全 文 ：·综述与专论· 2014年第11期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
近年来，随着后基因组学研究（如基因组简化
工程、反向代谢工程和合成生物学）的快速发展，
人们更加需要简单高效的遗传操作工具来对多基因
进行修饰以研究分子生物学机制。基因修饰系统中
常用的方法包括位点特异性重组（FRT/Flp、Cre/lox
等）［1，2］，嘌呤代谢基因或代谢途径中相关基因及
其他阻遏蛋白基因和启动子作为反向筛选标记的操
作方法［3-6］等。但位点特异性重组会在修饰的基因
处留有疤点（Scar），而以嘌呤代谢基因或代谢途径
中相关基因为反向筛选标记的方法需要在基因组上
缺失特定的基因才能发挥作用。mazF 基因作为反
向筛选标记在基因修饰系统中应用可以克服上述方
收稿日期 ：2014-03-27
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31200036，31370089），天津市科技支撑计划重点项目（12ZCZDSY12700，11ZCZDSY08500）
作者简介 ：石杨，男，硕士研究生，研究方向 ：枯草芽孢杆菌代谢途径的改造 ；E-mail ：yun1986feiyang@sina.com
通讯作者 ：张大伟，男，博士，研究员，研究方向 ：微生物代谢工程和芽孢杆菌表达系统 ；E-mail ：zhang_dw@tib.cas.cn
毒素蛋白基因 mazF 在基因修饰系统中的应用进展
石杨1，2  董会娜2  张大伟2
（1. 天津大学药物科学与技术学院，天津 300072 ；2. 中国科学院天津工业生物技术研究所，天津 300308）
摘 要 ： 毒素-抗毒素系统（Toxin-antitoxin system，TA 系统）存在于大部分细菌中。mazEF 是大肠杆菌中一种毒素-抗毒素
系统。毒素基因 mazF 编码的 MazF 毒素蛋白可以特异性地剪切自由 mRNA 的 ACA 序列，从而抑制蛋白合成、引起细胞生长停滞 ；
近些年，许多学者利用 mazF 基因作为反向筛选标记对不同种微生物建立了无标记或无痕的基因修饰系统，并实现了不同菌株的基
因组修饰。主要综述了大肠杆菌 mazF 基因作为反向筛选基因的应用原理及其在不同种类微生物的基因修饰系统中的应用进展，然
后对 mazF 基因及其他毒素基因在基因修饰系统中的应用进行了展望。
关键词 ： mazF 毒素蛋白基因 反向筛选标记 基因修饰方法
Application Progress of mazF Gene in Genetic Modification System
Shi Yang1，2 Dong Huina2 Zhang Dawei2
（1. School of Pharmaceutical Science and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072 ；2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，
Chinese Academy of Science，Tianjin 300308）
Abstract: Toxin-antitoxin system（TA）exists in most of the genetic material of bacteria. mazEF is a kind of toxin-antitoxin system in
E. coli. MazF encoded by mazF is an mRNA interferase that specifically cleaves free mRNAs at ACA sequences, resulting in inhibited protein
synthesis and cell growth arrest. Recently, some scholars have used mazF as a counter-selection marker in genetic modification systems, and
achieved modifications of the genome in various strains. In this article, the research advances of E. coli mazF used as counter-selection marker
in bacterial genetic modification were reviewed, followed by application of other toxin gene. Finally, perspective of the possible new pathways for
developing new genetic modification methods were addressed.
Key words: mazF Toxin gene Counter-selection marker Genetic modification method
法的缺点，因此，它作为新的分子改造工具，越来
越广泛地被用于多种微生物的遗传改造中。本文对
mazF 基因在基因修饰系统中的作用机理和应用进展
进行了综述，并对其应用进行了展望。
1 mazF 的作用机理
mazEF 是一类研究最为广泛，作用机理鉴定最
为清晰的毒素-抗毒素系统（TA 系统），Ⅱ类 TA 分
类系统根据同源性分为 6 个组，分别为 ：kid 家族
（kid/kis、toxiN、mazEF、ccdAB 和 ydcDE），relE 家
族（relBE、yoeB/yefM、mqsAR 和 parDE），doc 家族
（phD/doc），vapC 家 族（vapBC、fitAB），hipA 家 族
（hipAB、pezAT） 和 ξ 家 族（ξ/ε），mazEF 属 于 kid
2014年第11期 49石杨等：毒素蛋白基因 mazF在基因修饰系统中的应用进展
家族［7］。mazF 基因是 TA 系统 mazEF 的下游基因，
编码稳定的毒素蛋白。MazF 是一种不依赖于核糖体
的 mRNA 干扰酶（核糖核酸内切酶），能在特异的
序列位点切割单链的 mRNA，并且在大多数微生物
和一些古生菌种中具有保守性。大肠杆菌的 MazF 蛋
白最早被发现，随后学者们发现了一系列具有不同
mRNA 切割位点的 MazF 结构类似物和其他的 mRNA
干扰酶。目前，鉴定的 MazF 结构类似物能够特异性
的在 3 或 5 或 7 个碱基的特定序列处切割 mRNA［8］。
大肠杆菌的 MazF 能识别 ACA 序列并水解其第
一个 A 位点 5 或 3 端的磷酸二酯键，从而抑制被
剪切断裂的 mRNA 上核糖体的释放和蛋白的合成［9］。
此后，异常编码的多肽被释放，并被胞内蛋白酶降解，
继而造成细胞死亡。MazE 抗毒素蛋白形成特殊构象
后，能识别并结合 MazF 毒素蛋白而使 MazF 失去毒
性。相比 5 个碱基或 7 个碱基的特定序列，3 个碱
基的特定序列在基因中出现的概率更大。大肠杆菌
的 MazF 蛋白能够裂解几乎所有的 mRNA，但是仍然
有一些 mRNA 能够抵抗 MazF，这些 mRNA 或者不
含 ACA 序列或者其中的 ACA 序列被 mRNA 形成的
二级结构保护而避免被 MazF 切割［10］。
大肠杆菌的 MazF 蛋白的作用机理研究得最为
清楚，过表达或诱导表达 MazF 蛋白可以抑制蛋白
的合成进而导致细胞死亡，在其他种类的微生物中
mazF 亦能发挥毒性作用，从而在遗传修饰系统中被
用作能够致死的反向筛选标记。
2 mazF 在基因修饰系统中的应用
在宿主细胞中表达 MazF，不但能引起 E.coli 的
细胞程序性死亡，同样也可以引起其他原核生物，
如芽孢杆菌、梭杆菌和真核生物如毕赤酵母的程序
性死亡［11-13］。MazF 蛋白能在不同种类的微生物中
发挥作用的前提，是编码这些菌株生长和存活的必
须蛋白的 mRNA 上含有 ACA 序列。目前，mazF 基
因作为分子改造工具，在微生物的遗传改造中已有
广泛地应用。mazF 筛选盒（mazF-cassette）构成如
图 1 所示，共 3 部分，分别为 ：正向筛选基因（一
般为抗性基因）及其启动子（Selectable gene 和 P）；
毒素蛋白启动子的抑制蛋白基因 ；毒素蛋白基因和
常用诱导表达型启动子，如 Pspac和 Pxyl。此方法在不
同的微生物中应用时，需要把筛选盒中的正向筛选
基因和控制 mazF 表达的表达调控系统替换为在该
宿主菌种发挥作用的正向筛选基因和表达调控系统。
Selectable
gene
Repressor Pr mazFP
Selectable gene ：正向筛选基因 ；P ：抗性筛选基因启动子 ；Repressor ：mazF
启动子的抑制蛋白基因 ；Pr ：常用诱导表达型启动子，如 Pspac和 Pxyl
图 1 mazF 筛选盒示意图
2.1 mazF在芽孢杆菌属中的应用
2006 年，Zhang 等［14］首次用大肠杆菌（E.coli）
的 mazF 基因在芽孢杆菌属（Bacillus species）中建立
了一种普适无标记的基因修饰系统。在此基因修饰
系统中受异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的启动
子 Pspac、mazF 及奇霉素（Spectomycin）抗性基因一
起构成了 MazF 筛选盒（图 2-A），Pspac 受 IPTG 的诱
导而启动 mazF 的转录表达。其两侧是两个直接重
复序列（Directly-repeated，DR）。线性的质粒与基
因组发生双交换同源重组，mazF 表达盒被整合到基
因组的目的位点上。获得的重组菌菌株对 IPTG 敏感，
有奇霉素抗性。然后，两个 DR 片段发生单交换同
源重组，MazF 筛选盒被删除，重组后菌株对 IPTG
有抗性，对奇霉素敏感。此方法可以将需要的遗传
改变引入到基因组上而不引入任何筛选标记。
这种方法也有一定的缺陷 ：首先，这种基于克
隆基因修饰方法需要约 2 周时间 ；其次，在枯草芽
孢杆菌（B. subtilis）中［15］spac 表达系统诱导效率低，
在缺乏诱导物时会产生泄露表达［16-18］。mazF 显著
的泄露表达会造成自发突变的 MazF 抗性突变株累
积，降低分离筛选得到目的突变菌株的阳性率。
随后，Morimoto 等［19］将 IPTG 诱导的 Pspac 系统
与高保真融合 PCR 方法结合建立了一种新方法。他
们设计了与 mazF 筛选盒相结合的双交换序列和一个
用于删除筛选盒的单交换序列。这个方法成功地删
除了长度从 8.5 kb 到 128 kb 不等的序列。与 Zhang
等［14］的方法相比，这个操作过程可以在更短的时
间内完成。然而此法仍有其局限性，如少量的泄露
表达，4.0 kb PCR 融合片段会增加 DNA 突变的概率
而且不同的基因片段组装也有一定的难度。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期50
启动子 PxylA 受木糖阻遏蛋白 XylR 的抑制。当木
糖出现时，XylR 离开操纵子序列，PxylA 被激活。巨
大芽孢杆菌（B. megaterium）的 xyl 操纵子是一个特
别严谨的转录调控系统。Yu 等［20］把 mazF 基因放在
B. megaterium 的启动子 PxylA 之后，mazF 受木糖诱导
表达（图 2-B）。在 B. subtilis 基因组上引入突变的无
标记基因修饰方法。此方法中 mazF 基因受来自 B.
megaterium 的 xyl 表达系统的调控。因 B. megaterium
的 xyl 表达系统严格进行转录调控，且有更高的
诱导效率，相对于 spac 表达系统具有显著的优越
性［18，21］。但需要融合长约 3.9 kb 的片段和抗 mazF
的自发突变菌株的产生仍是这种方法的不足。
有文献报道 B. subtilis 的启动子 Pxyl 也具有严格
的转录调控［22，23］。而且 B. subtilis W23的启动子 P xyl
显示比 B. megaterium 的 Pxyl 启动子有更高的诱导 / 表
达效率（246-279 倍 /150-200 倍）［16，18］。Lin 等［24］
构建的“mini-mazF-cassette”筛选盒（图 2-C），其
包 含 B. subtilis 的 启 动 子 Pxyl，mazF 和 微 型 的 博 莱
霉素（Zeocin）抗性基因。用此筛选盒成功地敲除
了 amyE 基因、一个 90 kb 的基因簇和一个绿色荧光
蛋白基因。mini-mazF-cassette 可以重复的对多个基
因或基因簇进行操作，而且融合片段只有 2-2.5 kb，
这就可以减小 PCR 带来的核酸突变频率。Lin 的方
法比上述两种 mazF-cassettes 的转化效率高 3 倍，而
且所有克隆中有超过 95% 的菌株都能丢掉筛选盒，
而 Yu 的方法中只有 50%［20］。
本课题组在改造 B.subtilis 基因组时尝试应用
upp 基因（编码尿嘧啶磷酸核糖基转移酶，催化 5-
氟尿嘧啶生成 5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸而使菌体致
死）和 mazF 基因为反向筛选标记，初步结果表明
以 mazF 为反向筛选标记方法有阳性率更高的优势。
upp 基因作为反向筛选标记时需失活出发菌的 upp 基
因，使其能在含有 5-氟尿嘧啶的基本培养基上生长，
而 mazF 作为反向筛选标记时对出发菌的背景就无
要求（数据未发表），且试验周期相比较短。
2.2 mazF在毕赤酵母中的应用
Yang 等［12］用大肠杆菌的 mazF 作为反向筛选
基因在甲醇营养型酵母——毕赤酵母中建立了一种
无标记基因修饰方法。mazF 的表达受甲醇诱导型启
动子 PAOX1 控制，毕赤酵母中 MazF 被诱导表达后终
止细胞的生长。他们构建了一个模块化质粒，mazF
和博莱霉素抗性基因分别作为反向筛选标记和正向
筛选标记，其中的 mazF-ZeoR 表达框的两侧包含
CYCl TT 同向重复重组位点和多克隆位点（图 2-D）。
通过模块化质粒可以构建引入基因修饰的递送质粒。
将递送质粒线性化后转化毕赤酵母，通过同源重组
将基因修饰引入毕赤酵母基因组。用博莱霉素筛选
出基因改造的菌株，再用甲醇诱导表达 MazF，通
过 CYCl TT 同向重复重组位点之间同源重组实现遗
传标记的再利用。应用这种方法，研究者在不引入
筛选标记的情况下，实现了毕赤酵母 ARG1 和 MET2
基因的敲除，一个绿色荧光蛋白表达盒的敲入和
ARG1 基因的定点突变。这种方法可以使筛选标记基
因重复用于多个基因修饰。
2.3 mazF在梭菌属中的应用
梭菌属是产孢子的革兰氏阳性细菌，属于厚壁
菌门。这个属的成员是专性厌氧菌，包含许多有医
学和商业价值的重要菌株。但分离得到基于等位基
因交换产生的基因替换突变菌株仍然是这些重要菌
株应用的主要限制。
Dong 等［25］ 发 现 mazF 基 因 在 丙 酮 丁 醇 梭 菌
（Clostridium acetobutylicum） 中 也 可 发 挥 反 筛 选 作
用，此发现对丙酮丁醇梭菌的基因操作工具的开发
有一定的促进作用。mazF 基因的诱导表达可以用
于 ClosTron 系统中便携质粒的固化从而使基因失
活，或者用于同源重组基因敲除方法中快速筛选双
交换突变株［26］。Al-Hinai 等［27］报道了一种利用可
诱导的反向筛选标记的基因修饰方法，此方法无需
营养缺陷型突变株或者应用可移动的 II 类内含子，
就可快速高效的在基因组的任意位点实现无标记的
DNA 缺失和整合。这个方法中将来自大肠杆菌的
经密码子优化的 mazF 毒素基因放在来自产气荚膜
梭菌（Clostridium perfringens）的乳糖诱导型启动子
Pgal 之后。启动子 Pgal 控制 MazF 的表达，可在含乳
糖和抗生素的固体培养基上直接筛选出目的基因被
删除的突变株。进而作者又建立了一个可诱导可隔
离的不稳定质粒系统可以使编码硫霉素抗性的基因
快速缺失，即结合 FLP-FRT 位点特异性重组系统［28］
2014年第11期 51石杨等：毒素蛋白基因 mazF在基因修饰系统中的应用进展
（图 2-E），在质粒上下游同源臂内的抗性标记基因
两侧加上了 FRT 序列。重组完成后，通过在突变株
中表达 FLP 重组酶剔除抗性基因，以便该抗性基因
可被继续用作筛选标记。该方法既可实现基因敲除
亦可实现外源基因在染色体上的敲入。大多数梭菌
属菌种的基因组有相似的低 G+C 含量和类似的密
码子使用率，因此这个系统有可能应用到这些菌株
中。但该方法会在删除基因的位置留下一段 FRT 疤
痕（Scar），并未真正实现基因无痕删除。随着基因
敲除数量的增加，染色体上的 FRT 疤痕会随之增多，
当有 FLP 重组酶存在时，可能引起这些 FRT 短序列
之间的重组，从而造成非预期的基因序列缺失。故
在一定程度上限制了这种方法的应用。
2.4 mazF在蓝藻细菌中的应用
蓝藻菌集胞藻属是光合生物，能有效的集合光
能同时利用环境中的 CO2。集胞藻属有两个主要的
变种，一个变种（认为是野生型，WT）只能光合自
养生长，第二个变种（葡萄糖耐受型菌，GT）既可
光合自养也可进行光合异养生长。GT 型集胞藻属可
以利用来自枯草芽孢杆菌的 sacB 基因作为反向筛选
标记，但 WT 型不可以，因为 sacB 编码的果聚糖蔗
糖酶可将蔗糖转化为果聚糖将 WT 型细胞杀死。
Cheah 等［29］建立了一种新的可用于 GT 和 WT
型集胞藻属基因修饰方法。研究者用集胞藻属自有
的镍响应系统（nrs）来控制 mazF 的表达。此响应
系统在 Ni2+ 的浓度很低（约 0.5 μmol/L）时就可以被
诱导表达［30］。镍响应系统由 nrsBACD 操纵子和其上
游的两个基因 nrsR 和 nrsS 组成。nrsBACD 操纵子主
要将细胞质中额外的 Ni2+ 泵出，nrsS 和 nrsR 分别响
应 Ni2+ 和诱导启动子 PnrsB 启动转录
［31］。受 NrsR 诱
导的启动子 PnrsB 位于 nrsR 和 nrsBACD 操纵子的间
隔区。NrsR、NrsS 和启动子 PnrsB 被用来驱动 mazF
的表达。卡那霉素抗性基因（aphII）作为正筛选标
记放在 mazF 的下游，形成 mazF/aphII 筛选盒（图
2-F）。此方法中应用了两个质粒，一个含有筛选盒
和目的基因的上下游同源臂 ；另一个则只含有特定
基因的上下游同源臂。通过第一次同源重组，第一
个质粒与基因组发生基因交换将筛选盒整合到基因
组的特定位点，利用卡那霉素抗性筛选正确的菌株。
第二次同源重组是第二个质粒与第一步筛选到的菌
株的基因组进行基因交换，用 Ni2+ 筛选出弹掉筛选
盒的菌株。此方法成功的用于 slr1609 基因的部分敲
除和 PHB（聚-β-羟基丁酸）合成基因（slr1993 和
slr1994）的完全敲除，也可将其他基因整合入特定
的位点。此方法有可能应用于能进行同源重组的蓝
藻细菌和藻类等的基因修饰。
A
B
C
D
E
F
downDRspcPspacmazFLac IDRup
downDRspecRPPxyl mazFxylRDRup
downDRPxy1Pr mazFzeo
RDRup
CYC1TTPAOX1AOX1TT mazFzeo
RCYC1TT
downaph IInrsR-nrsSmazF PnrsBup
downFRT FRT mazFTHRup
up ：待敲除基因上游 ；DR ：直接重复序列 ；LacI ：Lac 阻遏子基因 ；mazF ：
MazF 毒素蛋白基因 ；Pspac ：乳糖诱导型启动子 ；spc ：奇霉素抗性基因 ；
down ：待敲除基因下游 ；xylR ：木糖阻遏子基因 ；Pxyl ：木糖诱导型启动子 ；
P 和 Pr ：抗性基因启动子 ；specR ：奇霉素抗性基因 ；zeoR ：博来霉素抗性
基因 ；CYCl TT ：CYCl TT 同向重复重组位点 ；PAOX1 ：甲醇诱导型启动子 ；
FRT ：FLP 识别位点 ；THR ：硫霉素抗性基因 ；PnrsB ：Ni
2+ 诱导型启动子 ；
nrsS-nrsR ：Ni2+ 响应序列 ；aphII ：卡那霉素抗性基因
图 2 mazF 筛选盒示意图［14，20，24，12，27，29］
3 其他毒素蛋白基因在基因修饰系统中的
应用
除了 mazEF 外，ccdAB 也是 II 类 TA 系统中研
究和应用较多的毒素-抗毒素系统之一。ccdAB 来自
于 F 质粒，最初用于大肠杆菌中筛选阳性转化子［32］。
CcdB 蛋白通过抑制拓扑异构酶 II 的一个亚基旋转酶
A 来杀死细胞，CcdA 蛋白可以解除 CcdB 蛋白的毒
性活性。商用系统 StabyCloningTM，StabyExpressTM 和
Delphi Genetics SA 都是基于 CcdB 蛋白的毒性作用
而使质粒稳定的保存。其应用方式有两种 ：一种是
将 ccdB 基因整合到质粒的多克隆位点。获得的质粒
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期52
在缺少 CcdA 蛋白的情况下，其毒性可以杀死细菌。
当在多克隆位点插入外源 DNA 片段后，ccdB 失活，
重组质粒不能产生 CcdB 蛋白，从而不会影响宿主
细胞的生存。这种用于重组克隆的正筛选方法非常
有效，并且简化了克隆程序。另一种是在基因组上
整合 ccdB 基因，当含有 ccdA 的目的质粒转入细胞
后，细胞生存，而未转入质粒的细胞则会因为 CcdB
蛋白的毒性作用而死亡。随后，研究者用来自质粒
R1 的毒素蛋白 Gabant［33］和质粒 RK2 的 ParE［34］研
发了相似的技术。
灿烂弧菌（Vibrio splendidus）是海水中一种具
有优势培养的弧菌，与一些海洋动物的死亡密切相
关。但是菌株中编码致病蛋白的基因却知之甚少。
牡 蛎 病 原 菌（V. splendidus）LGP32 菌 株 的 全 基 因
组测序为通过候选基因的破坏而解密毒性蛋白提供
了可能。Le 等［35］构建了一种新的自杀质粒，该质
粒包含依赖 pir 的 R6K 复制起始位点以及由启动子
PBAD 控制的来自质粒 F 的 ccdB 基因。其起始位点可
以通过基于 RP4 的接合作用转移到任何弧菌。该自
杀质粒通过两步等位基因替换作用可以将特定的基
因敲除。首先，等位基因两端的任何一端均可与基
因组发生等位交换，通过氯霉素筛选，选出正确整
合菌株。然后，用含阿拉伯糖的培养基进行第二步
筛选，只有菌株中带有 PBAD-ccdB 的质粒被重组掉后
才能够在含阿拉伯糖的培养基上生长。该方法可以
有效的在灿烂弧菌和霍乱弧菌（Vibrio cholerae）中
进行无痕等位基因替换。
ccdB 和 parE 基因等毒素基因在微生物筛选中开
发应用较早较多，但是其在微生物的基因修饰方面
应用却非常有限。这些毒素基因是非常有效的反向
筛选标记，若将其应用到基因修饰方面，相信会发
展出许多高效、准确的无标记基因修饰方法，丰富
分子操作工具，极大地提高遗传操作的速度和效率。
4 毒素蛋白基因作为反向筛选标记的基因修
饰策略
毒素蛋白基因（如 mazF、ccdB）作为反向筛选
基因应用于微生物基因修饰系统中是通过同源重组
实现的。基因修饰策略主要分两步进行，第一步将
整合片段插入到微生物的染色体上 ；第二步将筛选
标记剔除。整合片段可以以质粒形式通过单交换或
双交换同源重组整合到染色体上或者以融合 PCR 片
段形式通过双交换同源重组整合到染色体上。筛选
标记的剔除可以通过同源 DNA 片段或者直接重复片
段进行重组而实现。以敲除为例，图 3- 图 5 分别为
不同基因修饰策略的示意图。这些修饰策略实现了
无痕敲除和筛选盒的再利用，即可以进行特定基因
或大片段基因的敲除，亦可以进行基因点突变和相
关基因的敲入。对于不同的微生物菌种应选用合适
的策略。
毒素蛋白基因作为反向筛选基因应用于微生
物基因修饰系统应满足以下要求 ：（1）基因修饰系
统的目标菌株中编码其生长和存活的必须蛋白的
mRNA 应含有 ACA 序列，即保证 MazF 蛋白能够正
up
up
up
up down
Inducer
down
downup
down
down
P
P
down
downG
mazFPrrepressor
GmazFPrrepressor
Antibiotic
Selectable
gene
Selectable
gene
图 3 双交换，通过 down 片段同源重组实现的基因敲除
up down Pr mazF repressor
updown
downup
Se
le
ct
ab
le
g
en
e
Pr
m
az
F
ori
P
ge
ne
Se
lec
tab
le
ma
zF
Pr
P
up down
ori
Repressor
ori P Selectable
gene
up down
downup
gene
SelectablePorirepressormazFPrdown
down downup
up
up
Rep
ress
or
图 4 单交换，通过 up 或 down 片段实现的基因敲除
2014年第11期 53石杨等：毒素蛋白基因 mazF在基因修饰系统中的应用进展
常发挥作用 ；（2）目标菌种中有能够发挥作用的正
向筛选的抗性基因和可选用的诱导表达调控系统，
以便第一步的正向筛选和 mazF 的诱导表达。
5 结语
近年来，在分子操作工具研究方面取得了较大
进展，研究人员开发出了一系列用于基因中断、敲
除和敲入的新方法和新工具。mazF 作为反向筛选标
记不仅可用于操作手段成熟的菌株（如枯草芽孢杆
菌、毕赤酵母等），使其遗传操作更加快捷和精准，
而且也可用于操作手段不完善的菌株（如梭菌、蓝
藻等）的分子水平改造及遗传学方面的基础性研究。
mazF 等反向筛选标记的运用推进了微生物遗传操作
的发展。反向筛选能够导致整合了反向筛选基因的
微生物死亡。经过这样的处理，不仅筛选更为容易，
而且没有引入标记基因，这使得基因的连续操作成
为可能。基于以上分析，为了获得操作更简便，筛
选效率更高，通用性更强的基因修饰系统，可从几
方面进行升级和改进。第一，进一步优化现有的基
于毒素蛋白基因的遗传操作方法或结合其他的基因
修饰系统，降低假阳性出现的概率，提高筛选效率。
第二，开发其他 TA 系统中通用性更好的毒素蛋白
基因作为反向筛选标记，建立新的通用性更强的基
因修饰系统和方法。
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up DR P DR down
down
down
down
DR
mazFPrrepressorSelectable
gene
up
up
up down
Inducer
up
DR P mazFPrrepressor
Antibiotic
Selectable
gene
图 5 双交换，通过 DR 片段同源重组实现的基因敲除
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期54
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（责任编辑 狄艳红）