全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
埃兹蛋白（Ezrin）是一种重要的膜 - 细胞骨
架 连 接 分 子， 属 于 ERM 家 族（Ezrin，Radixin，
Moesin）中的一员。ERM 家族蛋白的同源性主要体
现在他们都在 N-末端有一个同源性很高的 FERM 功
能域（FERM domain），以及在 C-末端的不同氨基
酸位置上有一个关键的、与其激活有关的苏氨酸磷
酸化位点，FERM 功能域在介导细胞表面黏附分子
与细胞骨架连接的生理功能中起着关键作用。通过
Ezrin 的桥接作用，可将肌动蛋白细胞微丝与细胞膜
收稿日期 ：2012-08-24
基金项目 ：国家自然科学基金项目（30570960，30900749），深圳市重点实验室建设与提升计划
作者简介 ：张宏玲，女，博士研究生，研究方向 ：细胞生物学 ；E-mail: zhanghl08@mails.tsinghua.edu.cn
通讯作者 ：黄来强，男，教授，研究方向 ：分子与细胞生物学 ；E-mail: huanglq@tsinghua.edu.cn
Ezrin 多克隆抗体制作及应用
张宏玲  万骏  严飞  张新胜  曹威  陶伟  黄来强
（1. 清华大学生命科学学院，北京 100084 ；2. 清华大学深圳研究生院生命与健康学部 生物医药研究中心和基因与
抗体治疗重点实验室，深圳 518055）
摘 要 ： 构建 Ezrin 原核重组表达载体 pET-28a（+）-ezrin，将其转化至大肠杆菌 BL21（DE3）中，诱导获得 Ezrin 蛋白，
将经镍柱亲和层析纯化后的蛋白分别免疫新西兰大耳兔和昆明小鼠（KM），获得抗血清，采用 ELISA 和 Western blotting，免疫荧
光测定其效价和特异性。ELISA 对抗血清进行效价测定表明抗血清可与抗原发生特异性免疫反应 ；通过 Western blotting 对抗血清
进行鉴定表明抗血清可以识别几种细胞株内的特异性条带，其相对分子量为 82 kD，与预测分子量相符 ；免疫荧光试验表明抗血清
可以识别细胞内的 Ezrin 蛋白，且定位情况与文献报道相符。最后通过 protein G 对抗血清进行了纯化。结果表明用该方法制备的
Ezrin 多克隆抗体有较高的特异性和灵敏度。
关键词 ： 原核表达纯化 Ezrin 蛋白 动物免疫 抗血清 抗体鉴定
The Production and Application of Ezrin Polyclonal Antibody
Zhang Hongling Wan Jun Yan Fei Zhang Xinsheng Cao Wei Tao Wei Huang Laiqiang
（1. School of Life Sciences，Tsinghua University，Beijing 100084 ； 2. The Shenzhen Key Lab of Gene and Antibody Therapy，Center for Biotech
& BioMedicine and Division of Life & Health Sciences，Graduate School at Shenzhen，Tsinghua University，Shenzhen 518055）
Abstract:  Constructed Ezrin prokaryotic expression vector pET-28a（+）-ezrin, the recombinant plasmid was transformed into E. coli
BL21（DE3）, induced Ezrin protein was purified through Ni-chelating affinity chromatography and purified protein was used to immunize New
Zealand rabbits and Kunming mice, antiserum was removed. The titer and specificity of anti-sera were determined by ELISA, Western blotting
and immunofluorescence. The specificity of the anti-Ezrin antibody was identified by Western blot and immunofluorescence. The results showed
that anti-sera antibody reacted with antigen and detected a specific band of 82 kD, and the size was agreed with the predicted molecular mass,
localization dectected by inmmunofluorescence was in good agreement with the references. Finally, the anti-surem was purified by protein G.
These results suggested that the Ezrin polyclonal antibody revealed high sensitivity and specificity.
Key words:  Prokaryotic expression and purification Ezrin Animal immunization Anti-serum Polyclonal antibody
相连，从而产生一系列细胞功能，如细胞形态的改
变、细胞运动、黏附、有丝分裂、细胞极性等［1-3］。
研究发现 Ezrin 在多种肿瘤中表达异常，并且在肿瘤
细胞转移过程中扮重要角色［4，5］。Ezrin 通过调节黏
附分子和信号转导以及细胞骨架及其相关蛋白的功
能，参与细胞与细胞、细胞与基质之间的相互作用，
从而在肿瘤发展、浸润和转移过程中起着重要作
用［6，7］。
研究肿瘤相关蛋白功能机理的一个重要方法是
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期130
通过找出其相互作用的蛋白，进而阐述它在整个网
络状信号通路中所起的作用。 本研究通过原核诱导
表达，纯化出 Ezrin 全长蛋白，便于后续验证与其相
互作用蛋白的体外直接结合，并通过蛋白免疫动物，
获得针对 Ezrin 的多克隆抗体，为研究其在真核细胞
以及在肿瘤发生发展过程的相关功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
质粒 pET-28a（+）-ezrin，重组大肠杆菌 E. coli
BL21（DE3）［ 携 带 质 粒 LpET-28a（+）-ezrin］ 为
本 实 验 室 构 建 和 保 存 ；HeLa，HepG2，HEK 293，
CNE，NIH3T3 细胞为本实验室储存 ； 用于饲养哺乳
动物细胞的 DMEM 培养基购自 Gibico 公司 ；新西兰
大耳兔、昆明鼠，购买自广州实验动物中心 ；蛋白
质 Marker 购自 Fermentas ；HRP 酶标二抗（抗鼠和
抗兔）及罗丹明标记的二抗购自 KPL 公司。
1.2 方法
1.2.1 Ezrin 蛋白原核诱导表达及纯化 随机挑取单
克隆接种于 5 mL 含适量抗生素 LB 液体培养基中，
于 37℃、200 r/min 条件下过夜培养。然后按 2% 接
种量接种于 200 mL 含抗生素新鲜的 LB 液体培养基
中，于 37℃、200 r/min 条件下继续培养。当菌液
浓 度 达 到 OD600=0.6 时 加 入 终 浓 度 1 mmol/L IPTG，
37℃、200 r/min 条件下培养。IPTG 诱导 5 h，5 000 r/min
离 心 5 min， 收 集 菌 体， 用 40 mL 20 mmol/L Tris-
HCl（pH8.0）缓冲液混合重悬，冰上进行超声处理。
5 000 r/min 离心，根据蛋白表达情况分别收集上清，
沉淀。结果显示 Ezrin 蛋白主要在上清中。
纯化方法 ：Ni-NTA His Binding@Resin 2 mL 柱预
处理 ：用 5 mL 去离子水洗涤 ；加 0.5-1 mL NiSO4 ；
再用 5 mL 去离子水洗涤。用 10 mL 20 mmol/L Tris-
HCl（pH8.0）+8 mol/L 尿素平衡柱。上样准备好的
蛋白上清溶液，收集流出液。用 30 mL 20 mmol/L
Tris-HCl、100 mmol/L 咪 唑、1 mmol/L β-巯 基 乙 醇
（pH8.0），收集流出液。用 10 mL 20 mmol/L Tris-HCl，
300 mmol/L imidazole，1 mmol/L β-巯 基 乙 醇，pH8.0
洗脱蛋白，收集 1 mL/管，蛋白在此步收集。最后
用 10 mL 20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L imidazole，1
mmol/L β-巯基乙醇，pH8.0 洗涤，收集流出液。用
10 mL 去离子水洗涤柱子，充满 20% 乙醇，放在 4℃
冰箱保存。纯化的蛋白用 SDS-PAGE 电泳检测。
1.2.2 Ezrin 兔 抗 血 清 的 制 备 取 2 mL 蛋 白（1.6
mg/mL）制品与等体积的弗氏完全佐剂混合，在新
西兰大耳兔背部选取 4-6 个点，进行皮下多点接种，
共接种 4 次，每次间隔 14 d，第 4 次加强免疫后 7 d
耳缘静脉采血，分离血清，进行效价检测，获阳性
结果后，进行心脏取血，将血液收集到无菌的试管中，
室温静置 1-2 h，待血液凝固后，转移到 4℃冰箱中，
放置过夜，至血清析出，将血清转移到无菌的离心
管中，10 000 r/min、4℃离心 30 min，取上清，保存
于 -70℃备用。
1.2.3 Ezrin 鼠抗血清制备 5 只 3-4 周龄昆明小鼠，
将 200 μg 抗原蛋白溶于 250 μL 生理盐水并与等体积
弗氏完全佐剂充分乳化，对小鼠进行皮下注射。首
次免疫 2 周后进行第 2 次免疫，免疫原剂量减半，
并用弗氏不完全佐剂乳化。第 2 次免疫后每隔 7 d
按照 2 次免疫的方法继续免疫，第 4 次免疫后第 3
天，分离血清，进行效价检测，获阳性结果后进行
心脏取血，将血液收集到无菌试管中，室温静置 1-2
h，待血液凝固后转移到 4℃冰箱中，放置过夜，至
血清析出，将血清转移到无菌离心管中，10 000 r/min、
4℃离心 30 min，取上清，保存于 -70℃备用。
1.2.4 ELISA 检 测 抗 血 清 效 价 抗 原 包 被 ：将 抗
原用包被液 1 4 000 稀释（10 μg/mL 终浓度），100
μg/孔加入聚苯乙烯 96 孔反应板中，4℃放置过夜。
洗涤 ：次日倾去凹孔内的液体，PBST 洗 3 次。封
闭 ：加 100 μL/孔3% BSA，室温放置 0.5 h。洗涤 ：
用 PBST 洗 3 次。加待测样品（一抗）：将抗体血清
在另一块板上用 PBS 连续稀释，100 μL/孔加到已包
被的板上，每个样品平行做两份，免疫前的血清作
为阴性对照。加盖 37℃恒温箱温育 1 h。洗涤 ：用
洗涤液洗 3 次。加 HRP 酶标二抗：用封闭液 1∶8 000
稀释，100 μL/孔，加盖 37℃恒温箱温育 1 h。洗涤 ：
用 PBST 洗 5 次，蒸馏水洗 2 次。显色 ：加新鲜配
制的底物溶液 100 μL/孔暗处放置 5-30 min，显示蓝
色。终止反应，比色：加 50 μL/孔终止液，颜色变黄；
用酶标仪测定 450 nm 处各孔的吸光值，阳性反应的
最大稀释度为待测样品的效价。
1.2.5 Western blotting 检测 将收集的细胞加入 SDS
2013年第1期 131张宏玲等 ：Ezrin 多克隆抗体制作及应用
加样缓冲液，煮沸 10 min，离心后取上清液进行
SDS-PAGE 后电转移至 PVDF 膜上，以 5% 的脱脂
牛奶封闭 2 h，与自制兔抗人，鼠抗人 TRIP-1 的多
克隆抗体 4℃过夜，之后用 TBST 每 10 min 洗 1 次，
共 3 次；加入相应二抗室温 1 h 后用 TBST 洗膜 3 次，
每次 10 min，曝光。
1.2.6 细胞免疫荧光 固定在盖玻片上的细胞用
PBS 漂洗 3 次，每次 5 min ；用 3.7% 的甲醛固定细
胞，37℃ 10 min ；0.1% TritonX-100 透化 10 min ；PBS
漂洗 3 次，每次 5 min ；5% 山羊血清（PBS 配制）
室温封闭 1 h ；去除山羊血清封闭液之后，直接加入
5% BSA 稀释的一抗，4℃杂交过夜。PBS 漂洗 5 次，
每次 5 min ；加入 5% BSA 稀释的二抗，室温避光杂
交 1 h ；PBS 漂洗 5 次，每次 5 min ；抗催灭封片剂封
片，激光共聚焦荧光显微镜上观察。
1.2.7 Protein G 亲和层析柱纯化抗体 配制缓冲液 ：
起始缓冲液为 TBS 缓冲液，洗脱缓冲液为 pH2.7 0.1
mmol/L 甘氨酸盐酸。
准备收集管 ：取 1.5 mL 离心管，每支离心管加
70 μL pH9.0 1 mol/L Tris-HCl。
样品准备 ：抗血清经 TBS 进行透析过夜，并经
0.22 μm 微孔滤膜滤过。
透析过的待纯化的样品 15-25 mL 上柱，流速为
0.5 mL/min，将留出的样品反复过柱。然后以同样的
流速用 10-20 倍体积的 TBS 缓冲液洗涤，去除未结
合和非特异性结合的蛋白，洗涤是否完全可以通过
测定 OD280 的吸光度进行。洗脱缓冲液（pH2.7，0.1
mmol/L 甘氨酸盐酸）6-7 mL 每管 1 mL 收集洗脱液，
测每管 OD280 吸收值。收集第 2 洗脱峰，BCA 法测
蛋白含量，4℃保存备用。
图 1 Ezrin 蛋白的诱导表达和纯化结果
M ：Marker ；1 ：诱导前全菌上样 ；2 ：诱导后全菌上样 ；3 ：纯化结果
82
116.0
kD kD
66.2
45.0
35.0
1 2 3M
纯化的抗体用 SDS-PAGE 电泳鉴定其纯度 ：用
12% 分离胶、5% 浓缩胶，恒流下电泳 2 h，考马斯
亮蓝 R250（Pharmacia）染色。
2 结果
2.1 Ezrin蛋白的表达与纯化
利用构建好的 pET-28a（+）-ezrin 载体分别转化
E. coli BL21（DE3），成功地原核诱导表达 Ezrin 全
长蛋白于上清，并且用经镍柱纯化好的蛋白进行下
一步试验，即免疫小鼠和新西兰大耳兔。
2.2 Ezrin抗血清效价检测
将用 Ezrin 蛋白抗原免疫 4 次之后的新西兰大
耳兔以及昆明鼠抽取血清样本通过 ELISA 法测量
抗体效价，计算阳性血清和阴性血清 A450 值之比
（antiserum/preimmune serum，a/p）， 当 a/p ≥ 2.1 时
为阳性，当 1.5 ≤ a/p ＜ 2.1 时为可疑，当 a/p ＜ 1.5
时为阴性。抗血清效价测定，经过免疫过的兔和鼠
的血清，通过 ELISA 法测定其效价，如图 2 所示，
两种抗血清稀释倍数为 106 时，和阴性血清相比，
仍呈现阳性反应，表明免疫后的两种抗血清的效价
均达到 106。
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dilution ratio×10n 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Dilution ratio×10n
3.0A B
2.0
1.0
0.0
0.5
1.5
2.5
A
45
0
A
45
0
antiserum
preimmune serum
antiserum
preimmune serum
图 2 兔抗血清（A）及小鼠抗血清（B）效价图
稀释倍数（10 的指数）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期132
2.3 利用抗体检测真核细胞及组织蛋白表达情况
利用抗体检测真核细胞及组织蛋白表达情况，
各细胞及组织蛋白，12% 蛋白胶 PAGE 电泳，将制
作好的 Ezrin 鼠源及兔源抗体用于 Western blotting 试
验，检测多种细胞和组织当中的 Ezrin 表达情况。将
所制备抗体 3 000 倍稀释用来检测真核细胞内源性
Ezrin 蛋白表达情况，如图 3 所示，兔抗和鼠抗均
能够很好的检测真核细胞内源性的蛋白表达，包括
293、HeLa、CNE 及 NIH3T3 细胞株。 在 HepG2 细
胞中，没有检测到 Ezrin 蛋白的表达。以上结果说明
制备的抗血清具有较高的特异性和灵敏性。
图 4 Ezrin 蛋白细胞免疫荧光检测
55
55
kD
26
kD
1M 2 3 4
43
34
26
17
M ：蛋白质 Marker ；1 ：Ezrin 抗兔血清全上样 ；2 ：Ezrin 兔抗
血清纯化 ；3 ：Ezrin 鼠抗血清全上样 ；4 ：Ezrin 鼠抗血清纯化
图 5 抗体纯化结果图
2.5 Ezrin抗体纯化
取免疫过的兔和鼠的抗血清，利用 protein G 纯
化方法，将 2 种抗体进行了初步纯化，从纯化结果
（图 5）可清楚的看到抗体重链（55 kD）和轻链（26
kD），但是纯化得率较低，且有杂带。其原因可能
是抗血清中的抗体亚型与 protein G 柱子结合能力较
低，或者洗脱缓冲液的 pH 值需要改进和调整。
2.4 细胞免疫荧光法检Ezrin蛋白细胞内定位
取 HeLa 细胞进行免疫荧光，用 Ezrin 鼠抗来检
测其在细胞内的定位情况，二抗 rhodamine 标记的
羊抗鼠抗体。荧光显微镜下拍照。将制备的 Ezrin 鼠
抗人多克隆抗体 100 倍稀释进行细胞免疫荧光化学
染色试验分析，发现制备的抗体能够进行细胞免疫
荧光化学染色，且染色效果十分良好，同时发现，
Ezrin 蛋白在细胞质内质网位置定位明显，此定位与
发表的相关文献吻合（图 4）。
Ezrin
antibody from mouse
antibody from rabbit
29
3
He
La
He
pG
2
CN
E
Ezrin
A
B 2
93NI
H3
T3
He
La
He
pG
2
CN
E
图 3 Ezrin 鼠源（A）及兔源（B）抗体 Western
blotting 试验检测 Ezrin 表达情况
3 讨论
Ezrin 是属于 ERM 家族蛋白中与肿瘤密切相关
的蛋白，它在多种癌症组织中高表达且对肿瘤细胞
的迁移起着重要的调控作用。对其功能的研究将进
一步揭示癌症发生发展的机理并有望找到治疗癌症
的新靶点。本试验中原核表达纯化出的 Ezrin 蛋白
也可以直接用于验证相互作用和体外蛋白活性的试
验，为揭示与 Ezrin 相互作用的蛋白创造条件。抗体
是研究基因功能的重要工具［8-11］。制备一种效价高、
特异性好的抗体是研究疾病相关基因的表达、定位
和生物学功能非常重要的一步。抗体包括多克隆抗
体，单克隆抗体等。单克隆抗体的特异性较好，但
制作过程比较繁琐。多克隆抗体则制作较为容易。
本研究通过原核诱导表达与纯化［12］，得到较为纯净
的 Ezrin 蛋白，采用直接免疫兔子和小鼠的方法获得
抗血清。兔抗和鼠抗均能够很好的检测真核细胞内
源性的蛋白表达，包括 293、HeLa、CNE 及 NIH3T3
细 胞 株。 在 HepG2 细 胞 中， 没 有 检 测 到 Ezrin 蛋
白的表达，这与文献报道相符。曾有文献报道在
HepG2 细胞株当中，Ezrin 的表达量很少［13］。ELISA
是检测抗体质量相关系数的重要手段［14，15］，本研究
制备的抗血清经过 ELISA 测定具有较高的效价。未
2013年第1期 133张宏玲等 ：Ezrin 多克隆抗体制作及应用
经纯化的抗血清效价非常高，稀释很高的倍数仍可
用于 Western blotting 和免疫荧光等试验，表明制备
的抗血清可用于多种免疫学试验，且有较高的特异
性和灵敏度。
抗血清纯化可使用几种不同的方法，常用的是
蛋白 A/G 结合法和抗原亲和纯化法［16，17］。为了进
一步提高抗体的纯度，采用 protein G 方法对抗体进
行了纯化，但纯化效率有待提高。分析原因可能是
抗血清中的种属亚型与 protein G 的结合能力较弱，
或者洗脱缓冲液的 pH 值需要进一步调整和优化。
综上所述，本研究制备的 Ezrin 多克隆抗体具有
与其抗原特异性结合的特征，并成功应用于 ELISA，
免疫印迹和免疫荧光试验，其纯化方法仍需进一步
改进。这为继续深入研究此蛋白的病理、生理学功
能及其调控打下了基础。
4 结论
通过将原核表达纯化，获得了较为纯净的 Ezrin
全长蛋白。通过免疫新西兰大耳兔和昆明小鼠，获
得了抗血清。通过 ELISA，Western blotting 和免疫荧
光试验验证了抗体的效价和特异性，证明用该方法
可制备具有较高特异性和灵敏度的多克隆抗体。
参 考 文 献
［1］ Bretscher A, Edwards K, Fehon RG. ERM proteins and merlin ：
integrators at the cell cortex［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2002, 3 ：
586-599.
［2］ Gautreau A, Louvard D, Arpin M. Morphogenic effects of Ezrin
require a phosphorylation-induced transition from oligomers to
monomers at the plasma membrane［J］. J Cell Biol, 2000, 150（1）：
193-203.
［3］ Algrain M, Turunen O, Vaheri A, et al. Ezrin contains cytoskeleton
and membrane binding domains accounting for its proposed role as
a membrane-cytoskeletal linker［J］. J Cell Biol, 1993, 120（1）：
129-139.
［4］ 卢航青 , 郑杰 . 埃兹蛋白 ：生物学特征及其在肿瘤转移中的作
用［J］. 细胞生物学杂志 , 2005, 27 ：257-262.
［5］ 王友元 , 李劲松 , 陈伟良 . 埃兹蛋白相关信号通路与肿瘤侵袭
转移［J］. 国际肿瘤学杂志 , 2011, 38（3）：166-169.
［6］ Yu Y, Khan J, Khanna C. Expression profiling identifies the
cytoskeletal organizer Ezrin and the developmental homeoprotein
Six-1as key metastatic regulators［J］. Nat Med, 2004, 10 ：175-
181.
［7］ Makitie T, Carpen O, Vaheri A. Ezrin as a prognostic indicator
and its relationship to tumor characteristics in uveal malignant
melanoma［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2001, 42（11）：2442-
2449.
［8］ 王俊茹 , 覃文新 , 李锦军 , 等 . 肝癌相关蛋白 HCAP1 的表达、
抗体制备及其亚细胞定位［J］. 中国免疫学杂志 , 2003, 19（1）：
26-28.
［9］ 王仁 , 杨向东 , 屈顺林 , 等 . 新的人突触相关蛋白（FRG4）抗
原表位分析及抗体制备［J］. 中国免疫学杂志 , 2005, 21（7）：
531-534.
［10］ 刘雨飞 , 丁丽华 , 郝春芳 , 等 . 转录因子 XBP21 的融合表达、
纯化及多克隆抗体的制备［J］. 中国生物化学与分子生物学报 ,
2004, 20（6）：762-767.
［11］ 韩克军 , 杨美香 , 李燕 , 等 . 肿瘤相关抗原基因 HCA520 重组
蛋白的表达纯化及其肝癌患者血清中相应抗体的分析［J］.
中国生物化学与分子生物学报 , 2003, 19（1）：31235.
［12］ 郭艳荣 , 常晓月 , 崔晓君 , 等 . eEFIAl 基因克隆、原核分泌表
达及融合蛋白纯化［J］. 生物技术通报 , 2011（6）：127-133.
［13］ Zhang Y, Hu M, Wu W, et al. The membrane-cytoskeleton or
ganizer ezrin is necessary for hepatocellular carcinoma cell growth
and invasiveness［J］. J Cancer Res Clin Oncol, 2006, 132 ：685-
697.
［14］ 张小兵 , 邸禄芹 , 吴萌 , 等 . 单克隆抗体与多克隆抗体配对
ELISA 方法比较［J］. 生物技术通报 , 2009（11）：125-129.
［15］ 陈卓 , 刘家驹 , 毕亮 , 等 . NPR1 多肽抗体的制备和应用［J］.
生物技术通报 , 2012（1）：145-150.
［16］ 张圆 , 庄然 , 金伯泉 , 等 . 兔抗 mLAIR21 胞外区抗体的制备、
纯化和鉴定［J］. 细胞与分子免疫学杂志 , 2005, 21（5）：
595-597.
［17］ 王京 , 汪立 , 范慧 , 等 . CMTM12v17/CKLFSF12v17 多克隆抗体
的制备、亲合纯化与鉴定［J］. 中国免疫学杂志 , 2006, 22 ：
1132-1136.
（责任编辑 马鑫）