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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第8期
苯丙氨酸作为一种必需氨基酸主要从食物中
摄取，而人体内 75% 以上的苯丙氨酸代谢是靠苯
丙 氨 酸 羟 化 酶（Phenylalanine Hydroxylase，PAH，
EC1.14.16.1）来完成的。哺乳动物体内的苯丙氨酸
羟化酶主要存在于肝脏中［4］，若肝脏内的苯丙氨酸
羟化酶表达异常就会造成苯丙氨酸代谢紊乱，从而
引起苯丙酮尿症（PKU）的发生。目前，对于 PKU
的治疗主要通过控制饮食中苯丙氨酸的摄入量来减
缓症状。但苯丙氨酸本身作为人体必需氨基酸之一
收稿日期 ：2014-01-23
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31070711，31300087），新世纪优秀人才项目（NCET-10-0461），江苏省自然科学基金项目（BK20130131）
作者简介 ：曹淑慧，女，硕士研究生，研究方向 ：发酵工程 ；E-mail ：elizabethcsh@sina.com
通讯作者 ：周哲敏，男，教授，研究方向 ：生物酶学、发酵工程 ；E-mail ：zhmzhou@jiangnan.edu.cn
紫色色杆菌苯丙氨酸羟化酶的异源表达及
重组酶学性质研究
曹淑慧  周丽  崔文璟  刘中美  周哲敏
（江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122）
摘 要 ： 来源于紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）的苯丙氨酸羟化酶结构简单，性质更接近于人的苯丙氨酸羟化
酶，具有潜在的医药应用价值。从紫色色杆菌基因组中克隆得到苯丙氨酸羟化酶基因 pah。构建重组表达载体 pET24a-pah，并在
Escherichia coli BL21（DE3）中实现高效表达。离子层析纯化后，重组蛋白比酶活高达 503.2 U/mg。酶学性质研究显示，该重组酶
的最适温度为 40℃左右，50℃时 PAH 的半衰期为 15 min ；最适 pH 在 7.5 左右，在 pH6-8 范围内较稳定。37℃，pH7.5 条件下，
Km 值为 1.5 mmol/L，Vmax 为 0.5 mmol/min，kcat 为 5.05/s，催化效率 kcat/Km 为 3.37 L/mmol·s。
关键词 ： 苯丙氨酸羟化酶 紫色色杆菌 表达 纯化 酶学性质
Heterologous Expression and Characterization of Phenylalanine
Hydroxylase from Chromobacterium violaceum
Cao Shuhui Zhou Li Cui Wenjing Liu Zhongmei Zhou Zhemin
（The Key Laboratory of Industrial Biotechnology of the Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract:  Phenylalanine hydroxylase（PAH）derived from Chromobacterium violaceum has potential pharmaceutical value due to its
simple structure and the closer property to human PAH. We cloned the pah gene from C. violaceum and constructed recombinant expression
vcectors pET24a-pah, finally, the pah gene was efficiently expressed in Escherichia coli BL21（DE3）. The specific activity of recombination
protein was 503.2 U/mg after purification. The studies of enzymatic properties showed that the enzyme displayed maximum activity at 40℃, and
its half-life was 15 min at 50℃. The optimal pH was pH7.5, and the enzyme activity was stable at the range of pH6-8. Under the conditions of
37℃ and pH7.5, its Km was 1.5 mmol/L, Vmax was 0.5 mmol/min, kcat was 5.05/s, and the catalytic efficiency（kcat /Km）was 3.37 L/mmol·s.
Key words:  Phenylalanine hydroxylase Chromobacterium violaceum Expression Purification Enzymatic properties
是不可或缺的，长期的饮食限制可能增加饮食治疗
后期并发症出现的危险，如骨质疏松、微量元素缺失。
因此，如能将苯丙氨酸羟化酶通过口服或注射的方
式输送到体内发挥作用就可以有效治疗由于苯丙氨
酸羟化酶异常而引起的 PKU。Yew 等［14］通过将治
疗分子封装到红细胞的临床手段构建 PAH-RBCs，
成功实现活性酶在血液中代谢苯丙氨酸。与直接静
脉注射 PAH 酶相比，PAH-红细胞被消融时间显著
延长。同时小鼠试验证实，PAH-RBCs 的注入能使
2014年第8期 153曹淑慧等 ：紫色色杆菌苯丙氨酸羟化酶的异源表达及重组酶学性质研究
小鼠体内的苯丙氨酸下降 80%。这为研究苯丙酮尿
症的治疗方法指明了方向，同时也为该疾病的患者
带来新的福音。
苯丙氨酸羟化酶是一种非血红素铁单加氧酶［1］。
该酶与酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase）、色氨酸
羟化酶（tryptophan hydroxylase）同为芳香族氨基酸
羟 化 酶（Aromatic amino acid hydroxylases，AAAHs）
家族的成员，它们均能利用分子氧和来源于四氢生
物蝶呤的电子对相应的芳香族氨基酸底物进行羟基
化［3］。在苯丙氨酸羟化酶催化过程中，苯丙氨酸利
用一分子氧和一分子四氢生物蝶呤，在 PAH 的催化
下生成产物酪氨酸和一分子水，四氢生物蝶呤转化
为二氢生物蝶呤（图 1）。此外，铁离子是该反应的
一种非必须的辅助因子。当亚铁离子不存在时，四
氢生物蝶呤与氧气作用的产物过氧化氢就会积累，
严重影响酶活，可通过添加过氧化氢酶来去除这种
影响。当亚铁离子存在时，就会通过形成高价铁（Ⅳ）
的形式留住一个氧分子，使过氧化氢不再产生，从
而保障催化过程的顺利进行［6］。而高铁离子在最终
将其携带的一个氧分子通过羟基的形式置换给苯丙
氨酸使其变成产物酪氨酸，自身还原回亚铁离子的
形式。现有 PAH 酶活测定体系添加了上述所有的辅
助因子以及过氧化氢酶，使得该反应过程复杂，而
精简反应体系，可便于其后续研究和应用。
+
TyrosineTetrahydropterine Phenylalanine
O2 + +
PAH
Dihydropterine
H2N
NH2
NH2
H2NN
HN
O
O
OH
HO
OH
O O
N
N
OH
OH
H
OH
OH
N
H
N
H
N
H
H
N
+ H2O
图 1 苯丙氨酸羟化酶催化过程
苯丙氨酸羟化酶广泛存在于植物、动物和微生
物中。紫色色杆菌苯丙氨酸羟化酶（CvPAH）结构
简单，空间构象与人类苯丙氨酸羟化酶催化区域几
乎完全一样，并且空间结构比人苯丙氨酸羟化酶更
为松散，利于底物分子与活性中心的结合，同时热
稳定性更好［5］，所以应用前景更为广阔。虽然早在
1978 年，Nakata 等［10］就从紫色色杆菌中分离纯化出
苯丙氨酸羟化酶，但只测得其沉降系数、斯托克斯
半径、摩擦比、等电点等一些物理参数。Onishi 等［12］
通 过 抗 原 抗 体 相 互 作 用 的 原 理 分 离 得 到 重 组 的
CvPAH，纯化过程复杂，蛋白损失较高，不能满足
其应用需求。同时，目前尚无系统性的 CvPAH 酶学
性质方面研究的报道，该酶的测定过程也相对复杂。
由于大肠杆菌表达系统开发成熟、表达量高、
效果稳定、表达产物分离纯化相对简单、是原核生
物来源基因表达的首选宿主，本研究将来源于紫色
色杆菌的苯丙氨酸羟化酶在大肠杆菌中进行高效表
达，对重组酶进行分离纯化，高效制备该酶，并测
定其酶学性质和酶学常数，优化酶反应体系，旨在
为后续研究打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 紫色色杆菌（Chromobacterium
violaceum） 购 自 Sigma（ATCC12540）（ 国 药 代 理 ）
公司。宿主菌 Escherichia coli BL21（DE3）、克隆载
体 pUC19、表达载体 pET-24a（+）为 Novagen 公司
产品。
1.1.2 主要试剂与仪器 DNA 聚合酶、各种限制性
内切酶、T4 DNA 连接酶等均购自日本宝生物工程
（大连）有限公司，基因组 DNA 提取试剂盒、质粒
DNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒和 PCR 产物纯化试
剂盒均购自上海生物工程公司。AKTAXPRESS 蛋白
纯化系统（通用电气医疗器械集团）；DEAE，通用
电气（中国）医疗器械集团。
1.1.3 培养基 2YT 培养基（g/L）：胰蛋白胨 16，
酵母提取物 10，氯化钠 5。营养肉汤培养基（g/L）：
蛋白胨 10，牛肉膏 3，氯化钠 5。
1.2 方法
1.2.1 紫色色杆菌基因组 DNA 的提取 将紫色色杆
菌接种于营养肉汤培养基，26℃、150 r/min 培养 25
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期154
h 后收集菌体，用试剂盒（上海生工生物工程公司
的 EZ-10 spin column Genomic DNA Isolation Kit） 提
取基因组 DNA。
1.2.2 pah 基因的克隆
1.2.2.1 引 物 设 计 根 据 GenBank 提 供 的 C.
violaceum 苯 丙 氨 酸 羟 化 酶 基 因 序 列（GeneID ：
AF146711）设计引物。用 Primer 5.0 软件设计引物，
并在其上下游引入酶切位点 BamH Ⅰ和 Hind Ⅲ（下
划线部分所示）：Forward primer ：5-CGGGATCCATG-
AACGACCGCGCCGACTTTGTGG-3 ；Reverse primer ：
5-CCAAGCTTTCAGACGTCTTCGGTATC-3。
1.2.2.2 pah 基因的扩增和克隆 PCR 反应条件为 ：
94℃预变性 10 min ；94℃变性 1 min，56℃退火 35
s，72℃延伸 1 min，35 个循环 ；72℃再延伸 10 min。
纯化后的 PCR 产物经 BamH Ⅰ和 Hind Ⅲ双酶切后
连接到用同样限制性内切酶酶切的质粒载体 pUC19
上，转化 E. coli JM109 感受态细胞，挑取单菌落提
质粒进行双酶切验证获得阳性克隆，并经测序验证。
1.2.3 PAH 表 达 载 体 的 构 建 pUC19-PAH 和 pET-
24a（+）通过 BamH Ⅰ与 Hind Ⅲ双酶切，经琼脂糖
凝胶电泳后，回收目的片段，16℃连接过夜后转化 E.
coli JM109 感受态细胞，通过酶切验证，最终得到表
达载体 pET24a-pah。
1.2.4 PAH 重 组 蛋 白 的 诱 导 表 达 将 重 组 质 粒
pET24a-pah 转化至感受态细胞 E. coli BL21（DE3），
获得 PAH 表达型重组大肠杆菌 BL21/pET24a-pah。
挑取 BL21/pET24a-pah 平板单菌落，接种于 5 mL 含
100 μg/mL 卡那霉素的 2YT 培养基，37℃、200 r/min
过夜培养。取 1 mL 上述过夜培养菌液接种于 100
mL 含 100 μg/mL 卡 那 霉 素 的 2YT 培 养 基，37℃、
200 r/min 培养至菌液 OD600=0.6，加入 IPTG 诱导表达。
1.2.4.1 IPTG 诱 导 浓 度 优 化 接 菌 至 5 mL 含 100
μg/mL 卡那霉素的 2YT 培养基中，37℃、200 r/min
培养至 OD600=0.6，加入 IPTG 浓度分别为 0.1、0.2、0.4、
0.6 和 0.8 mmol/L，24℃诱导 24 h。
1.2.4.2 诱导时间优化 接菌至 5 mL 含 100 μg/mL
卡那霉素的 2YT 培养基中，37℃、200 r/min 培养至
OD600=0.6，加入 0.6 mmol/L IPTG，24℃诱导 6、12、
18、24、30 和 36 h。
1.2.4.3 最佳诱导温度 最佳诱导温度测定 ：接菌
至 5 mL 含 100 μg/mL 卡 那 霉 素 的 2YT 培 养 基 中，
37℃、200 r/min 培养至 OD600=0.6，加入 0.6 mmol/L
IPTG，分别在 12℃、18℃、24℃、30℃和 36℃下诱
导 24 h。
1.2.5 离子层析纯化 离心收集菌体，重悬于 20
mmol/L Tris-HCl 中，冰浴超声破碎，离心收集上清
用 0.45 μm 滤膜过滤。用 HisTrap DEAE FF column 1
mL（GE 公司）于 AKTA AVANT 层析系统中纯化上
清中的重组蛋白［6］。
1.2.6 PAH 重组酶的酶学性质分析 反应所得产物
L-Tyr 用 HPLC 进行检测。色谱柱为 La Chrom C18（5
μm，4.6×250 mm）；流动相为 10%（V/V）甲醇水溶液，
洗脱 10 min。荧光检测激发波波长为 265 nm，发射
波波长为 315 nm，柱温 40℃。所测得的产物峰面积
换算为标准产物浓度，从而计算酶活［7］。
酶活定义 ：在 37℃，pH7.5 的条件下，1 min 转
化底物 L-苯丙氨酸生成 1 μmol L-酪氨酸所需的酶量
为一个酶活力单位 1 U。
1.2.6.1 蛋白浓度测定 蛋白质定量采用常规的
Bradford 法［8］。
1.2.6.2 酶活测定体系确立 初始反应体系如表 1
所示。在 37℃下分别不添加苯丙氨酸（Phenylala-
nine）、PAH 重组酶、DMPH4、过氧化氢酶（Catalase）、
DTT、Fe2+ 检测其对酶活力的影响。以所有因子同时
添加时的酶活为 100%，作反应因子对酶活影响的柱
状图［9］。
表 1 PAH 酶活反应体系
因子 含量
Phenylalanine 1 mmol/L
PAH 重组酶 50 μg
DMPH4 200 μmol/L
DTT 5 mmol/L
Catalase 3000 U
Fe2+ 5 μmol/L
1.2.6.3 最适温度及温度稳定性 最适温度测定 ：
分别测定在 10℃、20℃、30℃、40℃、50℃和 60℃
下重组酶的酶活力（pH7.5 反应 10 min），以反应温
度对所测得酶活作图。
温度稳定性测定 ：在最适 pH 下，将 50 μg 的酶
分别于 20℃、30℃、40℃、50℃和 60℃下金属浴保
2014年第8期 155曹淑慧等 ：紫色色杆菌苯丙氨酸羟化酶的异源表达及重组酶学性质研究
温 0、15、30、45 和 60 min 后，加入底物于 37℃，
pH7.5 测定残留酶活，作温度稳定性曲线。
1.2.6.4 最适 pH 及 pH 稳定性 最适 pH 测定 ：在
最适温度下，分别测定 pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、
10.0 和 11.0 下的酶活，以最高活力为 100%，以各
反应 pH 对所测得的相对酶活作图。
pH 稳定性测定 ：在 25℃条件下将酶在不同 pH
值（pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 和 11.0）
的缓冲液中处理 12 h，然后在最适温度和 pH 下测
定酶活，以最高显示的酶活力为 100%，计算相对酶
活，并对 pH 值作图。
1.2.6.5 酶的动力学参数测定 以不同浓度（0.2、
0.4、0.8 和 1.0 mmol/L）的 L-苯丙氨酸为底物，在最
适条件下反应 10 min，测定初始速率。采用双倒数
作图法（Line weaver-Burk）计算 Km 及 kcat 值。
2 结果
2.1 pah基因的克隆
通过 PCR 方法扩增到紫色色杆菌 pah 的结构
基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见一条
约 900 bp 的 DNA 条带（图 2-A），该片段大小与预
期长度一致，说明已成功扩增出目的基因。连接
pUC19 载体后的重组质粒经 DNA 测序鉴定，序列与
GenBank 所报道的紫色色杆菌来源的 pah 基因完全
相同。将 pah 基因克隆于 pET-24a 载体 BamH Ⅰ和
Hind Ⅲ位点，构建重组表达质粒 pET24a-pah。重组
质粒经双酶切得到大小约为 5.3 kb 的 pET-24a 线性
片段和大小约为 900 bp 的插入片段，证明原核表达
载体 pET24a-pah 已成功构建（图 2-B）。将 pET24a-
pah 转入 E. coli BL21（DE3），获得 PAH 表达型重组
大肠杆菌 BL21/pET24a-pah。
2.2 PAH在大肠杆菌中的表达与表达条件的优化
对诱导培养条件进行优化，SDS-PAGE 电泳结
果表明，最佳 IPTG 诱导浓度为 0.6 mmol/L（图 3-A），
最佳诱导时间为 24 h（图 3-B），最佳诱导温度为
24℃（图 3-C）。所获得的蛋白分子量约为 34 kD，
与 PAH（33 kD）加上 T7-tag（pET-24a 载体上共表
达的标签）的理论值相符。
2.3 重组PAH的分离纯化
PAH 重组酶经 HisTrap DEAE FF column 1 mL 阴
离子柱纯化，SDS-PAGE 凝胶电泳分析结果（图 4）
表明，一步纯化获得了较纯的目的蛋白，纯化后的
比酶活相较纯化前提高了 5 倍左右，高达 503.2 U/mg。
5000
bp M 1
4000
3000
2000
1000
750
500
250
5000
bp
MA B 2
4000
3000
2000
1000
750
500
250
M ：DNA Marker ；1 ：pah PCR 产 物 ；2 ：pET24a-pah 经 BamH Ⅰ 和 Hind Ⅲ
双酶切结果
图 2 pah 基因的 PCR 扩增产物（A）及 pET24a-pah 质粒
双酶切验证（B）电泳图
kD M 1 2 3 4 5
97.4
66.2
42.7
31.0
A
kD M 1 2 3 4 5
97.4
66.2
42.7
31.0
C
kD M 1 2 3 4 5 6
97.4
66.2
42.7
31.0
B
（A）M ：蛋白质分子质量标准 ；1-5 ：IPTG 诱导浓度分别为 0.1、0.2、0.4、
0.6 和 0.8 mmol/L。（B）M ：蛋白质分子质量标准 ；1-6 ：诱导时间分别为 6、
12、18、24、30 和 36 h。（C）M ：蛋白质分子质量标准 ；1-5 ：诱导温度分
别为 20℃、30℃、40℃、50℃和 60℃
图 3 IPTG 诱导浓度（A）、诱导时间（B）及诱导温度（C）
优化 SDS-PAGE 电泳图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期156
各步的纯化效率如表 2 所示。
下的酶活（图 6-A）显示，该酶的最适反应温度为
40℃左右，超过 50℃酶活有所降低，但是当温度低
于 20℃时则会引起酶活的急剧下降。为方便起见，
后续反应中采用 37℃作为 PAH 酶的反应温度。
20℃ 处 理 1 h 酶 活 几 乎 没 有 变 化 ；40℃ 热 处
理 1 h 后酶活残存 85% 左右。而 50℃处理时间仅
15 min 就会造成酶活 50% 左右的损失（图 6-B）。
2.4.3 pH 对酶活力的影响 以 100 mmol/L 的乙酸-
乙酸钠体系作为 pH4.0-6.0 的缓冲体系，HEPES 体
kD M 1 2 3
97.4
66.2
42.7
31.0
M ：蛋白质分子质量标准 ；1 ：细胞破碎液 ；2 ：45%-80% 硫酸铵沉淀样品 ；
3 ：经 Histrap DEAE 柱子纯化样品
图 4 重组 PAH 纯化过程的 SDS-PAGE
2.4 重组PAH的酶学性质
2.4.1 酶活测定体系的优化 通过 37℃下对反应
体系中各反应因子缺失后酶活力变化的检测可知 ：
过氧化氢酶缺失对酶活几乎没有造成影响，Fe2+ 的
缺失会对酶活造成一定的影响，而二硫苏糖醇 DTT
和辅因子四氢生物蝶呤 DMPH4 一旦缺失则会造成
酶活完全丧失（图 5）。优化后的反应体系为 ：1
mmol/L 苯丙氨酸、50 μg PAH、200 μmol/L DMPH4、
5 mmol/L DTT、5 μmol/L Fe2+，后续研究中采用该反
应体系测定酶活。
2.4.2 最适温度及温度稳定性 重组酶在不同温度
表 2 重组 PAH 纯化总表
纯化步骤 总酶活（U） 蛋白量（mg） 比酶活（U/mg） 纯化倍数 产率（%）
Crude extract 1153.6 9.9 117.0 1.0 100.0
45%-80% ammonium sulfate fraction 560.7 3.7 151.1 1.3 48.6
DEAE cellulose eluate 460.6 0.9 503.2 4.3 39.9
系作为 pH7.0-8.0 的缓冲体系，碳酸钠-碳酸氢钠体
系作为 pH9.0-11.0 的缓冲体系。不同 pH 的酶活测
定结果（图 7-A）表明，在最适反应温度下该酶的
最适 pH 在 7.5 左右。pH 稳定性分析（图 7-B）显示，
该酶在 pH 值 6.0-8.0 范围内较稳定。
2.4.4 酶动力学参数 以 L-苯丙氨酸为底物，在
不同浓度下测定苯丙氨酸羟化酶的活性，从而计算
出该酶的动力学参数。该酶的米氏常数 Km 为 1.5
mol/L，最大反应速率 Vmax 为 0.5 mmol/min，转化数
kcat 为 5.05/s，催化效率 kcat/Km 为 3.37 L/mmol·s。
3 讨论
紫色色杆菌 PAH 催化区域的空间构象与来源于
哺乳动物的来源几乎完全一样，由于细菌酶所特有
的高活性、高温度耐受性，使得其应用前景更为广
阔。但目前该酶的表达量及制备水平远不能达到应
用的需求。本研究将该酶在大肠杆菌中进行异源表
达，获得了高表达量的 PAH。纯化后 PAH 比酶活
达到 503.2 U/mg，比从原始菌中纯化出 PAH 的比酶
活提高了近 8 倍，比 Nakata 等［10］的纯化更为简单。
比 Onishi 等［12］通过抗原抗体相互作用分离出 PAH
的比酶活提高了 3 倍。
本研究发现反应过程中不添加过氧化氢酶对
1
0
20
40
60
80
相
对
酶
活
% 100120
2 3 4 5 6 7
1 ：不添加 phenylalanine ；2 ：不添加 PAH ；3 ：不添加 DMPH4 ；4 ：不添加
DTT ；5 ：不添加 Fe2+ ；6 ：不添加 Catalase ；7 ：添加 1 mmol/L phenylalanine。
其中，50 μg PAH，200 μmol/L DMPH4，5 mmol/L DTT，3000 U catalase 和 5
μmol/L Fe2+
图 5 反应体系中不同因子缺失对酶活的影响
2014年第8期 157曹淑慧等 ：紫色色杆菌苯丙氨酸羟化酶的异源表达及重组酶学性质研究
PAH 酶活没有产生显著影响。而从已知的报道中可
推测 ：在之前的反应体系中之所以添加过氧化氢酶
是因为当亚铁离子不存在时，四氢生物蝶呤与氧气
反应后会产生过氧化氢，过氧化氢酶的主要作用是
将产生的过氧化氢分解以防过氧化氢对 PAH 酶产生
毒害作用而使反应不能朝着正确的方向进行［6］。当
亚铁离子存在时就可以阻止过氧化氢的产生，因而
本研究在添加了亚铁离子的情况下，不需添加过氧
化氢酶，从而使反应体系得到精简。这一结果对同
类酶的测定过程也有一定的借鉴意义。
本研究将紫色色杆菌来源 PAH 的酶学背景研究
的更为透彻。发现其最适反应温度为 40℃左右，且
在该温度下具有较好的热稳定性，虽然后续试验采
用 37℃作为 PAH 的酶的反应温度，仍可比 Pember
等［11］在 25℃下进行反应获得更高的酶活和催化效
率。可能是较高的温度有利于分子扩散。其最适 pH
在 7.5 左右，在 pH6.0-8.0 范围内酶活较稳定。重组
酶的动力学参数与从紫色色杆菌中纯化出的野生型
PAH 的相一致。本研究为苯丙氨酸羟化酶进一步的理
论研究和在 PKU 治疗中的应用奠定了良好的基础。
4 结论
本研究实现了紫色色杆菌 pah 基因在大肠杆菌
中的高效表达（比酶活达到 503.2 U/mg，比从原始
菌中纯化出 PAH 的比酶活提高了近 8 倍）。通过对
重组酶酶学性质及动力学分析，获得该酶的最适温
度 40℃左右、最适 pH7.5 左右，重组酶的动力学参
120A
100
80
60
40⴨ሩ䞦⍫%
20
0
10 20 30⑙ᓖć40 50 60
B ⴨ሩ䞦⍫%
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
15 30 45 60
20ć
30ć
40ć
50ć
60ćᰦ䰤min
图 6 温度对酶活力（A）及酶稳定性（B）的影响
A ⴨ሩ䞦⍫% 1201008060
40
20
0
4 5 6 7 8 9 10 11
҉䞨-҉䞨䫐
HEPES⻣䞨䫐-⻣䞨≒䫐
pH
B ⴨ሩ䞦⍫%
4
0
20
40
60
80
100
120
5 6 7 8
pH
9 10 11
҉䞨-҉䞨䫐
HEPES⻣䞨䫐-⻣䞨≒䫐
A ：PAH 在 pH4.0-11.0 范围内的最适 pH ；B ：PAH 在 pH4.0-11.0 放置 12 h 的稳定性 .
图 7 最适 pH（A）及 pH 对酶稳定性（B）的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期158
数与从紫色色杆菌中纯化出的野生型 PAH 的相似，
kcat 和 Km 的变化都不大。在 pH6.0-8.0 范围内具有较
好的稳定性。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）