全 文 ：·研究报告· 2011年第12期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期 ：2011-04-25
作者简介 ：张盈，女，硕士，研究方向 : 霉菌生物技术；E-mail:fionazhangying@hotmail.com
通讯作者 ：周祥山，男，博士，教授，博士生导师，研究方向 : 微生物制药，真核微生物生物技术；E-mail:xszhou@ecust.edu.cn
海洋真菌灰绿曲霉地标蛋白编码基因 AgTeaA 的
克隆与序列分析
张盈 沈伟 蔡孟浩 周祥山 张元兴
（华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）
摘 要 ： 为考察灰绿曲霉中地标蛋白 AgTeaA 对菌丝极化生长的作用，首先需要获得 AgTeaA 基因序列的相关信息。通
过简并 PCR 的方法得到 AgTeaA 基因编码区的一段序列，以已知序列为基础通过染色体步移的方法获得基因全长及两端侧翼序
列，然后通过逆转录 PCR 的方法确定出氨基酸序列，并利用相关生物学软件进行蛋白结构域的分析和系统进化树的构建。结果显
示，AgTeaA 基因编码区全长 4 706 bp，对应氨基酸全长为 1 477 aa，在 256-320 bp，733-780 bp，1 064-1 150 bp 处各有一个内含
子。与粟酒裂殖酵母 Tea1 蛋白和构巢曲霉 TeaA 蛋白相似的是，AgTeaA 在 290-339 aa，340-390 aa 处各有一个 Kelch 结构域，在
818-899 aa，938-999 aa，1 021-1 116 aa，1 183-1 335 aa 处各有一个卷曲螺旋（coiled coil）结构域。
关键词 ： 灰绿曲霉 极化生长 地标蛋白 基因克隆
Cloning and Sequence Analysis of the AgTeaA Gene Encoding
Landmark Protein in Marine-derived Fungus Aspergillus glaucus
Zhang Ying Shen Wei Cai Menghao Zhou Xiangshan Zhang Yuanxing
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）
Abstract: To indentify the role of landmark protein AgTeaA in polarized growth in marine A. glaucus，degenerate PCR and genome
walking methods were used to obtain the full gene sequences and flanking regions of AgTeaA，followed by reverse transcription PCR to indentify
the amino acid sequences. Afterwards conserved domain analysis and phylogenetic tree construction of the protein was performed using the
relevant biological software. The predicted AgTeaA protein is 1 477 aa in length and the putative length of AgTeaA ORF is 4 706 bp with three
introns at 256-320 bp，733-780 bp and 1 064-1 150 bp sites. Similarly to the S. pombe Tea1 and A. nidulans TeaA，the AgTeaA harbors two
Kelch domains at 290-339 aa and 340-390 aa sites and four coiled coil domains at 818-899 aa，938-999 aa，1 021-1 116 aa and 1 183-1 335
aa sites.
Key words: Aspergillus glacus Polarized growth Landmark protein Gene cloning
灰绿曲霉（Aspergillus glaucus）HB1-19 是中国
海洋大学从我国广东沿海红树林根系土壤中分离得
到的一株海洋丝状真菌，能产一种具有抗肿瘤活性
的新型蒽醌衍生物灰绿霉素 A（aspergiolide A）。该
化合物对人白血病 HL60 细胞、人肺癌 A549 细胞都
有较强的增殖抑制作用，对人脐静脉内皮细胞也有
明显的迁移抑制作用和增殖抑制活性，具有良好的
药用价值 [1,2]。
霉菌菌丝的延伸生长是有方向的，称之为极
化生长。细胞体不断分泌囊泡并流向菌丝顶端，
使得顶端细胞壁和细胞膜不断伸展而形成极化生
长。囊泡在菌丝顶端聚集为一个特殊区域，称之为
“Spitzenkörper”。霉菌极化生长相关结构和蛋白有微
管、纤维丝状肌动蛋白以及相关的马达蛋白如驱动
蛋白、动力蛋白和肌球蛋白。这些蛋白构成的细胞
骨架对建立和维持极化生长至关重要。肌动蛋白调
节囊泡的传递，微管蛋白也可以远距离传递囊泡。
同时微管蛋白将地标蛋白传递到菌丝顶端，这反过
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期158
来又影响肌动蛋白的极化排布。细胞骨架蛋白复合
物在响应营养、光照等环境信号后，控制囊泡的传
递和地标蛋白在菌丝顶端的空间定位，从而控制菌
丝延伸和生长的方向 [3]。
在构巢曲霉中，TeaA（粟酒裂殖酵母 Tea1 类
似物）是菌丝极化生长中一种十分重要的地标蛋白，
它能够与微管末端蛋白相结合，从而使微管聚集在
菌丝顶端一点，它的缺失会使菌丝呈锯齿状 [4]。地
标蛋白 TeaR（粟酒裂殖酵母 Mod5 类似物）定位于
菌丝顶端的细胞膜上，TeaA 依靠与它的结合锚定在
细胞膜上。在粟酒裂殖酵母中，驱动蛋白 Tea2（构
巢曲霉 KipA 类似物）运输 Tea1（构巢曲霉 TeaA 类
似物）到微管末端 [5,6]，但是在 KipA 缺失的构巢曲
霉中，TeaA 仍然能够定位在菌丝顶端，但却偏离
了正确位置，这说明 TeaA 并非是由 KipA 运输，但
KipA 却是 TeaA 蛋白的正确定位所必需的。KipA 可
能运输的是其他的地标蛋白 [4]。
本研究拟在灰绿曲霉中克隆与鉴定地标蛋白编
码基因 AgTeaA，为进一步的极化生长研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 大肠杆菌 TOP10 购自 Invitrogen
公司 ；海洋丝状真菌灰绿曲霉 HB1-19（Aspergillus
glaucus）HB1-19（ 保 藏 编 号 ：CCTCC M 206022），
由中国海洋大学顾谦群教授提供 ；pMD19-T 载体购
自宝生物工程（大连）有限公司。
1.1.2 主要试剂及仪器 Genome Walking Kit，DNA
Ligation Kit Ver. 2.0，RNAiso Plus 购自宝生物工程（大
连）有限公司 ；TIANgel Mini Purification Kit，Plant
Genomic DNA Extraction Kit，PrimeScript II 1st Strand
cDNA Synthesis Kit 购自天根生化科技（北京）有限
公 司 ；RQ1 RNase-Free DNase 购 自 Promega 公 司 ；
2×Taq PCR MasterMix，2×Pfu PCR MasterMix，DNA
Marker III，λHind III digest DNA Marker，Loading
Buffer 购自天根生化科技（北京）有限公司。
Bio-Rad Mini Personal Thermal cycler PCR 仪 用
于梯度和常规 PCR 反应 ；核酸电泳图像通过复日
FR-980 生物电泳图像分析系统获取 ；核酸定量由
NanoDrop 核酸定量仪 ND-1000 完成。
1.1.3 培养基及培养条件 LB 培养基 ：1% 蛋白胨，
0.5% 酵母粉，1% 氯化钠。固体培养基加入 2% 琼脂。
121℃高压灭菌 20 min。用于大肠杆菌培养。种子
培养基 ：麦芽糖 2%，甘露醇 2%，葡萄糖 1%，味
精 1%，酵母膏 0.6%，七水合硫酸镁 0.03%，磷酸
二氢钾 0.05%，用人工海水 [7] 溶解。121℃高压灭菌
15 min。用于灰绿曲霉培养。
培养条件 ：大肠杆菌在 LB 液体培养基 37℃，
200 r/min 摇床震荡培养或 LB 固体培养基 37℃静置
培养。灰绿曲霉在种子培养基 28℃，180 r/min 摇床
震荡培养或 30℃静置培养。
1.2 方法
1.2.1 灰绿曲霉基因组提取 [8] 用无菌水将斜面
上的孢子洗下，接种于 50 mL 种子培养基，28℃，
180 r/min 培养 24 h 后，置于布氏漏斗用真空抽滤机
抽滤得干菌丝，使用液氮对 1-2 g 菌丝进行充分研磨，
然后用 Plant Genomic DNA Extraction Kit 提取基因组，
以作为 PCR 扩增时的模板之用。
1.2.2 简 并 引 物 设 计 及 简 并 PCR 将 构 巢 曲 霉
（Aspergillus nidulans）TeaA 氨 基 酸 序 列 在 GenBank
数 据 库 中 检 索 得 到 一 些 与 之 同 源 性 较 高 的 蛋 白
（Aspergillus fumigates EDP53916，Neosartorya fischeri
XP_001265821，Aspergillus terreus XP_001209614，
Aspergillus niger XP_001391688，Aspergillus flavus
XP_002379373，Aspergillus clavatus XP_001272956，
Aspergillus oryzae XP_001822022）。将它们的氨基酸
序列利用 GeneDoc 进行比对，选取保守性较强的区
段设计上下游简并引物，引物序列见表 1。引物由
上海捷瑞生物工程有限公司合成。
引物名称 引物序列（5-3）
DTeaAF TTTGGWGGDCAGGTYGAAGG
DTeaAR CGATCBACNGTNGCYTGCAT
W.A/T ；D.A/G/T ；Y.C/T ；B.C/G/T ；N.A/T/C/G
表 1 AgTeaA 基因克隆简并引物序列
首先进行退火温度梯度 PCR 确定最适退火温
度，然后在最适退火温度下进行大量扩增目的条
带用于胶回收连 pMD19-T 载体测序。PCR 反应体
系（15 μL）：2×Taq PCR MasterMix 7.5 μL ； 引 物
（100 pmol/μL）各 0.5 μL ；模板 DNA 100 ng ；ddH2O
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补 足 至 15 μL。PCR 反 应 程 序 ：94 ℃ 4 min ；94 ℃
30 s，46-62℃ 1 min，72℃ 2 min，循环 30 次 ；72℃
10 min。测序由上海桑尼生物科技有限公司完成。
1.2.3 染 色 体 步 移（Genome Walking） 根 据
Genome Walking Kit 中 所 述 引 物 设 计 原 则， 结 合
Primer Premier 5.0 软 件， 以 简 并 PCR 获 得 的 基 因
序列为基础设计已知片段上游和下游各 3 条特异
性引物，三轮 PCR 反应过后，目的条带胶回收连
pMD19-T 载体测序。根据 Genome Walking 原理，每
次 walking 所得序列与原序列之间有一定的重叠性，
可将两段序列拼接起来，最终得到 AgTeaA 基因全
长及两端侧翼序列。
1.2.4 序 列 分 析 使 用 GenomeScan（http://genes.
mit.edu/genomescan.html） 在 线 分 析 得 到 的 AgTeaA
基因序列，确定起始密码子位置以用于后续 cDNA
扩 增 的 引 物 设 计， 利 用 SMART（http://smart.embl-
heidelberg.de/） 在 线 分 析 蛋 白 的 结 构 域。 利 用
ClustalX[9] 和 MEGA version 3.1[10] 软件通过邻接法进
行进化关系分析和进化树的构建。
1.2.5 逆转录 PCR（RT-PCR）[11] 与灰绿曲霉基因
组提取类似，RNA 提取也需要先经过抽滤和液氮
研磨，50-100 mg 菌体研磨充分后向研钵中加入
1 mL RNAiso Plus，然后按照 RNAiso Plus 说明书
上所述步骤完成 RNA 的提取。提取的 RNA 经过
RQ1 RNase-Free DNase 处理去除残留的 DNA 后，
利 用 PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit
制备 cDNA 第一链，作为逆转录 PCR 反应的模板。
扩增得到的目的条带胶回收连 pMD19-T 载体测序，
测序结果与全基因序列比对即可分析得出内含子
的位置。
2 结果
2.1 简并PCR
以表 1 中所述 DTeaAF/DTeaAR 作为引物，以
灰绿曲霉基因组作为模板进行梯度 PCR 扩增，结果
（图 1）显示，采用 62℃退火可以得到最亮且正确
条带（约为 1 600 bp）。将测序结果在 GenBank 数据
库中检索发现与黄曲霉 Tea1（XP_002379373）具有
72% 的最高同源性，说明扩增的目的条带极有可能
是正确的。
2.2 AgTeaA基因全长的获得及内含子位置的确定
在 简 并 PCR 获 得 的 已 知 片 段 的 基 础 上， 通
过染色体步移的方法得到 AgTeaA 基因编码区全
长 以 及 两 端 侧 翼 序 列。 使 用 GenomeScan 在 线 分
析 AgTeaA 基 因 得 到 信 息 如 下 ：AgTeaA 基 因 编 码
区 全 长 4 706 bp， 在 256-320 bp，733-780 bp，
1 064-1 150 bp 处各有一个内含子。
抽提灰绿曲霉总 RNA，去除残留 DNA，逆转
录得到 AgTeaA 基因的 cDNA，经 PCR 扩增后送测
序，测序结果与基因全长比对分析得到 AgTeaA 基
因内含子位置，3 个内含子分别位于 256-320 bp，
733-780 bp，1 064-1 150 bp 处， 与 GenomeScan 预
测 结 果 相 吻 合。AgTeaA 基 因 对 应 氨 基 酸 全 长 为
1 477 aa。AgTeaA 基因序列及对应的氨基酸序列如
图 2 所示。
2.3 AgTeaA蛋白结构域分析和系统进化树构建
利用 SMART 进行 AgTeaA 的结构域分析表明，
与粟酒裂殖酵母 Tea1[12] 和构巢曲霉 TeaA [4] 相似的
是，AgTeaA 在 290-339 aa，340-390 aa 处各有一个
Kelch 结构域（参与蛋白 - 蛋白相互作用），在 818-
899 aa，938-999 aa，1 021-1 116 aa，1 183-1 335 aa
处各有一个 coiled coil 结构域（介导蛋白质相互作用
的自主折叠）。通过比对发现 AgTeaA 与黑曲霉 TeaA
（74%）、 烟曲霉 TeaA（74%）和构巢曲霉 TeaA（72%）
都存在很高的同源性。用 Clustal X 软件进行序列多
重比对分析并利用 MEGA 3.1 根据分析结果进行了
TeaA 蛋白系统进化树的构建（图 3）。
张盈等 ：海洋真菌灰绿曲霉地标蛋白编码基因 AgTeaA 的克隆与序列分析
M.Marker III ；1-8. 退火温度分别为 46.0，47.2，49.3，
52.3，55.9，58.8，60.9，62.0℃
图 1 简并 PCR 扩增 AgTeaA 基因
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期160
虚线和点划线标示部分分别代表了一个 Kelch 结构域，实线标示部分代表了 4 个 coiled coil 结构域
图 2 AgTeaA 基因编码区及对应的氨基酸序列
2011年第12期 161
3 讨论
丝状真菌极化生长的研究是近年来的热点，以
模式真菌构巢曲霉中研究的最为普遍。灰绿曲霉作
为一种新发现的海洋丝状真菌，其次级代谢产物灰
绿霉素 A 具有很高的药用价值。菌丝的极化生长与
菌丝形态密切相关，同时还有可能影响相关的代谢
途径、分泌等，而通过基因工程手段提高目的化合
物的产量相比普通发酵手段是一种更为有效的方法，
因此在灰绿曲霉中开展极化生长相关基因如 AgTeaA
的研究是十分必要的。序列未知基因的克隆是对其
进行后续研究的基础。因此，我们首先通过简并
PCR 的方法获得 AgTeaA 基因编码区中一段序列，
再通过染色体步移的方法获得基因的全长，然后利
用逆转录 PCR 的方法和相关生物学软件进一步确定
基因相关信息。在已知基因序列的前提下，我们可
以通过基因敲除，荧光蛋白标记等手段开展相关功
能的研究。
序列未知基因的克隆是对其进行后续研究的
基础。因此，我们首先通过简并 PCR 的方法获得
AgTeaA 基因编码区中一段序列，再通过染色体步移
的方法获得基因的全长，然后利用逆转录 PCR 的方
法和相关生物学软件进一步确定基因相关信息。在
已知基因序列的前提下，可以通过基因敲除，荧光
蛋白标记等手段开展相关功能的研究。
4 结论
AgTeaA 中含有两个 Kelch 结构域和 4 个 coiled
coil 结构域，同时又与黑曲霉、烟曲霉和构巢曲霉
的地标蛋白具有较高的同源性，系统进化分析也表
明它与其他物种地标蛋白之间存在广泛的亲缘关系，
这些都表明本研究所得到的 AgTeaA 极有可能是灰
绿曲霉中一种重要的地标蛋白，在菌丝生长、细胞
分裂等过程中都发挥重要作用。但是 AgTeaA 在灰
绿曲霉极化生长中的具体功能尚待进一步的研究。
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张盈等 ：海洋真菌灰绿曲霉地标蛋白编码基因 AgTeaA 的克隆与序列分析
线框上的数字表示可信度的百分数，刻度尺表示 5% 的序列差异，
箭头所指的是灰绿曲霉的 TeaA 蛋白
图 3 TeaA 系统进化分析
（下转第 174 页）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011年第12期174
化入枯草芽孢杆菌 WB600 中诱导表达。结果表明，
在 69 kD 处存在目的蛋白，ELISA 检测纯化后的目
的蛋白与阳性血清存在特异性反应，从而为犬细小
病毒基因工程疫苗和新型诊断试剂盒的研制提供理
论基础及试验材料。
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