
或转录激活因子样效应因子）与非特异性 DNA 切
割结构域（Fok I 限制性核酸内切酶中的非特异性
DNA 切割结构域）组合而成的人工核酸酶。ZFN
和 TALEN 都能在靶位点切割双链 DNA 形成 DSBs
（DNA double-strand break）［18］， 引 发 细 胞内 的 非
同源性末端连接修复，即非同源性末端接合（non-
homologous end joining，NHEJ）［19，20］或同源重组修
复（homology-directed repair，HDR），对基因进行较
精确的遗传修饰。目前已建立了 ZFN 文库和 TALEN
文库，可从中获取相关特异性 DNA 结合结构域，进
行一系列基因改造［21-23］。
由 CRISPR/Cas 系统介导的基因组靶向修饰技
术是近期兴起的一种基因组定向编辑技术［11，24］。
CRISPR/Cas 系统广泛分布于细菌和古生菌基因组
中，为细胞提供一种获得性免疫保护机制，即通
过一套 RNA 介导的 DNA 切割机制使细菌免受外源
DNA 的侵扰［25-27］。其中 II 型 CRISPR/Cas 系统的研
究最为深入，该系统识别外源侵入的短片段 DNA 分
子（即间隔分子）并将其整合到 CRISPR 基因组内，
转 录 并 处 理 成 短 的 CRISPR RNAs（crRNAs）。 这
些 crRNAs 与反式激活的 crRNA，即 trans-activating
rRNA（tracrRNA）结合，介导 DNA 的序列特异性切割，
最终在 Cas 蛋白作用下将外源的“致病”DNA 分子
沉默。
这些基因组编辑技术在实验和临床等方面应用
广泛，极大地提高了人们对模式生物的处置和研究
能力，也为治疗遗传性疾病、纠正遗传错误提供了
一个平台［2-5，28-33］。
ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas 系 统 推 动 整 个 基
因组工程的发展。由于微生物基因组的规模十分庞
大，单纯利用产生 DSBs 来激活同源重组修复机制
（HDR）或非同源末端连接修复机制（NHEJ）的方
法很难实现多元化，且多处切口同时存在时，会给
细胞带来严重的损伤。此外，NHEJ 修复机制在断裂
处也较容易出现微小的基因片段的插入或缺失，导
致移码突变，最终使基因失活。因此迫切需要一种
高效的、多元的编辑技术［19，20］。
2 多元自动化基因组工程（MAGE）
哈佛医学院遗传系的 Church 研究小组在 2009
年 8 月的 Nature 杂志上发表了一项新技术——多元
自动化基因组工程（multiplex automated genome engi-
neering，MAGE）［34］，并于 2012 年 4 月申请了美国
国家专利［35］。
区别于一次仅改造一个基因的技术，多元自动
化基因组工程（图 1）可对细胞染色体上的多个基
因或位点进行修饰，方式多样，可以是插入、错配
或缺失，产生多种多样的基因突变型菌株［34，36］。
2.1 原理
2.1.1 λ 噬菌体 Red 重组系统 MAGE 基于 λ 噬菌
体 Red 重组酶的同源重组系统，Red 重组系统由 3
种蛋白组成 ：Exo 蛋白、Beta 蛋白和 Gam 蛋白。其
中 Exo 蛋白是一种核酸外切酶，结合在双链 DNA
末端，从 5 端向 3 端降解 DNA，产生 3 突出端 ；
Beta 蛋白结合在单链 DNA 上，介导互补单链 DNA
退火 ；Gam 蛋白可与 RecBCD 酶结合，抑制其对外
源 DNA 的降解。在内源性 λ 重组系统中，控制 exo、
bet、gam 三个基因的 PL 启动子受到 CI857 阻遏蛋白
的抑制，CI857 阻遏蛋白由 cI 基因表达产生，是一
个温敏性阻遏子，它在 30-34℃条件下，阻遏 PL 启
动子的功能，使其不能形成 λ red 蛋白 ；而在 42℃
条件下，该阻遏子被抑制，λ red 蛋白正常表达［37-41］。
2.1.2 MAGE 基 本 原 理 基 于 Red 重 组 原 理，
Church 研究小组构建了一套科学、完整的 MAGE 循
环系统，首先 30℃下培养菌体，达到对数期后温度
变换为 42℃，该条件下，CI857 阻遏蛋白被抑制，λ-Red
蛋白即 Exo 蛋白、Beta 蛋白和 Gam 蛋白正常表达，
接着将菌体冷藏于 4℃，防止上述生成的蛋白质被
降解，同时将人工合成的多个简并寡核苷酸通过电
击的方式转入细胞中，每个寡核苷酸都靶定了基因
组上的一段特定序列，结合后通过同源重组的方式
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.662
替换靶定序列。MAGE 的的优势在于可重复进行上
述循环，并能反复检测，使更多类的寡核苷酸转入
细胞，以促进基因组的快速变异（图 2）［34］。
2.2 MAGE自动化装置
由于上述过程是周期性、循环式的，操作起
来 比 较 繁 琐、 费 时 费 力，Church 研 究 小 组 设 计
了 一 个 自 动 化 装 置［34］， 使 得 上 述 过 程 实 施 起 来
省时省力，更加快速、有效的产生各种组合的基
因组。
图 3 为详细的 MAGE 自动化装置原理图，该装
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MAGE 工作流程分 6 个步骤 ：（1）决定基因组编辑的目标 ；（2）确定突变的目的位点 ；（3）设计 MAGE 诱变需要的寡核苷酸 ；（4）
预测 MAGE 的循环数 ；（5）进行 MAGE 循环 ；（6）筛选理想的表型或基因型
图 1 多元自动化基因组工程（MAGE）［42］
图 2 MAGE 循环详细过程［42］
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置由 3 部分组成，分别是可实时监控细胞浓度的人
工温控气候培养箱（绿色）、使细胞在人工培养箱和
培养液、缓冲液间交替更换的流控系统（蓝色）和
实时生产感受态细胞以便与人工合成的 DNA 片段库
电转结合的装置（黄色）。这 3 部分相辅相成，使得
MAGE 循环重复、有序进行。
根据不同的 MAGE 步骤（生长、热休克和冷
却），培养基放置于不同温度条件下的人工培养箱里
（30℃、42℃和 4℃），此过程中需要注意的是接受
了外来 DNA 片段的感受态细胞需要通过滤膜过滤并
用 wash buffer 重悬方可进入下一循环［34］。
2.3 MAGE的优势
MAGE 能将大量人工合成的具有各种突变（包
括碱基错配、插入和缺失）的 DNA 库导入宿主细胞
2015,31(6) 63李丹等：多元自动化基因组工程
进行重组，可以快速高效地在全基因组尺度上对菌
株的 DNA 序列进行设计和修饰，极大地加快了细胞
优化的进程。它的优势主要体现在以下几方面 ：
区 别 于 以 往 的 技 术，MAGE 将 ssDNA 导 入 细
胞中，这样使得 Red 重组效率由导入 dsDNA 片段
时的 0.2% 提高到 25%［43，44］；MAGE 可同时作用于
基因组的多个位点。MAGE 同时将大量靶向基因组
不同部位的序列的 ssDNA库转入细胞中，这样可
产生各种组合的突变型，真正实现了基因组的可编
辑、可组装［34］；MAGE 通过上述自动化装置，重
复周期性的导入 ssDNA，快速、高效地得到各种突
变型，“一天之内可生成数十亿个变化”［1］；导入的
ssDNA 片段进行磷硫酰化硫修饰以防止细胞本身核
酸外切酶的降解，有研究表明，对外来 DNA 片段进
行硫代磷酸化修饰，重组效率增加了 2-3 倍［44-46］；
导入的 ssDNA 片段作用于复制叉的后随链上，研究
表明此法比之前作用于前导链时重组效率提高了近
30 倍［43，47］。
2.4 MAGE的应用及改进
现在已有成功应用 MAGE 的例子，如大肠杆菌
DXP 合成途径改造。随着其应用的推广，也有一些
学者对该技术的缺陷和不足进行改进，并成功应用
到大肠杆菌色氨酸合成等途径中。
2.4.1 经典的大肠杆菌 DXP 合成途径改造 番茄红
素合成途径涉及 20 个内源性基因，包括 dxs、 dxr、
ispD、ispE、isp、GispH、idi、ispA、appY、rpoS、crl、
elbA、elbB、yjiD、purH、rnlA、yggT、ycgZ、ymgA
和 ariR［48，49］。Church 研 究 小 组 针 对 这 20 个 基 因
进行番茄红素表达的优化，将分别靶定每个基因的
ssDNA 库导入细胞中，经过 35 个 MAGE 循环，产
生了近 150 亿个基因变异体，经过合适的筛选方法
得到高产番茄红素突变株。另外，分支途径上的 4
个 基 因（ytjC、fdhF、aceE 和 gdhA）［50］ 因 引 入 两
个无义突变而失活，进一步提高了番茄红素的产
量［34］。由于自动化装置的存在，每个循环只需 2-2.5
h，此工作仅在 3 d 内完成，使得番茄红素的产量提
高了近 5 倍。由此可见，与之前的单基因操作相比，
MAGE 可以同时优化多个基因，其高效率也得到了
证实。
2.4.2 分层次结合组装基因组工程（CAGE） 该技
术［51］克服了 MAGE 仅作用于有限的十几、二十个
位点的缺陷，通过精确的操作，将 E. coli 全基因组
中 314 个 TAG 终止密码子替换成同义的 TAA 密码
子。研究人员将 314 个 TAG 密码子分成 32 个小组，
每个小组包含 10 个 TAG-TAA 的改变，再分别进行
小规模 MAGE 重组，然后利用细菌天然结合能力，
获得更大规模的换成 TAA 密码子的菌株，直到获得
不依赖 TAG 的全新突变菌株。该技术使得基因组工
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图 3 MAGE 自动化装置［34］（颜色标识见电子版）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.664
程从核苷酸水平上升到了兆碱基水平（the megabase
scale）。该技术也可应用于模式微生物操作中，用来
生产各种药品或化学制品。
2.4.3 共选择的多元自动化基因组工程（Coselection
MAGE） 共选择的多元自动化基因组工程（CoS-
MAGE）也是改进 MAGE 的一种方法，MAGE 同时作
用于染色体多个位点，可以得到大量的突变株，但
筛选过程过于复杂繁琐，从而导致大多数的突变型
无法得到鉴定而丧失意义，CoS-MAGE 由于 co-marks
的存在，能更好、更有效的进行突变株的筛选。T7
启动子作为一个 co-marks，将其插入与大肠杆菌色
氨酸合成途径（此途径产生靛蓝）相关的 12 个基因
的上游，经过几轮 MAGE 后，筛选靛蓝产量提高的
菌株，然后再进行 MAGE，如此几轮下来产生了 80
种不同 T7 启动子组合，经过筛选，得到了一株靛蓝
产量提高 62％的突变株。这说明 MAGE 可以通过插
入 co-marks 构建一个突变基因组合库来快速有效地
筛选到理想菌株［52，53］。
2.4.4 可定位的多重染色体重组技术（TRMR） 即
使如上述添加 co-marks 来提高筛选效率，仍不能满
足理论存在的突变型筛选工作。上述大肠杆菌色氨
酸生物合成过程中，12 个基因被工程改造，理论上
产生了 212 种突变型，但事实上研究者们只鉴定出
来 80 种。因此，在大量突变株存在的条件下，一
个高通量的筛选方法是很有必要的。2010 年，科罗
拉多大学的 Warner 等［54］发明了一种可定位的多重
染色体重组技术（trackable multiplex recombineering，
TRMR），利用分子条码［55］、微阵列及 MAGE 技术，
在一天时间内修饰了 E. coli 内 95% 的基因 ；在一周
内，完成影响 E. coli 生长的近 4 000 个基因的遗传
定位。具体操作是通过合成带有分子条码的，编码
相关突变的插入序列，电击转入宿主细胞，然后利
用分子条码技术追踪到相关突变，量化突变率，进
行遗传性状定位。这样大大提高了突变株筛选效率，
使得 MAGE 技术在应用中更进一步。
3 结语
综上所述，多元自动化基因组工程（MAGE）
技术是一种大幅度修改和进化细胞基因组的技术，
它可将大量人工合成的具有各种突变（包括碱基错
配、插入和缺失）的单链 DNA 库导入宿主细胞进
行重组，快速高效地得到各种突变株。尽管现在已
有应用 MAGE 及改进版的 MAGE 的成功案例，但
MAGE 有一定的局限性，表现在以下几点 ：（1）除
2013 年有文献提到一种类似方法应用于谷氨酸棒状
杆菌中［56］，MAGE 仅用于大肠杆菌这一模式菌株
中，可能与其作用机制（如导入的片段作用于后随
链）有关，其广泛应用还有待进一步的探索。（2）
经过几轮 MAGE，可以产生大量的基因突变型，上
述应用已提到一些筛选改进方法，但仍未能对大多
数突变型进行筛选，造成多数突变型的丢失。（3）
MAGE 突变位点的选择以及突变序列的设计对理论
储备和经验提出了更高的要求。（4）MAGE 可作用
于多个位点，其同源重组效率与单一位点重组相
比明显下降，如何提高这一效率还需更多的研究
探索［42］。
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（责任编辑 狄艳红）