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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第5期
收稿日期 : 2012-01-13
基金项目 : 国家自然科学基金项目（30970287）, 山东省自然科学杰出青年基金资助项目（JQ200909）
作者简介 : 张敏 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 发育生物学 ; E-mail: zhangmin.8668@163.com
通讯作者 : 杨素欣 , 教授 , 研究方向 : 发育生物学 ; E-mail: suxinyang@yahoo.com.cn
一种安全高效大豆转化筛选体系的建立
张敏1 杨素欣1 邵群1 孙式静1 李祥2 冯献忠1
（1 山东师范大学生命科学学院 山东省高校系统生物学重点实验室，济南 250014 ；
2 山东农业大学生命科学学院 作物生物学国家重点实验室，泰安 271018）
摘 要： 以灭草烟作为筛选剂，利用基因枪法建立一种安全高效的大豆遗传转化体系。比较不同筛选剂对大豆胚尖外植体
丛生芽诱导数目的影响。与卡那霉素、潮霉素和草胺膦等传统筛选剂相比，以灭草烟作为筛选剂可使丛生芽的数目增加 1倍以上。
克隆了拟南芥突变体 csr1-2中突变的乙酰羟基酸合成酶基因（ahas），以其作为筛选标记基因，构建可利用灭草烟作为筛选剂的植
物表达载体。利用基因枪法将该载体转化大豆，获得 6棵灭草烟抗性植株，分子检测证明外源 ahas基因整合到 5棵转基因大豆植
株的基因组中。
关键词： 大豆转化 灭草烟 乙酰羟基酸合成酶基因 基因枪法
A High-efficient and Safe Selection System of Soybean
Transformation
Zhang Min1 Yang Suxin1 Shao Qun1 Sun Shijing1 Li Xiang2 Feng Xianzhong1
（1Key Laboratory of Systems Biology in Universities of Shandong，College of Life Sciences，Shandong Normal University，Jinan 250014；
2State Key Laboratory of Crop Biology，College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018）
Abstract: We used imazapyr as selection agent to establish a high-efficient and safe system of soybean transformation by biolistics. The
effects of different selection agents including imazapyr, hygromycin, kanamycin and glufosinate in soybean shoot induction were investigated. It
found that the number of multiple shoot increased twice using imazapyr compared with the other selection agents. The mutated acetohydroxyacid
synthase gene（ahas）from Arabidopsis mutant csr1-2 was cloned and utilized in constructing a binary vector with imidazolinone herbicide
resistance. We have successfully used this binary vector to transform soybean embryo tips via biolistics. Six resistant transformants were screened
with imazapyr after transformation, and five of them were proved to harbor foreign ahas gene by PCR and sequencing analysis.
Key words: Soybean transformation Imazapyr Acetohydroxyacid synthase gene Biolistics
大豆为人类提供了丰富的植物蛋白质和油
脂，已经成为世界上最重要的粮油作物之一。自从
Hinchee 和 McCabe 等［1, 2］首次报道大豆转化成功以
来，很多研究者相继研发了不同的大豆遗传转化方
法，但是受转化体系和受体系统的影响，大豆目前
仍然是一种低转化效率的作物。造成大豆转化率低
或得不到转化体的一个重要因素是筛选体系效率低
下，研发高效安全的大豆转基因筛选系统将是推动
大豆转基因技术广泛应用的一个关键。
乙酰羟基酸合成酶（Acetohydroxyacid synthase，
AHAS，EC 2.2.1.6）是催化植物体内支链氨基酸异
亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸合成起始步骤的关键酶［3］。
可以通过抑制 AHAS 酶阻断支链氨基酸的生物合成，
进而达到清除杂草的目的，该酶已经被作为磺酰脲
类、咪唑啉酮类、嘧啶水杨酸和磺酰胺类除草剂的
作用靶标而得到广泛的研究和利用。由于 AHAS 基
因保守区中某个位点的突变，可以使得 AHAS 分子
结构发生改变，导致靶标酶对 AHAS 抑制剂的敏感
2012年第5期 67张敏等 ：一种安全高效大豆转化筛选体系的建立
性降低，从而对相关除草剂产生抗性［4-6］。利用这
一现象将乙酰羟基酸合成酶突变基因（ahas）作为
抗除草剂靶基因的研究和利用，已经在包括大豆之
内的多种植物中获得成功［7-9］。
灭草烟（Imazapyr，2- （4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-
咪唑啉-2-基）烟酸）是一种咪唑啉酮类非选择性灭
生性除草剂，能迅速为植物的根、叶所吸收，通过
抑制乙酰羟基酸合成酶所催化的支链氨基酸的生物
合成而阻止植物生长。本研究利用拟南芥中突变的
ahas 基因可以产生对灭草烟不敏感这一特性，构建
以拟南芥中突变 ahas 基因为筛选标记的双元载体，
旨在建立一种高效的大豆转基因体系，同时检测利
用该选择标记体系是否可以显著增加大豆转化过程
中丛生芽的诱导数目，提高转化效率。
1 材料与方法
1.1 材料
供试大豆品种“菏豆 12”由山东省济宁市农业
科学院提供。拟南芥突变体 csr1-2购自 ABRC。载
体pCAMBIA1301购自Cambia公司。灭草烟、潮霉素、
草胺膦、卡那霉素购自 Sigma 公司。分子生物学试
剂购自 NEB 和 TaKaRa 公司。
1.2 方法
1.2.1 ahas 基因克隆与载体构建 CTAB 法提取拟
南芥突变体 csr1-2的基因组 DNA，分 3 段克隆其中
ahas 基因的 5.8 kb 基因片段，此区域包含 ahas 基因
的启动子和终止子的 DNA 序列。
所克隆的第一段 DNA 序列长 2.6 kb，所用 5端
引物为：5-AAAGTGCCACCAAGGCGACAG-3，3端
引物为 ：5-CGCCATGGTTCAGGAGAAAGATG-3；
第二段序列长度为 1.8 kb，所用 5端引物为 ：
5-TCTTTCTCCTGAACCATGGCG-3，3 端 引 物 为 ：
5-ATCCCCGAGAAATGTGTGAG-3；
第三段序列长度为 1.4 kb，所用 5端引物为 ：
5-GGGAAGATCGGTTCTACAAAGC-3，3端引物为：
5-TTCTCGAGGTTTCACATAAATGTCG-3。
用 XbaⅠ和 NcoⅠ酶切所扩增 ahas 基因第一段
序列的 PCR 产物， NcoⅠ和 SacⅠ酶切所扩增 ahas
基因第二段序列的 PCR 产物， SacⅠ和 XhoⅠ酶切
所扩增 ahas 基因第三段序列的 PCR 产物，1% 的琼
脂糖凝胶纯化酶切 PCR 产物，NanoDrop1000（Thermo
Scientific）测定纯化后酶切产物的量。XbaⅠ和
XhoⅠ双酶切 pCAMBIA1301 载体，0.8% 的琼脂糖
凝胶纯化酶切载体，同上测定纯化所获得载体量。
利用 T4 DNA 连接酶连接上述纯化的 4 个酶切片段，
将连接产物转化大肠杆菌 DH5α，对所获得的克隆
进行酶切和测序鉴定。提取经测序鉴定正确的单克
隆的质粒 DNA 用于后续基因枪转化试验。
1.2.2 种子消毒 选取表面光滑、无破损、无病斑、
无裂痕的“菏豆 12”成熟大豆种子，氯气方法灭菌
14 h［10］。将灭菌后的种子浸泡于无菌水中，室温暗
处理 16 h。
1.2.3 基因枪转化及组织培养 转化培养基 ：MS +
3% 蔗糖 + 0.8% 琼脂，pH5.7 ；诱导培养基 ：MS + 5
mg/L 6-BA + 3% 蔗糖 + 0.6% 琼脂，pH5.7；筛选培养
基 ：MS + 筛选剂 +3% 蔗糖 + 0.6% 的琼脂，pH5.7 ；
生根培养基 ：MS + 3% 蔗糖 + 0.6% 琼脂，pH5.7。
转化方法 ：在超净工作台上去掉大豆种皮，剥
离下胚轴和刚萌动的胚尖，去掉原基叶，将胚尖垂
直接种至转化培养基中进行基因枪转化。基因枪
方法采用 PDS 1000/He 型基因枪（Bio-Rad 公司），
参照 Elibio 等［8］的方法并有小的改进。金粉尺寸
为 0.6 μm，轰击时氦压力值为 1 100 psi，真空数
27 inHg，9 cm 轰击距离［11］。
基因枪轰击后，将外植体转移至诱导培养基中，
28℃，黑暗处理 16 h ；然后将外植体垂直接种至筛
选培养基中筛选，在 28℃，16 h 光照 /8 h 黑暗的光
周期，光照强度 50 μmol/（m2s）的条件下培养。每
两周更换一次筛选培养基，直至抗性苗伸长至 3 －
5 cm 后，移植于生根培养基中，14 d 后移栽到温室
中生长。
1.2.4 转基因植株的PCR检测 CTAB法提取转基因
植株叶片 DNA，以拟南芥 ahas 5.8 kb 基因片段内部
的 337 bp 特异 DNA 序列作为靶序列进行 PCR 检测。
5端引物为：5-CAATTCGTGGAACCAACTTGC-3，3
端引物为 ：5-CGCCATGGTTCAGGAGAAAGATG-3。
PCR 反应体系的体积为 25 μL，反应程序为 ：
94℃预变性 3 min ；94℃变性 30 s，54℃退火 30 s，
72℃延伸 30 s，循环 30 次 ；72℃延伸 10 min。PCR
产物经 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期68
2 结果
2.1 灭草烟筛选浓度的选择
将“菏豆12”胚尖外植体放置于含有5 mg/L 6-BA
的诱导培养基中，黑暗诱导 16 h 后，移植于含有不
同浓度灭草烟的筛选培养基中观察丛生芽的生长情
况（图 1），灭草烟的浓度分别为 0、50、100、150、
200 和 250 μg/L。每个浓度中接种 30 个外植体，每
两周更换一次培养基，50 d 后，测量丛生芽伸长的
长度。从图 1 可以看出，随着灭草烟浓度的增加，
丛生芽伸长的高度逐渐减小，到 200 μg/L 时，丛生
芽高度为 1.24 cm，其伸长受到明显的抑制，且叶片
细长卷曲呈针状，所以在含有 200 μg/L 灭草烟的筛
选培养基上，非转基因外植体的生长受到强烈抑制。
选择 200 μg/L 的灭草烟浓度作为后续试验中的筛选
浓度。
作为转基因大豆的筛选剂，可以有效地提高诱导胚
尖外植体的丛生芽数目。
图 1 灭草烟浓度对丛生芽长度的影响
2.2 筛选剂对大豆胚尖外植体丛生芽诱导数目的
影响
将在诱导培养基中处理 16 h 后的“菏豆 12”胚
尖外植体，分别放置于含有 200 μg/L 灭草烟、5 mg/L
潮霉素［11］、0.5 mg/L 草胺膦［12］及 50 mg/L 卡那霉
素［13］的 MS 培养基上（筛选剂浓度由文献所报道的
合适筛选浓度和预试验结果确定）。观察不同筛选剂
对大豆胚尖外植体丛生芽诱导数目的影响，每种筛
选剂处理 30 个外植体。生长 40 d 后，统计丛生芽
数目，丛生芽数目取 30 个样品的平均值，结果见图
2。从图 2 可以看出，在潮霉素、草胺膦及卡那霉素
筛选条件下，所诱导的大豆胚尖外植体丛生芽数目
分别为 2.9 个、3.0 个和 3.5 个，平均值均不足 4 个。
而在灭草烟筛选条件下，丛生芽数目平均值达到 8.4
个，是其他筛选剂的两倍以上。因此，使用灭草烟
图 2 筛选剂对丛生芽诱导数目的影响
筛选剂种类
2.3 灭草烟抗性转基因大豆的获得
2.3.1 ahas 基因的克隆与载体的构建 分 3 段克隆
拟南芥突变体 csr1-2的 5.8 kb ahas 基因片段：第一段
序列长 2.6 kb，第二段长 1.8 kb，第三段长 1.4 kb ；
分别利用限制性内切酶酶切这3个片段的PCR产物。
用 XbaⅠ和 XhoⅠ双酶切 pCAMBIA1301 载体，连
接以上 4 个片段构建成新载体（图 3-a）。
用 NcoⅠ单酶切鉴定所构建的载体，理论上
应获得 12 131 bp 和 3 267 bp 的条带 ；用 XbaⅠ和
XhoⅠ对该载体进行双酶切，理论上应获得 9 698 bp
和 5 700 bp 的条带，酶切结果与理论值相符合（图
3-b）。将此载体进行测序，测序结果与预期完全一致，
此载体命名为 pCAMBIA1301-ahas。
2.3.2 转基因株系的获得与分子鉴定 将pCAMBIA-
1301-ahas 载体用基因枪法转化 132 个大豆胚尖外
植体，经诱导培养基黑暗处理 16 h 后，移植于含有
200 μg/L 灭草烟的筛选培养基中，筛选 40 d。此时，
非转基因苗丛生芽的伸长受到明显抑制，且叶片细
长卷曲呈针状（图 4-a）。获得 6 棵丛生芽伸长较高
且叶片舒展的转基因苗（图 4-b）。将转基因苗中未
伸长的丛生芽去掉后，移植于生根培养基，培养 14 d；
将生根后的转基因植株（图 4-c）移于土中，温室内
培养。
取上述 6 棵 T0 代转基因株系的幼嫩叶片，提取
DNA，利用 PCR 检测拟南芥 ahas 基因是否整合入大
豆的基因组中。结果（图 5）显示，有 5 棵可以检
测到 337 bp 的条带，1 棵没有检测到目的条带，为
2012年第5期 69张敏等 ：一种安全高效大豆转化筛选体系的建立
状况相似，没有发生明显的变化，证明转入 ahas 基
因的植株对除草剂灭草烟的耐受程度显著增加。
提取上述 T1 代有抗性的转基因大豆的 DNA，
利用 PCR 检测到 ahas 基因 337 bp 的条带，进一步
证明拟南芥 ahas 基因确实整合入大豆的基因组中，
并可以提高其灭草烟的耐受性。1. wide range marker ；2-4. NcoⅠ单酶切 ；5-7. XbaⅠ和 XhoⅠ双酶切
图 3 pCAMBIA1301-ahas载体的表达框架（a）以及
pCAMBIA1301-ahas表达载体的酶切鉴定（b）
a. 筛选 40 d 的非转基因植株 ；b. 筛选 40 d 的转基因
植株 ；c. 在生根培养基上生长14 d 的转基因植株
图 4 转基因株系的筛选和生根
假阳性株系 ；作为阴性对照的“菏豆 12”野生型植
株及水也没有该条带扩增，进一步对 PCR 产物测序
证实，该产物是来源于拟南芥的 ahas 基因片段。
2.3.3 转基因后代的检测 为了检测转基因后代对
灭草烟的耐受程度，种植了 5 个阳性转基因大豆 T1
代种子各 10 粒，并在萌发后 4 d 喷洒 2 mg/L 的灭草
烟，3 周后观察到非转基因植株的叶脉和茎均出现
红褐色（图 6-b，图 6-d），且植株生长缓慢，新生叶
片呈嫩黄色。而转基因植株叶脉、茎均正常 （图 6-a，
图 6-c），植株整体与没有用灭草烟处理的个体生长
1. DL2000 DNA Marker ； 2. 野生型阴性对照 ； 3. 质粒阳性对照 ；
4-8. 转基因株系 ； 9. 假阳性转基因株系 ； 10. 水对照
图 5 转基因株系的 PCR检测
a. 转基因植株叶片 ；b. 野生型植株叶片 ；c. 转基因植株的茎 ；
d. 野生型植株的茎
图 6 喷施灭草烟后转基因后代的表型
3 讨论
与卡那霉素、潮霉素和草胺膦等目前使用较为
广泛的筛选剂不同，灭草烟是一种分生组织细胞特
异性除草剂，能够在植物全身进行转运，最终集中
于分生组织区域发挥作用，而此区域正是诱导外源
基因转入的受体基因族的场所［7］。灭草烟这种组织
特异性的作用方式，既增加了对转基因分生组织细
胞筛选的效率，同时又降低了对其他组织的非特异
性的抑制和伤害，因此可以大幅度提高大豆胚尖外
植体的丛生芽数目和转化效率。选择性的标记基因
ahas 最初是从拟南芥 csr突变体中分离得到的，在突
变基因的第 1 958 个碱基处发生突变，使得该位置
密码子编码的丝氨酸转变为天门冬氨酸，能引起植
株对咪唑酮类除草剂分子敏感性的降低，从而具有
了灭草烟抗性［14］。
转基因技术成败的关键之一就是转化过程中只
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期70
有少数植物细胞中的外源基因能够整合进植物基因
组中，而大多数细胞仍未被转化，必须通过筛选标
记基因来鉴定转化的植物细胞。新霉素磷酸转移酶
II（NPT II）、潮霉素磷酸转移酶（HPT）和草丁膦
N- 乙酰转移酶（PAT）基因是目前较为常用的几种
筛选标记基因［15-17］。虽然这些抗生素和除草剂等抗
性基因的使用方便了植物的转化，但许多人担心这
些来源于细菌或真菌的基因在转基因植物中的存在，
可能对生态环境和食品安全存在潜在威胁，而这种
担心和相关政策的限制已经阻碍了转基因植物的推
广和利用［18］。因此，开发和利用此类植物本身生物
合成基因作为筛选标记基因来提高转基因植物的安
全性，将是今后转基因技术发展的一个重要方向。
4 结论
本研究中构建了拟南芥 ahas 基因为选择标记基
因的双元表达载体。利用基因枪法将该载体转化大
豆，并以 200 μg/L 灭草烟作为筛选浓度，获得 5 棵
转基因植株，T1 代转基因植株对灭草烟的耐受程度
显著增加，证明拟南芥 ahas 基因整合入大豆的基因
组中可以提高转基因植物的灭草烟耐受性。
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（责任编辑 李楠）