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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(5):224-230
藏猪是世界上少有的高原型猪种，是唯一能够
适应高原海拔气候和以放牧为主的猪种［1］。藏猪主
产于青藏高原，包括云南迪庆藏猪、四川阿坝及甘
孜藏猪、甘肃的合作猪以及分布于西藏自治区山南、
林芝、昌都等地的藏猪类群。由于近年来繁殖育种
手段不断改进，高强度选育，加之生态环境的改变，
致使许多拥有丰富遗传资源的地方品种数量锐减，
纯种藏猪的分布范围和数量正在不断减少，已面临
种群灭绝的危险［2］。因此，最大限度地保存藏猪的
遗传多样性是藏猪保护与利用面临的突出问题。
mtDNA D-loop，即 mtDNA 的非编码区，该区的
进化速率较其他区域高 5-10 倍，是目前 mtDNA 研
究的热点，被广泛应用于哺乳动物遗传多样性和种
内、种间亲缘关系等方面的研究［3-5］，甘佳等［6］以
微卫星标记测定了四川境内阿坝、稻城和德格 3 个
藏猪遗传多样性。近年来，应用 mtDNA 研究猪的遗
传多样性及系统发育比较多［7-9］，Gou 等［10］评估了
随机和选择性繁殖猪种群之间的遗传多样性，结果
收稿日期 ：2014-09-10
基金项目 ：国家自然科学基金（青年）项目（31101682）
作者简介 ：郭永博，男，硕士研究生，研究方向 ：动物遗传理论与应用 ；E-mail ：guoyongbo016@163.com
通讯作者 ：蔡原，女，博士，副教授，研究方向 ：动物遗传育种与繁殖 ；E-mail ：caiyuan@gsau.edu.cn
西藏藏猪遗传多样性研究
郭永博  蔡原
（甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070）
摘 要 ： 采用 mtDNA D-loop 作为分子标记，对西藏的 4 个藏猪群体（林芝、山南、昌都和日喀则）遗传多样性进行了研究。
结果表明，西藏藏猪 mtDNA D-loop 高变区 A+T 含量（62.90%）明显高于 G+C 含量（37.1%），富含 A 和 T，存在碱基偏倚性。在
长度为 435 bp 的序列中，共检测到 20 个变异位点，界定了 26 个单倍型，单倍型多样度（Hd）为 0.705±0.021，平均核苷酸差异
数（k）为 1.231，核苷酸多样度（Pi）为 0.002 83。其中，Hd、k 和 Pi 在昌都藏猪群体中最高，日喀则藏猪最低。此外，Hap1 和
Hap3 单倍型是 4 个群体的共享单倍型，表明 4 个藏猪群体存在两个共同的母系祖先单倍型。
关键词 ： 藏猪 ；mtDNA D-loop ；单倍型 ；遗传多样性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.05.034
The Study of Genetic Diversity in Tibetan Pig of Tibet
Guo Yongbo Cai Yuan
（Faculty of Animal Science & Technology，Gansu Agriculture University，Lanzhou 730070）
Abstract: mtDNA D-loop was selected as a marker to determine genetic diversity of the 4 Tibetan pig populations（Nyingchi, Shannan,
Chamdo and Shigatse）in Tibet. The results showed A + T content（62.90%）was significantly higher than the G + C content（37.1%）,
indicating that Tibetan pigs’ mtDNA D-loop was rich in A and T; there was the presence of a base bias. A total of 20 variable sites and 26
haplotypes were identified in the 435 bp nucleotide sequence of mtDNA D-loop, haplotype diversity（Hd）was 0.705 ± 0.021, the average
number of nucleotide differences（k）was 1.231, and nucleotide diversity（Pi）was 0.00283. Among them, Hd, k and Pi were the highest
in Chamdo Tibetan pig population, and lowest in Shigatse. In addition, Hap1 and Hap3 were 4 shared haplotypes, revealing that there were 2
common maternal ancestor haplotypes in 4 Tibetan pig populations.
Key words: Tibetan pig ；mtDNA D-loop ；haplotype ；genetic diversity
2015,31(5) 225郭永博等：西藏藏猪遗传多样性研究
表明随机繁育种群单倍型多样性显著大于选择性繁
育种群 ；Li 等［11］研究了西藏野猪的遗传适应与高
海拔有关，表征了家猪唾液分泌增加的遗传基础 ；
Jiao 等［12］测定藏猪的遗传多样性发现，合作猪目前
具有较高的遗传多样性，可以进行合理利用 ；Zhao
等［13］利用 mtDNA 研究了中国猪的起源和演化，表
明了中国国内猪可能是起源于野生长江中游地区及
中国南方的公猪 ；Gou 等［14］通过研究藏猪、亚洲
家猪和野猪 mtDNA 高变区，认为在西藏高原和东南
亚岛屿地区存在家猪的两个新的起源中心 ；张亚平
等［15］测定了云南 4 个地方猪品种的 mtDNA D-loop
高变区，结果显示 mtDNA 多态能有效作为品种内遗
传多样性指标，及云南 4 个地方猪品种大多数个体
起源于一个野猪亚种［15］。以 mtDNA 分子标记研究
西藏藏猪遗传多样性报道较少，因此，本研究对分
布在西藏 4 个藏猪 mtDNA D-loop 高变区序列进行研
究，以期为藏猪资源保护提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究采集了西藏林芝藏猪、山南藏猪和昌都
藏猪 3 个群体共 267 头藏猪血液样品，详见表 1。
1.2 方法
1.2.1 试验方法 参照 《分子克隆实验指南》［16］，
采用常规酚 - 氯抽提法提取基因组 DNA。根据发
表 在 GenBank 中 的 西 藏 藏 猪 mtDNA D-loop 序 列
（Accession ：AF486868） 设 计 引 物 ：上 游 引 物（P-
L16405）：5-ATACCAATCACTAGCATCAT-3 ；下 游
引 物（P-H653）：3-CCGGATCATGAGTTCCATGAA-
GT-5。
进行聚合酶链式反应，PCR 扩增反应体系体
积 为 ：60 μL， 其 中 ：10×Buffer 5.0 μL（Mg2+ 1.5
mmol/L）、dNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL、 上 下 游 引 物
各 5 μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL、模板
DNA 1 μL，加双蒸水至 28.0 μL。扩增条件 ：94℃ 2
min；94℃ 20 s，58℃ 30 s，72℃ 1.5 min，35 个循环；
72℃ 10 min，4℃保存。PCR 产物经 1% 的琼脂糖凝
胶电泳检测，扩增产物送上海生工生物工程股份有
限公司纯化并进行双向测序。
1.2.2 数据处理 测得的原始序列，通过 Chromas-
Version2.33（http：//www.technelysium. com.au/chromas.
html）进行人工编辑，校对电泳峰图与碱基对应关系，
剪切非研究区域序列。分析中引用来自于 GenBank
（http ：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）
的 西 藏 藏 猪 相 关 序 列， 见 表 1。 并 用 MEGA 5.0
（http ：//www.megasoftware.net）建立序列数据库，采
用 Clustal X 1.8（http ：//www.igbmc.ustrasbg.fr/pub/
ClustalX）进行同源序列比对分析。采用 DnaSP 5.10.1
（http ：//www.ub.edu/dnasp） 进 行 核 苷 酸 变 异 位 点、
单核苷酸多态性、单倍型数目、单倍型多样性分析
以及计算单倍型多样度、核苷酸多样度和平均核苷
酸差异度。
表 1 样品信息
群体 样品量 GenBank 登录号 来源
林芝藏猪（LT） 119
122
HQ148311-15、HQ148326-43
JX068141-236
未提交
（Guo X，2011）
（Jin L，2013）
本研究
山南藏猪（ST） 8
11
72
AY463062、AY486116
DQ152868、DQ152874、DQ152892 DQ379101-2
AF486856
HQ148356-66
未提交
（Gongora J，2004）
（Fang M，2006）
（Yang J，2004）
（Guo X，2011）
本研究
昌都藏猪（CT） 17
73
HQ148394-410
未提交
（Guo X，2011）
本研究
日喀则藏猪（RT）
合计
24
446
JX068117-40 （Jin L，2013）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5226
2 结果
2.1 mtDNA D-loop高变区SNPs分析
西 藏 藏 猪 mtDNA D-loop 高 变 区 经 扩 增、 测
序、编辑后，获得长度为 435 bp 核苷酸序列。用
MAGE5.0 软件进行碱基分析发现，T、C、A 和 G 4
种核苷酸的平均比例分别为 27%、24%、35.90% 和
13.10%，A+T 含量（62.90%）明显高于 G+C 含量
（37.1%），可见藏猪 mtDNA D-loop 高变区富含 A 和 T，
同时体现了哺乳动物线粒体 DNA 碱基组成的基本
特点。利用 Dnasp5.10.1 软件对 4 个藏猪 446 个个体
的 mtDNA D-loop 区进行单核苷酸多态性分析（single
nucleotide polymorphism，SNP），共检测到 20 个多态
位点，占所测核苷酸的 4.60%，说明该核苷酸序列
突变率小，有较好的稳定性，其中有 3 个单一多态
位点和 17 个简约信息位点（表 2）。
表 2 西藏藏猪 mtDNA D-loop 高变区变异位点数统计
群体 变异位点 单一多态位点 简约信息位点
林芝藏猪（LT） 12 0 12
山南藏猪（ST） 13 3 10
昌都藏猪（CT） 16 5 11
日喀则藏猪（RT） 2 0 2
碱基变异数（S）分布结果（图 1-A）表明，在
第 1-40 个碱基之间没有发现碱基变异，说明这是
一个相对保守的区域，变异区在第 41 个碱基与 435
个碱基之间，而高变区集中在第 157-417 碱基之
间。核苷酸多样度（Pi ：序列间每个位点的平均核
苷酸差异数）变化趋势（图 1-B）显示，D-loop 区核
苷酸多样度最高峰值出现在第 250 碱基左右（图 1）。
2.2 遗传多样性分析
核苷酸多样性分析表明，西藏藏猪单倍型多样
度（Hd±Sd）、核苷酸多样度（Pi）和平均核苷酸差
异 数（k） 分 别 为 0.705±0.021、0.002 83 和 1.231。
其中，山南藏猪和昌都藏猪两个群体的 3 个多样性
参数均高于西藏藏猪的整体水平，而林芝藏猪和日
喀则藏猪群体均低于整体水平（表 3）。无论从单倍
型数、单倍型多样度还是核苷酸多样度来看，昌都
藏猪遗传多样性最高，而日喀则藏猪最低。
2.3 单倍型分析
西藏藏猪单倍型分析表明，根据检测到的 20 个
多态位点，界定了 26 个单倍型（Hap1-Hap26，表
4）。其中，两个及以上群体的共享单倍型共有 13 个，
而 4 个群体共享的只有 2 个（Hap1 和 Hap3）。群体
S
Pi
0
0 100 200 300 400⻡สս㖞bp
0 100 200 300 400⻡สս㖞bp
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0
2
4
6
8
B
A
图 1 mtDNA D-loop 高变区序列碱基变异（A）及核苷酸
多样度（B）分布
表 3 西藏藏猪 mtDNA D-loop 遗传多样性
群体 样本数 单倍型数 单倍型多样度（Hd） 核苷酸多样度（Pi） 平均核苷酸差异数（k）
林芝藏猪（LT） 241 14 0.538±0.036 0.00198 0.86
山南藏猪（ST） 91 14 0.816±0.029 0.00351 1.525
昌都藏猪（CT） 90 17 0.883±0.014 0.00431 1.876
日喀则藏猪（RT） 24 3 0.420±0.110 0.00127 0.551
西藏藏猪 446 26 0.705±0.021 0.00283 1.231
注 ：西藏藏猪遗传多样性参数是对 4 个群体的整体分析
2015,31(5) 227郭永博等：西藏藏猪遗传多样性研究
间的特有单倍型数差异较大，除日喀则藏猪没有特
有单倍型，其他 3 个群体都存在特有单倍型，其中
林芝藏猪特有单倍型数最多（6 个），占单倍型总数
的 23.08%，山南藏猪特有单倍型最少（3 个）。单倍
型频率差异较大，Hap1 单倍型频率最高，有 229 个
个体，Hap6、Hap3、Hap9 和 Hap16 频率依次降低，
个体数分别为 51、42、32 和 29。其余 11 个单倍型
频率都低于 10。
表 4 西藏藏猪 mtDNA D-loop 高变区变异位点分布
单倍型 变异位点 林芝（LT） 山南（ST） 昌都（CT） 日喀则（RT） 合计
Hap_1 GTGCTCGCTCGCTAATCTAA 160 33 18 18 229
Hap_2 ..................G. 3 3
Hap_3 .....T...T.......... 18 10 12 2 42
Hap_4 .....T.....T........ 3 3
Hap_5 ...T.T...T.......... 2 2
Hap_6 .....T.............. 30 8 13 51
Hap_7 ...T.T.............. 1 1
Hap_8 ....CT.......G...... 2 2
Hap_9 ......A............. 6 11 15 32
Hap_10 ...............C.... 5 1 1 7
Hap_11 ....C....T.......C.. 2 1 3
Hap_12 .................C.. 1 1 2
Hap_13 A.................G. 4 1 1 6
Hap_14 ............C....... 4 4
Hap_15 ....C............... 1 1
Hap_16 .........T.......... 14 11 4 29
Hap_17 .......T............ 1 1
Hap_18 .....T...T.....C.... 3 3 6
Hap_19 .....TA............. 3 2 5
Hap_20 ..........A......... 2 3 5
Hap_21 ....CT...T.......... 1 1
Hap_22 .C.T....CT......T... 2 2 4
Hap_23 .....T...T....G..... 2 2
Hap_24 .................C.T 1 1
Hap_25 .........T.....C.... 3 3
Hap_26 ..A..............C.. 1 1
注 ：圆点表示与第一个序列有相同碱基 ；变异位点中由上至下的数字表示变异位点的位置
3 讨论
3.1 藏猪mtDNA D-loop高变区序列特征
由于饲养量下降和杂交改良等因素，藏猪资源
受到严重威胁［17］，现已被列入《 国家级畜禽遗传
资源保护名录》。开展藏猪种质资源调查研究，可
为其遗传资源保护提供科学依据。本研究通过西藏
藏猪 mtDNA D-loop 序列遗传多样性来揭示遗传资
源的保护必要性。在分析的 446 头西藏藏猪 mtDNA
D-loop 长度为 435 bp 的核苷酸序列中，不考虑插入、
缺失和 Poly（C）末端长度变异的条件下，共检测
到 20 个变异位点，占核苷酸总数的 4.60%，表明西
藏藏猪具有较低的遗传变异，其中，昌都藏猪碱基
变异位点数最多（16 个），日喀则最少（2 个），说
明昌都藏猪受选育程度和人工选择机率较其他 3 个
群体高，而日喀则藏猪可能由于地域差异、长期近
交使得基因群体内具有较高的遗传一致性，这与蔡
原等［7］研究一致。mtDNA 分子是由很不均一的片
段构成的，G+C 含量在 21%-50%，其中无脊椎动物
为 21%-43%，脊椎动物为 37%-50%［18］，本试验中
为 37.10%，略高于变化范围最低值。碱基组成分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.5228
表明，A+T 平均含量 62.90%，显著高于 G+C 含量
37.10%。其中，A+T 的含量可以反映出序列的变异性，
具有高比例的 A+T 可能是 D-loop 序列变异较快的原
因之一，同时也说明 mtDNA D-loop 高变区富含 A、
T，表现出很强的碱基偏倚性，这一结果与 mtDNA
D-loop 序列进行家禽［19，20］、羊［21，22］、牛［23，24］和
猪［25，26］等家养动物的研究结果一致。
3.2 西藏藏猪遗传多样性分布规律
单倍型多样度（Hd）和核苷酸多样度（Pi）是
衡量一个 mtDNA 变异程度的两个重要指标，Hd 值
和 Pi 值越大，多样性程度越高，遗传多样性越丰富，
反之，多样性程度越低，遗传多样性越贫乏。另外，
mtDNA 的单倍型多样性指数也可以衡量种内的变异
程度，它的含义类似于核 DNA 的杂合度［27］。据统
计同种动物的个体之间的平均核苷酸顺序奇异值在
0.3%-4.0%，有时甚至可高达 10%［28］。本研究的西
藏藏猪 4 个，总的单倍型数 20 个，单倍型多样度
（Hd±Sd）为 0.705±0.021，平均核苷酸差异数（k）
为 1.231，核苷酸多样度（Pi）为 0.002 83。研究结
果显示，昌都藏猪、山南藏猪单倍型多样度、平均
核苷酸差异数、核苷酸多样度均高于整体水平，而
林芝藏猪低于整体水平，日喀则藏猪明显低于整体
水平，并且依次降低，证明昌都和山南藏猪品种的
遗传变异程度较高，遗传基础比较广泛，具有丰富
的遗传多样性［29］，可能由于昌都藏猪的群体数量较
大且分布范围较广，而日喀则藏猪则局限在一个较
为封闭的环境中，与其它群体之间基因交流的机会
极少［30］。基于 mtDNA D-loop 序列对梅山猪、二花
脸、 苏 钟 猪 和 保 山 猪 遗 传 多 样 性 分 析 表 明， 其
Hd 和 Pi 值 分 别 为 0.784、0.400、0.838、0.883 和
0.005 6、0.000 9、0.004 7、0.003 9，表明二花脸的
多样性低于其他 3 个猪种［31］。采用相同的研究方法
研究表明合作、迪庆、甘孜、阿坝 4 个藏猪群体 Hd
分别为 0.963、0.930、0.303 和 0.830，Pi 分别为 0.008 2、
0.005 5、0.000 7 和 0.003 6［12］。本研究中，藏猪 Hd
和 Pi 分别为 0.705 和 0.002 83，与梅山猪、二花脸、
苏钟猪和保山猪及藏猪合作群体、迪庆群体和阿坝
群体相比，其遗传多样性仅高于二花脸猪和藏猪中
的甘孜群体，说明了西藏藏猪群体受人工选择的影
响小，长期自然条件产生的突变类型在该群体中得
到积累，但可能由于与外界交流少，群体内近亲高
度繁殖，使其遗传多样性比较有限［32］。同时，瓶颈
效应与人工选择共同导致了西藏藏猪等在内的中国
家猪遗传多样性的降低，特别是高强度选择猪种对
地方猪种的杂交产生的后果更为严重。对 26 个单倍
型进行区域分布研究发现，昌都藏猪单倍型多样度
最高，也高于西藏藏猪的整体水平，同时相对于其
它 3 个群体，单倍型数最多，也说明昌都藏猪的遗
传多样性最丰富。联合国粮农组织历年关于家养动
物报告中都涉及到有关遗传多样性调查的内容，不
断改进和完善保存理论和保存机制，不断加大各区
域保种项目的投资力度［33］，因此，在藏猪遗传资源
保护过程中应该遵循遗传多样性原则进行优先保护。
3.3 西藏藏猪系统发生关系
Hap1 和 Hap3 是 4 个群体的共享单倍型，说明
可能具有共同的两个母系起源。有研究表明，包括
藏猪在内的家猪来源于欧洲野猪和亚洲野猪［34-36］，
而且是多次驯化事件的结果［37］，就不同藏猪群体而
言存在着共同的母系起源，但在几千年的驯化中形
成了不同的进化分枝，由于生活环境差异各群体也
存在一定数量的特有单倍型，且频率差异较大［25］，
其中藏猪的进化分支有一定的地理特征，即群体特
异性，欧洲起源家猪与亚洲起源家猪及藏猪明显的
分为两个不同的进化枝，在藏猪群体中西藏藏猪与
甘孜猪处于同一个进化枝，而合作猪形成了一个相
对独立的进化分枝，阿坝猪在各个进化枝中都有出
现［12］，而西藏藏猪中除日喀则藏猪没有特有单倍型，
其它 3 个都存在特有单倍型，其中林芝藏猪特有单
倍型数最多（6 个），占单倍型总数的 23.08%，山南
藏猪特有单倍型最少（3 个）。可能由于日喀则藏猪
没有经过长期的自然选择和人工选择，受人工选育
的程度低，致使该群体没有形成各自独特的遗传结
构，其余 3 个群体虽然在遗传结构上有独特性，但
它们都属于一个地区，与日喀则藏猪群体有密切的
关系［38，39］。
4 结论
本研究对西藏藏猪 mtDNA D-loop 高变区特征、
遗传多样性分布规律和系统发生关系研究表明，昌
2015,31(5) 229郭永博等：西藏藏猪遗传多样性研究
都藏猪的遗传多样性最高，山南藏猪、林芝藏猪、
日喀则藏猪遗传多样性依次降低，说明昌都藏猪的
群体数量较大且分布的范围较广，而日喀则藏猪则
局限在一个较为封闭的环境中，群体间相距较远，
基因交流的机会较少，外界交流较少，群体内高度
近交繁殖，受人工选育程度低，但它们可能具有共
同两个母系起源，在遗传资源保护过程中应遵循遗
传多样性原则进行优先保护。
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（责任编辑 马鑫）