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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第5期
中国大单孢属真菌一新纪录种
金宇溪1 王爽2
（1 北京市八十中学，北京 100102 ；2 首都师范大学，北京 100048）
大单孢属（Aplosporella）隶属于真菌界（Fungi），
子囊菌门（Ascomycota），盘菌亚门（Pezizomycotina），
座 囊 菌 纲（Dothideomycetes）， 葡 萄 座 腔 菌 目
（Botryosphaeriales），葡萄座腔菌科（Botryosphaeriace-
ae）的一个无性态属。大单孢属成员常常生于植物
的小枝条上，引起植物小枝条枯死。该属包含多个
异源种，这些异源种需要进一步归到其他相关属里
去［1］。大单孢属成员具有明显的寄主专化性，因
此有些种是根据寄主来描述，但是这样的划分标
准受到质疑［2］。中国有关大单孢属报道较少，目
前只记载一个种，即淡色大单孢菌（Aplosporella
subhyaline），由金静［3］从山东沿岸海洋木生真菌分
离得到。最近，在研究黄杨叶斑病时，从病斑中分
离到一种真菌，该真菌在分生孢子器形态以及分生
孢子大小和颜色与大单孢属非常相似 ；根据形态学
和核糖体基因内部转录间隔区（ITS）序列分析显示
该菌与李生大单孢菌（Aplosporella prunicola）一致。
因此确定该菌为李生大单孢菌，系国内新纪录种。
试验材料是 2011 年 10 月初在北京市首都师范
大学校园内采集到的有病斑的大叶黄杨叶片。PDA
培养基 ： 马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，水
补足至 1 000 mL，pH7.0 ； E. Z. N. A. 微量真菌 DNA
提取试剂盒 ： OMEGA 公司 ； TaKaRa Taq 酶 ： 大连
宝生物公司。
形态学研究。取不同位置的叶片病斑组织切成
1-3 mm 大小，做常规组织分离。即用 75% 的酒精
浸润 2-3 s 后，用 10% NaAO 消毒 3-5 min，最后用
无菌水漂洗 1-3 次，稍微控干后移植于（PDA）平
板上，在 25℃条件下培养。每天观察是否有菌丝生
长，将得到的不同菌落进一步纯化，得到纯培养物。
然后将纯化后的菌株进一步在 25℃条件下培养，观
察菌落形态并显微镜检。将不同培养物在显微镜下
根据产孢与否将菌株分成两大类群。对产孢类群主
要根据孢子颜色、形状、大小以及产孢结构进行记录、
拍照（图 1）。显微镜型号为 OLYMPUS BX51，日本。
该真菌经过纯化后在 25℃下培养，菌落形态初
为白色，后变成灰白色至灰色或橄榄绿色，气生菌
丝匍匐，菌丝生长速度为 4 mm/d，约 10 d 达到培养
皿边缘。于第 10 天在培养基上形成分生孢子座，第
15 天形成分生孢子器，第 20 天开始产生分生孢子。
分生孢子座圆锥形，直径 0.5 mm，常在分生孢
子器周边形成大水珠，最外层壁厚达 100 μm，褐色，
由角胞组织构成。分生孢子座多腔，腔室大小变化大，
直径 40-90 μm，每个腔室的壁由 2-5 层平行丝构成，
初期无色后变成淡褐色。孢子器周边常生有无色淡
褐色刚毛。 合轴产孢，产孢细胞圆柱形到花瓶状，
薄壁，顶端有 1-3 环，（5-10）×（2-3）μm ； 侧丝
无色，光滑，有分支和分隔，20-40 μm 长，基部宽
4-6 μm，顶部渐细至1-2 μm。分生孢子无分隔，光滑，
亚圆柱形，初为无色，后变成厚壁褐色，壁上有小
疣状突起。孢子大小为（12-21）×（9-11）μm。
有性态 ：未知。寄主 ：大叶黄杨。分布 ：目前
仅知分布在南非，在中国系首次报道。标本检查 ：
中国，北京，分离自大叶黄杨叶片上，培养物保
藏在首都师范大学微生物实验室，HCL8888 （BJTC
20112）。
图 1 显微镜检结果
A.培养状态下分生孢子器（右边为水珠）； B. 多腔分生孢子器; C.成熟孢子（褐
色）带有小疣状突起 ; D. 未成熟孢子（在棉兰中染成蓝色）和成熟孢子（褐色）
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分子系统学研究。分别从平板上挑取少量菌丝
到 1.5 mL EP 管中于 -20℃冷冻 12 h，用研磨棒充分
研磨后，提取菌丝体的全基因组 DNA。将得到的全
基因组 DNA 作为模板进行 ITS 基因的扩增，PCR 的
引物为真菌通用引物 ITS1-f 和 ITS4。DNA 扩增体系
为 ： 10 × buffer（不含 Mg2+） 5 μL，dNTPs（均 2.5
mmol/L）4 μL，引物 1 和引物 2（均 25 μmol/L）各
1 μL，模板 4 μL，MgCl2（2.5 mmol/L）2.5 μL，TaqE
（25 U）0.1 μL，加 ddH2O 至 50 μL（参考大连宝生
物 TaKaRa Taq体系）。PCR 扩增程序为 ： 94℃ 预变
性 3 min ； 94℃ 变性 30 s，50℃退火 45 s，72℃ 延
伸 1 min，35 个循环 ； 最后 72℃延伸 7 min。产物于
0.8% 琼脂糖凝胶，80 V，40 min 电泳后紫外检测。
PCR 产物于 4℃ 保存。
测序工作均由上海英骏生物技术有限公司完
成。DNA 序列采用苹果机 mac 系统的 ClustalX 对自
测的序列和从 GenBank 下载的序列进行比对分析，
用 Se-Al v2.0 a11 对比对结果进行手工编辑校正，切
除两端多余序列，并且在保留原序列信息的基础上
对测序中的明显错误碱基进行编辑调整，然后用
PAUP4.0b10 进行最大简约性建树（MP）分析，所
有特征被视为无序且权重相同，空缺视为缺失信息，
采用启发式搜索随机重复 100 次，然后 Bootstrap 重
复 1 000 次评估各节点的支持率。
所构建的系统发育树如图 2 所示，各节点自
举检验值（bp）超过 50% 的保留。树长度（TL） =
838，一致性指数（CI）= 0.680 2，保留指数（RI）=
0.772 5 ， 复 定 一 致 性 指 数（RC）= 0.525 4。 从
系统树树上可以看出，本研究所分离得到的菌种
HCL8888 与 Aplosporella prunicola的关系密切，节点
支持率达到了 100%，序列的相似性也达到 99%，因
此可以确定其为 Aplosporella prunicola。
参 考 文 献
［1］ Pande A, Rao VG. The genus Aplosporella Speg. （= Haplosporella
Speg.） （Coelomycetes） from India. Nova Hedwigia, 1995, 60:
79-117.
［2］ Damm U, Fourie PH, Crous PW. Aplosporella prunicola, a novel
species of anamorphic Botryosphaeriaceae. Fungal Diversity, 2007,
27: 35-43.
［3］ 金静 . 渤海、黄海海域山东沿岸海洋木生真菌的分类研究［D］.
泰安 : 山东农业大学，2004.
（责任编辑 李楠）
图 2 ITS序列构建的MP树，显示真菌 HCL8888与
Aplosporella prunicola关系密切